专利名称：反馈抗性乙酰羟酸合成酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及特定的核酸和由该核酸编码的多肽及其应用。本发明的多肽可以通过发酵改进支链氨基酸的生产。
具体地，本发明提供了用于编码乙酰羟酸合成酶(acetohydroxyacid synthetase，AHAS)的突变体的核苷酸序列、突变体酶以及在特定的宿主中使用这些酶发酵生产支链氨基酸，在所述宿主中表达编码修饰的乙酰羟酸合成酶(AHAS)的基因。
众所周知氨基酸可以通过棒状细菌菌株发酵来生产，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。由于此种生产方法具有重大意义，人们不断地进行研究以改进其生产方法。对该方法的改进涉及有关发酵技术的方法，例如搅拌和供氧，或者涉及营养培养基的组成，如发酵过程中的糖浓度，或者涉及产物的纯化，例如通过离子交换层析，或者涉及微生物本身的固有工作特性。
这些微生物的工作特性通过使用诱变、选择和突变体选择的方法得以改进。这样，得到的菌株对抗代谢物具有抗性，所述抗代谢物包括异亮氨酸类似物异亮氨酸氧肟酸盐(isoleucine hydroxyamate)(Kisumi M，Komatsubara S，Sugiura，M，Chibata I(1972)Journal ofBacteriology 110761-763)、缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸(Tsuchida T，Yoshinanga F，Kubota K，Momose H(1975)Agricultural and BiologicalChemistry，Japan 391319-1322)或亮氨酸类似物α-氨基丁酸盐(Ambe-Ono Y，Sato K，Totsuka K，Yoshihara Y，Nakamori S(1996)Bioscience Biotechnology Biochemistry 601386-1387)；或者菌株对具有重要调节功能的代谢物是营养缺陷型的，并且产生诸如支链氨基酸(Tsuchida T，Yoshinaga F，Kubota K，Momose H，Okumura S(1975)Agricultural and Biological Chemistry；Nakayama K，Kitada S，KinoshitaS(1961)Journal of General and Applied Microbiology，Japan 752-69；Nakayama K，Kitada S，Sato Z，Kinoshita(191)Journal of General andApplied Microbiology，Japan 741-51)。
近年来，重组DNA技术的方法也被用于合成支链氨基酸的棒状细菌菌株的菌株改良，主要通过扩增支链氨基酸的各个生物合成基因并研究对于支链氨基酸生产的影响来进行。Kinoshita(“Glutamic AcidBacteria”，inBiology of Industrial Microorganisms，Demain andSolomon(Eds.)，Benjamin Cummings，London，UK，1985，115-142)、Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))、Eggeling(Amino Acids 6261-272(1994))、Jetten和Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology 15，73-103(1995))、Sahm et al.(Annuals of the New York Academy ofScience 782，25-39(1996))及Eggeling等(Journal of Biotechnology 56168-180(1997))等作者都对此类研究作过综述。
支链氨基酸比如L-异亮氨酸、L-缬氨酸及L-亮氨酸在医药工业、人类医学和动物营养方面都有应用。细菌中合成所有三种氨基酸的一个关键酶就是乙酰羟酸合成酶(AHAS)。其催化两个反应，产生这三种氨基酸的前体。
