混合性玉米黄质酯浓缩物以及其应用的制作方法

专利名称：混合性玉米黄质酯浓缩物以及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及混合性玉米黄质酯。本发明更特别地涉及浓缩物形式的混合性玉米黄质酯和可以由这样的浓缩物制得的产品、以及混合性玉米黄质酯的一些应用。
背景技术：
类胡萝卜素一直以来都被描述为天然抗氧剂，已知其可以在自由基攻击健康细胞前猝灭自由基。更具体地讲，抗氧剂是一种能显著降低反应性物种，例如活性氧和活性氮类物种，对正常生理功能不利作用的物质。在生物学系统中会产生一些高氧化性物种，包括单线态氧、羟基自由基、超氧化物、过氧化氢、有机过氧化物和过氧化氢自由基。这些物种可以通过三种明显不同的途径与类胡萝卜素发生反应电子转移、夺取氢、和自由基加成[见Krinsky等人，Annual Rev.Nutr.，23171-201(2003)。]已经证明类胡萝卜素(一般和特殊的类胡萝卜素如番茄红素、叶黄素和玉米黄质)可以用作为抗氧剂，并以可施用的组合物形式提供对抗自由基对健康有害作用的有益保护作用。该类益处包括保护机体不遭受皮肤、眼睛、肝、和肺的损害、和不出现某些形式的癌。自由基是在代谢期间和由于接触源自环境因素如空气污染、香烟烟雾、日光、以及饮食脂肪而在机体内形成的不稳定化学类物质。当在机体内有过量的自由基时，自由基可以攻击健康细胞并且可造成许多变性疾病，如癌症和胶原的交联。
已经将自由基与许多疾病和健康状况相联系。与自由基有关并影响许多器官的状况包括炎性-免疫性损伤；酒精损害；放射损伤；老化(过早老化病症、与年龄有关的免疫缺陷)；和癌症。涉及特定器官或组织并且与自由基有关的状况包括类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、老年痴呆、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病(MPTP)、肌肉硬化、白内障形成(cataractogenisis)、变性性视网膜损害、和太阳辐射。
玉米黄质已经被确定为视网膜的黄斑色素，并且具有保护视网膜不受光诱导的损害影响的功能作用。Bernstein等人，Exp.Eye Res.，72(3)215-223(2001)从一些眼部组织[视网膜色素上皮细胞/脉络膜(RPE/脉络膜)、黄斑、周边视网膜、睫状体、虹膜、晶状体、玻璃体、角膜、和巩膜]中提取到了类胡萝卜素，并用高效液相色谱(HPLC)进行分析。除玻璃体、角膜、和巩膜外，几乎所检查的所有眼部结构都具有可计量水平的饮食性(3R，3′R，6′R)-叶黄素、玉米黄质、其几何(E/Z)异构体、以及其代谢物、(3R，3′S，6′R)-叶黄素(3′-表叶黄素(epilutein))和3-羟基-β，ε-胡萝卜-3′-酮。眼色素层的结构(虹膜、睫状体、和RPE/脉络膜)占眼睛中类胡萝卜素总量的大约50％和叶黄素和玉米黄质的约30％。
黄斑色素中主要的类胡萝卜素是叶黄素、玉米黄质、和中-玉米黄质(meso-zeaxanthin)。这些类胡萝卜素在人类黄斑中的规则分布模式表明在这种组织中可以主动控制其沉积。黄斑类胡萝卜素水平增加是由于人类补充叶黄素和玉米黄质所导致的。[见Landrum等人，Arch.Biochem.Biophys.，385(1)28-40(2001)。]已经表明在成人视网膜，特别是黄斑(负责精细的视觉活动的视网膜区域)中，由黄斑提取的玉米黄质是由相似数量的(3R，3′R)和(3R，3′S)立体异构体以及少量(3S，3′S)-玉米黄质立体异构体所组成。已经提出饮食性叶黄素和玉米黄质以在血清中发现的相同比例被转运到个体的视网膜中，虽然在眼睛中这两种色素的比率与血中发现的不同。[见Bone等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，342033-2040(1993)和Bone等人，Exp.Eye Res.，64(2)211-218(1997)。]这样，在中央凹区中，玉米黄质的数量高于叶黄素，二者的比例高于2∶1，在黄斑色素光密度下落100系数时，玉米黄质与叶黄素的比例被逆转至约1∶2。[见Bone等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，29843-849(1988)。]已经提出，一些叶黄素主要通过一种在婴儿体内的发生率低于成人体内发生率的机理在黄斑中被转化成非饮食性的中-玉米黄质。[见Bone等人，Exp.Eye Res.，64(2)211-218(1997)。]越来越多的证据表明黄斑色素类胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质可能在与年龄有关的黄斑变性(ARMD)、白内障形成、和其它光诱导的氧化性眼睛损害中起着重要作用。在1985和1993年，Bone等人证明了人类的黄斑色素是叶黄素和玉米黄质的组合，并且推测这些饮食性类胡萝卜素在眼睛疾病ARMD的预防中起着一定的作用。[见Bone等人，Vision Research，251531-1535(1985)和Bone等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，342033-2040(1993)。]