在缬氨酸和亮氨酸的生物合成途径中，AHAS的底物是丙酮酸。AHAS催化丙酮酸脱羧并与另一个丙酮酸分子缩合产生乙酰乳酸。在异亮氨酸途径中，AHAS催化丙酮酸与2-酮丁酸反应，产生乙酰羟丁酸。在大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中存在多达三种AHAS同工酶。所述同工酶的活性被一组氨基酸抑制，其中缬氨酸的抑制最为强烈(De Felice，M.，Levinthal，M.，Iaccarino，M.，Guardiola，J.，1979.Growth inhibition as a consequence of antagonism between related aminoacidseffect of valine in Escherichia coli K12.Microbiol Rev 43，4258)。AHAS I由ilvBN基因编码，可被缬氨酸和异亮氨酸抑制；AHAS II由ilvGM编码，是缬氨酸抗性的；AHAS III由ilvIH编码，可被缬氨酸和异亮氨酸抑制。在所有情况下，该酶都由两个亚基组成。在AHASI和AHAS III中，抑制作用是由分别被ilvN和ilvH基因编码的小调节亚基所介导的。
与大肠杆菌不同，在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中，唯一的AHAS由ilvBN编码(Keilhauer，C.，Eggeling，L.，Sahm，H.，1993.Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicummolecular analysisof the ilvB-ilvN-ilvC operon.J.Bacteriol.175，5595-5603)。谷氨酸棒杆菌酶的活性也被缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸抑制(Eggeling，I.，Cordes，C.，Eggeling，L.，Sahm，H.，1987.Regulation of acetohydroxy acidsynthetase in Corynebacterium glutamicum during fermentation ofalfa-ketobutyrate to L-isoleucine.Appl Microbiol Biotechnol 25，346-351)。这三种氨基酸还通过转录弱化来调节ilvBNC基因簇的表达(Morbach，S.，Junger，C.，Sahm，H.，Eggeling，L.，2000.Attenuationcontrol of ilvBNC in Corynebacterium glutamicumevidence of leaderpeptide formation without the presence of a ribosome binding site.JBiosci Bioeng 90，501-507)。
在谷氨酸棒杆菌中，到目前为止，还没有报道在分子水平去调节(deregulating)AHAS活性的突变。
本发明的目的在于提供一种修饰的乙酰羟酸合成酶(AHAS)。具体地，本发明的AHAS更倾向于不被以上产生的几种氨基酸所抑制。
该目标权利要求书而实现。权利要求1涉及编码包括以上特征的多肽的特异核酸。权利要求2涉及该多肽本身。权利要求3和4揭示了包含本发明的核酸的宿主或用于通过PCR生产所述核酸的特异引物和探针。而权利要求5涉及生产本发明的进一步改进的多肽的方法，权利要求6请求保护因此生产出的多肽和核酸。权利要求7和8涉及特定用途，权利要求9涉及生产氨基酸的方法。权利要求10和11提供了特定的载体和微生物。
本发明提供了编码具有乙酰羟酸合成酶(AHAS)活性的多肽的核酸序列，其选自如下一组a)SEQ.ID No1或SEQ.ID No3的核酸序列；b)包含编码分别位于第21位和第22位的Asp和Phe的碱基三联体的核酸序列；c)在严格条件下，与a)或b)的序列杂交的核酸序列；d)与a)或b)的序列有至少70％同源性的核酸序列；e)在氨基酸水平，编码与a)或b)编码的多肽具有至少80％同源性的多肽的核酸；f)编码一种多肽的核酸，该多肽与a)或b)编码的多肽比较，具有改进的活性和/或选择性和/或稳定性，该核酸序列如下制备i)诱变a)或b)的核酸，ii)将由i)得到的核酸序列连接入合适的载体，再转化进合适的表达系统，及iii)表达并检测具有改进活性和/或选择性和/或稳定性的所需多肽；g)含有a)-f)的核酸序列的至少15个连续碱基的核酸序列。
以上所述以及现有技术中已知的一些技术障碍在本发明中被成功地克服。与野生型酶相比，本发明的核酸编码的多肽具有降低的氨基酸反馈抑制作用。
本发明的通过诱变方法改良核酸或由其编码的多肽的方法对于本领域技术人员而言熟知的。诱变的适当方法是为此目的本领域技术人员可以应用的所有方法。具体而言，这些方法包括饱和诱变、随机诱变、体外重组方法和定点诱变(Eigen，M.and Gardiner，W.，Evolutionary molecular engineering based on RNA replication，Pure Appl.Chem.1984，56，967-978；Chen，K.and Arnold，F.，Enzyme engineeringfor non-aqueous solventsrandom mutagenesis to enhance activity ofsubtilisin E in polar organic media.Bio/Technology 1991，9，1073-1077；Horwitz，M.and Loeb，L.，Promoters Selected From RandomDNA-Sequences，Proc Natl Acad Sci USA 83，1986，7405-7409；Dube，D.and L.Loeb，Mutants Generated By The Insertion Of RandomOligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene，Biochemistry 1989，28，5703-5707；Stemmer，P.C.，Rapid evolution of aprotein in vitro by DNA shuffling，Nature 1994，370，389-391 andStemmer，P.C.，DNA shuffling by random fragmentation and reassemblyIn vitro recombination for molecular evolution.Proc Natl Acad Sci USA91，1994，10747-10751)。
使用下述普通方法将得到的新的核酸序列克隆入宿主生物体中，并检测这样表达的多肽，然后通过合适的筛选方法分离。对于检测而言，针对此多肽所形成的分子的所有可能的检测反应都是基本适合的。具体而言，通过形成的化合物(如乙酰乳酸)或消耗的化合物的光度检测、HPLC或GC方法都可用于检测形成的氨基酸。此外，为检测通过遗传工程技术修饰的新多肽，还可使用凝胶电泳检测方法或使用抗体的检测方法。
如上所述，本发明还涵盖了能在严格条件下与本发明的单链核酸序列或与其互补的单链核酸序列杂交的核酸序列。
术语“在严格条件下”与Sambrook等(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)提到的一样。本发明所指的严格杂交优选是在1×SSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠，pH7.0)和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)中，在50℃，优选55℃，更优选62℃及最优选68℃下孵育一个小时后，及更优选与0.2×SSC和0.1％SDS在50℃，优选55℃，更优选62℃及最优选68℃下孵育一个小时后，仍然可以观察到阳性杂交信号。
本发明的第二个方面是选自以下一组的多肽a)权利要求1的核酸序列编码的多肽；b)具有SEQ.ID NO2或SEQ.ID NO4的序列的多肽；c)与具有SEQ.ID NO2或SEQ.ID NO4序列的多肽是至少84％同源性的多肽，且与SEQ.ID NO2或SEQ.ID NO4序列的多肽相比，该多肽的活性和/或选择性和/或稳定性基本没有降低；该多肽可以作为通过发酵生产支链氨基酸特别是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物途径中的修饰的AHAS酶。如上所述，这些酶具有更少的反馈抑制作用，因此可以在发酵肉汤中生产出更高浓度的氨基酸而不出现不利的抑制作用。
第三方面，本发明还涉及包含本发明的一或多个核酸序列的质粒、载体和微生物。合适的质粒或载体原则上是为此目的本领域技术人员可以获得的所有实施方案。这些类型的质粒和载体可见于以下参考文献，Studier等(Studier，W.F.；Rosenberg A.H.；Dunn J.J.；Dubendroff J.W.；，Use of the T7 RNA polymerase to direct expressionof cloned genes，Methods Enzymol.1990，185，61-89)或是Novagen，Promega，New England Biolabs，Clontech或Gibco BRL等公司的手册上。其他优选的质粒和载体还可见于Glover，D.M.(1985)，DNAcloninga practical approach，Vol.I-III，IRL Press Ltd.，Oxford；Rodriguez，R.L.and Denhardt，D.T(eds)(1988)，Vectorsa survey ofmolecular cloning vectors and their uses，179-204，Butterworth，Stoneham；Goeddel，D.V.，Systems for heterologous gene expression，Methods Enzymol.1990，185，3-7；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，2nded.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York。
图1和图2示出了质粒，使用其可以将含有本发明核酸的基因构建体以非常优选的方式克隆到宿主生物体内。
此外，本发明还提供了含有一或多个本发明核酸序列的微生物。
微生物可以用来扩增并获得足够量的重组酶，其中含有本发明核酸序列的质粒被克隆进所述微生物中。用于这个目的的方法是本领域技术人员熟知的(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，2nded.，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)。可能提及的微生物原则上是本领域技术人员已知的、适用于此目的的所有生物体，例如酵母，如多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤氏酵母(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，原核生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或真核生物，如哺乳动物细胞、昆虫细胞。优选用于这个目的的是大肠杆菌菌株。尤其非常优选以下的E.coli XL1Blue、NM 522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP 10或HB101。上文提到了这样的质粒，使用这些质粒优选地将含有本发明核酸的基因构建体克隆进宿主细胞中。
本发明提供的优选微生物可以以葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或甘油和乙醇来生产支链氨基酸。所述微生物可以包括棒状细菌的代表，尤其是棒状杆菌属(Corynebacterium)。特别提及的是棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌，本领域已知其生产富含对映异构体的氨基酸优选L-氨基酸的能力。
合适的棒杆菌属菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌，特别是以下已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067
乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和Brevibacterium divaricatum ATCC 14020以及由其产生的生产支链氨基酸的突变体或菌株，例如生产异亮氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 14309谷氨酸棒杆菌ATCC 14310谷氨酸棒杆菌ATCC 14311谷氨酸棒杆菌ATCC 15168产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC 6871，例如生产亮氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 21885黄色短杆菌ATCC 21889或者生产缬氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌DSM 12455谷氨酸棒杆菌FERM-P 9325乳糖发酵短杆菌FERM-P 9324乳糖发酵短杆菌FERM-BP 1763。
本发明的核酸序列可以在适当的宿主中被过表达。过表达可以通过增加相应基因的拷贝数或者突变位于结构基因上游的启动子和调节区域或核糖体结合位点来实现。在结构基因上游掺入的表达盒也可通过类似方式起作用。此外，还可通过诱导型启动子在发酵生产支链氨基酸的过程中提高表达。还可以通过延长mRNA的生存期的方法来提高表达。而且可以通过阻止酶蛋白降解来增加酶活性。基因或基因构建体可以以不同的拷贝数存在于质粒中或者整合入染色体而被扩增。或者，还可以通过修饰营养培养基的组成和培养条件来过表达所需的基因。对此的进一步指导参见US09/471803或其等同申请DE19951708。
本发明的另一个内容是用于通过PCR制备本发明核酸序列的引物或者用于检测本发明核酸序列的杂交探针。本发明的核酸序列适用于作为RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码AHAS蛋白的全长cDNA和分离其序列与本发明的序列有高水平相似性的cDNA或基因。
本发明的核酸序列还适用于作为引物，使用其，通过各种类型的聚合酶链反应(PCR)来产生编码AHAS蛋白的DNA或基因。也包括编码相应氨基酸序列的有义和反义引物，或互补DNA序列。适当的引物可以原则上通过本领域技术人员已知的方法获得。本发明的引物设计通过与已知DNA序列进行对比或是通过将检测到的氨基酸序列通过阅读而翻译为特定生物体的偏好密码子来进行(例如对链霉菌而言Wright F.and Bibb M.J.(1992)，Codon usage in the G+C-richStreptomyces genome，Gene 113，55-65)。这方面还可以应用所谓超家族蛋白质氨基酸序列的共有特征(Firestine，S.M.；Nixon，A.E.；Benkovic，S.J.(1996)，Threading your way to protein function，Chem.Biol.3，779-783)。这方面进一步的信息可以在以下一些文献中找到Gait，M.J.(1984)，Oligonucleotide synthesisa practical approach，IRLPress Ltd.，Oxford；Innis，M.A.；Gelfound，D.H.；Sninsky，J.J.andWhite，T.J.(1990)，PCR ProtocolsA guide to methods and applications，Academic Press Inc.，San Diego。非常优选以下引物MILVNH5′GCGGAGGAAGTACTGCC 3′SEQ.ID NO5MILVND5′CAATCAGATTAATTGCTGTTTA 3′SEQ.ID NO6ILVM15′GGACGTAGACGG(A)TGACA(T)TTTCCCGCG 3′SEQ.ID NO7MISBGL5′GTTTAGAACTTGGCCGGAG 3′SEQ.ID NO8
SILVNH5′GATCCTGCCGACATTCACGA 3′SEQ.ID NO9这些作为探针或引物的核酸序列具有至少30，优选至少20，更特别优选至少15个连续的与本发明的核酸一致的核酸。具有至少40或50个碱基对长度的核酸序列也是适用的。
本发明的另一个实施方案涉及从本发明的核酸序列开始，制备具有乙酰羟酸合成酶(AHAS)活性的改良重组多肽(rec-polypeptide)的方法，其特征在于a)将核酸序列进行诱变，b)将由a)得到的核酸序列克隆入合适的载体并将其转移入合适的表达系统，及c)检测和分离形成的、具有改良的活性和/或选择性和/或稳定性的多肽。
本发明还提供了可通过例如上述方法得到的重组多肽或编码此重组多肽的核酸序列。
在宿主中生产改良的重组多肽并表达其所需的核酸序列的制备在上面已经提到，此处同样适用。
本发明的多肽和改良的重组多肽优选用于制备富含对映异构体的支链氨基酸，更优选缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
此外，核酸序列和改良的核酸序列优先用来制备生产支链氨基酸的微生物体。
本发明的另一个方面涉及利用本发明的多肽生产支链氨基酸的方法。
而且，本发明应用了载体pECKA(图1)和pECKA/ilvBNC(图2)。本发明还涉及修饰的微生物，如DSM15652、DSM15651或DSM15650。这些菌株根据布达佩斯条约于2003年6月4日保藏在在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。
为克隆在ilvN基因中含有突变的ilvBNC操纵子，构建了大肠杆菌(Escherichia coli)-谷氨酸棒杆菌穿梭载体。首先，从pK19载体中去掉了限制性酶BglII的识别位点。然后，在pK19的NheI位点克隆入了来自乳糖发酵短杆菌的pBL1质粒的HindIII/HindII片段(2.7kb)。得到的质粒载体pECKA(5.4kb)在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制，具有7个独特的克隆位点、卡那霉素抗性标记和用于在大肠杆菌中克隆用的β-半乳糖苷酶的α互补。将带有ilvBNC操纵子的染色体片段SspI/EcoRI(5.7kb)(具有SspI+BamHI末段)克隆入用HindII+BamHI消化的pECKA载体，产生pECKAilvBNC(11.1kb)。
将ilvBNC操纵子的天然ScaI/BglII片段(770bp)与定点诱变构建的含有3-5个碱基改变的相应片段交换。定点诱变的靶位点是由N末段附近的ilvN编码的调节亚基的保守结构域。按照大肠杆菌和肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)AHAS突变体的序列，通过PCR进行诱变。通过测序检测突变。
从大肠杆菌中分离质粒DNA，用质粒pECKAilvBNC(WT)、pECKAilvBNC(M8)和pECKAilvBNC(M13)转化菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032ΔilvN。实验表明AHAS受支链氨基酸的抑制被降低。
“分离的”是指从其自然环境中被分离出来。
本发明中所指的光学富集的(对映异构体富集的，富含对映异构体的)化合物是指化合物的一种旋光对映体在其与另一旋光对映体的混合物中占＞50mol％。
术语核酸序列包括所有类型的单链和双链DNA和RNA及其混合物。
本发明中活性和/或选择性和/或稳定性的改良是指该多肽在反应条件下更具活性和/和更具选择性和/或更具稳定性。尽管工业用的酶活性和稳定性都应该尽可能地高，但是对于选择性而言，改良是指底物选择性降低，或是酶的对映选择性(enantioselectivity)增加。对于本文中所用术语“基本上不降低的表达”，适用于已作必要的修正的相同的定义。
本发明请求保护的蛋白序列和核酸序列还包括与本发明的序列具有大于91％、优选大于92％、93％或94％，更优选大于95％或96％，及特别优选大于97％、98％或99％的同源性(不包括自然简并)的那些序列，条件是这些序列的功能或目的被保留。术语“同源性”(或相同性)在此处可用以下等式限定H(％)＝[1-V/X]×100，其中H指同源性，X指对比序列中核碱基(nucleobase)/氨基酸的总数，V是指与参比序列相比，被研究序列中不同的核碱基/氨基酸的数目。在任何情况下，依照遗传密码的简并性，编码多肽的术语核酸序列包括所有可能的序列。
本文中提及的参考文献认为包括在本发明公开中。
实施例1.质粒载体pECKA的构建为了克隆和过表达含有ilvN基因突变的谷氨酸棒杆菌ilvBNC操纵子，构建了在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制的穿梭载体。首先，从pK19载体中去掉了限制性酶BglII的识别位点(Pridmore，R.D.，1987.New and versatile cloning vectors with kanamycin-resistancemarker.Gene 56，309-312)。用BglII消化pK19，用Klenow酶将消化产物粘端变平，再连接。连接之后，用连接混合物转化大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(20mg/l)的琼脂平板上选择含有所得到的pK19B质粒的转化体。通过用BglII处理分离的质粒分子，证实pK19B中BglII位点的去除。(这样的去除允许之后将携带ilvN基因的片段亚克隆入新构建的载体pECKA中。)接下来，将来自乳糖发酵短杆菌的质粒pBL1的HindIII/HindII片段(2.7kb)用Klenow酶填平粘端，再克隆入pK19B的NheI平端位点。这样得到的质粒载体pECKA(5.4kb)在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制，有7个独特的克隆位点(HindII、SalI、BamHI、SmaI、AvaI、KpnI、SacI)、卡那霉素抗性标记和用于在大肠杆菌中克隆用的β-半乳糖苷酶的α互补。图1显示的是该质粒载体的限制性图谱和遗传图谱。
2.将ilvBNC操纵子克隆入pECKA载体通过用限制性酶SspI和BamHI消化质粒pKK5得到携带ilvBNC操纵子的、谷氨酸棒杆菌染色体的5.7kb的片段(Keilhauer，C.，Eggeling，L.，Sahm，H.，1993.Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicummolecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon.J.Bacteriol.175，5595-5603)。将该片段与pECKA载体的HindII+BamHI的消化产物连接，将连接产物用来转化大肠杆菌DH5α。在含有卡那霉素(30mg/l)的琼脂平板上选择转化体。得到的质粒pECKAilvBNC(11.1kb)的结构通过限制性分析得到确认。质粒pECKAilvBNC的限制性图谱和遗传图谱见图2。
3.设计用于诱变ilvN基因的寡核苷酸引物谷氨酸棒杆菌的ilvN基因编码的AHAS的调节亚基的已知氨基酸序列(GenBank登录号L09232)与来自肉桂链霉菌(GenBank登录号AF175526)和大肠杆菌(GenBank登录号AE016769，完整基因组的section 15)的AHAS的调节亚基的已知氨基酸序列进行了比对。有文献对大肠杆菌和肉桂链霉菌的一些导致对缬氨酸抗性的突变进行了描述(Vyazmensky，M.，Sella，C.，Barak，Z.，Chipman，D.M.，1996.Isolation and characterization of subunits of acetohydroxy acid synthaseisozyme III and reconstitution of the holoenzyme.Biochemistry 35，10339-10346； J.，Janata，J.， S.，Felsberg，J.， J.，1999.Mutations in two distinct regions of acetolactate synthaseregulatory subunit from Streptomyces cinnamonensis result in the lack ofsensitivity to end-product inhibition.Biochem Biophys Res Commun 266，162-166)。在某些展示这种表型的菌株中，在大肠杆菌和肉桂链霉菌中在所述蛋白N端附近的部分保守结构域中，在第20位(大肠杆菌的序列编号)将氨基酸甘氨酸变成天冬酰氨的突变谷氨酸棒杆菌(SEQ.ID NO10)MANSDVTRHILSVLVQDVDGIISRVSGMFTRRAFNLVSLVSAKTETHGINRITVVVD肉桂链霉菌(SEQ.ID NO11)MS----TKHTLSVLVENKPGVLARITALFSRRGFNIDSLAVGVTEHPDISRITIVVN大肠杆菌(SEQ.ID NO12)MQNTTHDNVILELTVRNHPGVMTHVCGLFARRAFNVEGILCLPIQDSDKSHIWLLVN我们设计了一个用于定点诱变谷氨酸棒杆菌ilvN基因的简并寡核苷酸引物ILVNM1(SEQ.ID NO7)。该引物可在相应于谷氨酸棒杆菌AHAS调节亚基第20-22位的甘氨酸、异亮氨酸和异亮氨酸的核苷酸三联体的位置在ilvN基因中引入突变引物ILVNM1(SEQ.ID NO7)17 18 19 20 21 22 23 245′G GAC GTA GAC GGT GAC ATT TCC CGC G 3′A T与野生型序列相比，被改变的核苷酸在上图中以粗体标出。此处有两个简并位点，位于三联体20和22中(分别是G或A以及A或T)。
4.ilvN基因的定点诱变谷氨酸棒杆菌ilvBNC操纵子的天然ScaI/BglII片段(770bp)的定点诱变是使用PCR反应和4个寡核苷酸引物进行的(Ito，W.，Ishiguro，H.，Kurosawa，Y.，1991.A general method for introducing aseries of mutations into cloned DNA using the polymerase chain reaction.Gene 102，67-70)。
使用的引物如下MILVNH 5′GCGGAGGAAGTACTGCC 3′(SEQ.ID NO6)MILVND 5′CAATCAGATTAATTGCTGTTTA 3′(SEQ.ID NO7)ILVM1 5′GGACGTAGACGGTGACATTTCCCGCG 3′(SEQ.ID NO8)ATMISBGL 5′GTTTAGAACTTGGCCGGAG 3′(SEQ.ID NO9)第一轮PCR用MILVNH和MISBGL引物扩增具有改变的天然BglII位点的片段A(786bp)。用ILVM1和MILVND引物扩增在ilvN基因内具有突变的片段B(491bp)。质粒pECKAilvBNC被用作模板。得到的DNA片段在琼脂糖凝胶中分离，再通过沉淀分离纯化。
第二轮PCR用MILVNH-MILVND引物和模板片段A+B(以1∶1摩尔比混和)，扩增在BglII位点具有突变的片段C(803bp)和在ilvN基因上具有突变的片段D(803bp)。此混合物用ScaI和BglII消化，得到的片段从琼脂糖凝胶中分离。质粒pECKAilvBNC用同样的酶进行消化，得到766bp和10334bp的片段，其中大片段也从凝胶中分离。将分离的片段混和并连接。连接产物用来转化大肠杆菌DH5α细胞，并在具有卡那霉素(30mg/l)的平板上选择转化体。这样，质粒pECKAilvBNC中的天然ScaI/BclII染色体片段(766bp)就被ilvN可能含有3到5个改变的核苷酸的相应片段替换了。
5.ilvN突变体的测序分离获得的大肠杆菌DH5α克隆的质粒DNA，并用SILVNH引物和自动测序仪Vistra(Amersham)进行测序。
SILVNH引物5′GATCCTGCCGACATTCACGA 3′(SEQ.ID NO9)在三联体20至三联体22有2个不同序列的克隆被分离出来
得到的ilvN基因突变的克隆
突变体M8和M13的完整的ilvN序列分别示于Seq.3和1中。
6.谷氨酸棒杆菌的转化从大肠杆菌中分离质粒DNA，使用电穿孔法用质粒pECKAilvBNC(WT)、pECKAilvBNC(M8)和pECKAilvBNC(M13)来转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032ΔilvN(Liebl，W.，Bayerl，A.，Schein，B.，Stillner，U.，Schleifer，K.H.，1989.High efficiency electroporation ofintact Corynebacterium glutamicum cells.FEMS Microbiol.Lett.53，299-303)。转化体在具有卡那霉素(30mg/l)的平板上选择。
7.测定AHAS活性及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸对其的抑制带有质粒pECKAilvBNC(WT)、pECKAilvBNC(M8)和pECKAilvBNC(M13)的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032ΔilvN被用来测定AHAS的活性。细胞在基本培养基CGXII中培养过夜，离心收集，超声破碎。离心(16000xg，30min)后，在无细胞提取物中测定AHAS活性。分光光度酶分析间接检测反应产物乙酰乳酸(Singh，B.K.，Stidham，M.A.，Shaner，D.L.，1988.Assay of acetohydroxyacid synthase.Anal Biochem 171，173-179)。此分析涉及将终产物乙酰乳酸转化为3-羟基丁酮，再通过肌酸和萘酚复合物的形成来检测3-羟基丁酮。
表1显示的是酶活性检测的结果。为检测酶活性被缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的抑制，这三种氨基酸(10mM)被分别加入反应混合物中。结果分别显示在表2和表3中。
表1.AHAS活性
表2.AHAS活性的抑制
表3.AHAS活性被抑制的百分比
序列表<110>德古萨股份公司<120>反馈抗性乙酰羟酸合成酶突变体<130>020191AM<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>519<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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1.分离的核酸序列，其编码具有乙酰羟酸合成酶(AHAS)活性的多肽，所述核酸序列选自以下一组a)SEQ.ID No1或SEQ.ID No3的核酸序列；b)包含编码分别位于第21位和第22位的Asp和Phe的碱基三联体的核酸序列；c)在严格条件下与a)或b)的序列杂交的核酸序列；d)与a)或b)的序列具有至少70％的同源性的核酸序列；e)编码与a)或b)的序列所编码的多肽在氨基酸水平上具有至少80％同源性的多肽的核酸；f)编码与a)或b)的序列所编码的多肽相比具有改良的活性和/或选择性和/或稳定性的多肽的核酸，该核酸如下制备i)诱变a)或b)的核酸，ii)将可由i)得到的核酸序列连接入合适的载体，再转化入合适的表达系统，及iii)表达并检测具有改良的活性和/或选择性和/或稳定性的所需多肽；g)含有a)-f)的核苷酸序列中的至少15个连续碱基的多核苷酸。
2.一种多肽，选自以下一组a)权利要求1的核酸序列编码的多肽；b)具有SEQ.ID NO2或SEQ.ID NO4的序列的多肽；c)与具有SEQ.ID NO2或SEQ.ID NO4的多肽具有至少84％同源性的多肽，且所述多肽的活性和/或选择性和/或稳定性与具有SEQ.ID NO2或SEQ.ID NO4的多肽相比没有明显降低。
3.包括权利要求1的一或多种核酸序列的质粒、载体、微生物。
4.用于通过PCR制备权利要求1的核酸序列的引物或用于检测权利要求1的核酸序列的杂交探针。
5.从权利要求1的核酸序列制备具有乙酰羟酸合成酶(AHAS)活性的改良重组多肽的方法，其特征在于a)将所述核酸序列进行诱变，b)将可由a)得到的核酸序列克隆入合适的载体并将其转移入合适的表达系统，及c)检测和分离形成的具有改良的活性和/或选择性和/或稳定性的多肽。
6.根据权利要求5获得的重组多肽或编码此多肽的核酸序列。
7.权利要求2或6的多肽在制备富含对映异构体的支链氨基酸中的应用。
8.权利要求1或6的核酸序列在制备生产氨基酸的微生物中的应用。
9.使用权利要求2的多肽生产支链氨基酸的方法。
10.载体pECKA或pECKA/ilvBNC。
11.微生物DSM15652、DSM15651、DSM15650。
全文摘要
本发明提供了编码乙酰羟酸合成酶(AHAS)突变体的核苷酸序列，所述突变的酶及使用这些酶在特定的宿主中发酵生产支链氨基酸的方法，其中在宿主中表达编码修饰的乙酰羟酸合成酶(AHAS)的基因。
文档编号C12Q1/68GK1813065SQ200480017927
公开日2006年8月2日 申请日期2004年6月8日 优先权日2003年6月26日
发明者米罗斯拉夫·帕特克, 维罗尼卡·埃利沙科娃 申请人:德古萨股份公司