在消耗了许多特别富含叶黄素和玉米黄质的水果和蔬菜的病例控制流行病研究中进行的进一步研究工作表明，ARMD的风险降低了43％，随后证明了该推测。[见Seddon等人，J.A.Med.Assoc.，272(18)1413-1420(1994)。]还报道了除β-胡萝卜素外的血清类胡萝卜素水平增加与心脏疾病发生率降低有关。[见Morris等人，J.Amer.Med.Assoc.，272(18)1439-1441(1994)。]已经表明，摄取精制过的饮食添加物(3R，3′R，6′R)-叶黄素和(3R，3′R)-玉米黄质不仅可以使得这些化合物在人体内血清中的水平增加，而且还增加了其氧化代谢物在血浆中的浓度。[见Khachik等人，J.Cellular Biochem.，22236-246(1995)。]这些发现为类胡萝卜素可以在疾病预防中发挥抗氧剂的功能提供了初步证据。此外，这些结果也证实了无-维生素A-活性的饮食性类胡萝卜素，特别是叶黄素、玉米黄质、和番茄红素的重要性。
在人类视网膜中存在叶黄素和3′-表叶黄素(叶黄素和玉米黄质的代谢产物)的直接氧化产物表明叶黄素和玉米黄质可以作为保护黄斑不受短波可见光影响的抗氧剂。因此，叶黄素和玉米黄质在人类视网膜中的氧化-还原途径可能在与年龄有关的黄斑变型和白内障的预防中起着重要的作用。[见Khachik等人，Invest Ophthalmol Vis Sci 38(9)1802-11(1997)。]哈佛医学院的Schepens眼科研究所和眼科学系的研究人员报道了饮食性玉米黄质在保护视网膜不受光损害影响中起着重要作用。[见Thomson等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，43(11)3538-49(2002)。]这样，以前推理因为两种类胡萝卜素、即玉米黄质和叶黄素吸收有害蓝光的能力以及其可作为有力抗氧剂，在黄斑中发现的浓度很高的这两种类胡萝卜素应有保护视网膜的作用。
虽然一些临床研究已经发现证据，即具有较高水平玉米黄质和叶黄素的饮食或血清水平的人出现与年龄有关的黄斑变性(AMD)风险降低，但其他人发现并没有联系。前述Thomson等人用鹌鹑(Japanesequail)提供了类胡萝卜素类物质可以保护视网膜的第一个直接实验证据，使用该动物是因为其视网膜与人类黄斑相似，即具有比视网膜杆更多的锥体光感受器，以及从其饮食中高选择性地累积玉米黄质和叶黄素。这些研究通过用正常、类胡萝卜素-不足、或补加了高剂量玉米黄质的类胡萝卜素-不足的饮食饲养鹌鹑来检验控制饮食性类胡萝卜素类物质对于光对视网膜损害的影响。这些研究确定了光防护与鹌鹑视网膜中的玉米黄质浓度强烈地相关。在一项短期研究中，玉米黄质浓度低的视网膜遭到了严重的光损害，迹象为细胞凋亡的感光细胞数目很高，而玉米黄质浓度高的组则受损害的程度最低。
在这些长期研究中，用类胡萝卜素-不足、正常或补加了玉米黄质-的饮食将这些鹌鹑组饲养六个月，然后曝露于亮光下。结果表明类胡萝卜素-不足的动物出现了广泛的视网膜损害，迹象为死亡的光感受器和间隙(gaps)或其中光感受器已经死亡的“阴影”标记部分的数目都很大。用正常玉米黄质水平的饮食饲养的鹌鹑的视网膜损害显著低于玉米黄质被剥夺的组，而饮食中玉米黄质水平高的组中视网膜仅有很少量的阴影。
这些研究表明对视网膜杆和锥体光感受器都有保护作用。该研究进一步证明了玉米黄质和另一种抗氧剂即维生素E都对视网膜有保护作用。玉米黄质和维生素E都明显降低了这些实验中视网膜的损害，而叶黄素则不行。
Hammond等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，38(9)1795-1801(1997)研究了在13名受试验者中精神物理学测得的黄斑色素。用高效液相色谱法测量了叶黄素、玉米黄质、和β-胡萝卜素的血清浓度。十一名受试验者通过增加60g菠菜(10.8mg叶黄素，0.3mg玉米黄质，5mg β-胡萝卜素)而改变了其日常饮食，并且十名受试验者还增加了150g玉米(0.3mg玉米黄质，0.4mg叶黄素)；其它两名受试验者仅被给予玉米。饮食改变持续达15周。
虽然不是所有受试验者，但是对大多数受试验者而言，在4周内获得了黄斑色素密度的增加。食用菠菜或菠菜加玉米的大多数受试验者出现了血清和黄斑色素密度都增强的应答，虽然一些受试验者仅仅表现出黄斑色素增强，而一名受试验者在黄斑色素和血清两方面都没有变化。那些仅接受玉米补充物的受试验者表现出，如果有的话，很低的血清叶黄素增加，一名受试验者表现出血清玉米黄质大幅度增加，以及较小、但是相对较大的黄斑色素密度增加。当黄斑色素密度随着饮食改变而增加时，在恢复未改变的饮食以后，其在至少几个月内仍保持增加。
来自B.V.Werklust & Beheer的发明人在专利申请DE 199 50 327中提出了叶黄质酯类在预防和治疗眼睛疾病方面的应用。描述了通过合成衍生的短链脂肪酸酯的稳定性研究。没有提及较长链的脂肪酸酯类。
一项涉及77,466名女护士的研究报道了与叶黄素和玉米黄质摄取量增加有关的白内障摘出术的风险降低。[见Chasan-Taber等人，Am.J.Clin.Nutr.，70509-516(1999)。]此外，还报道了对于叶黄素和玉米黄质摄取量达最高的五分之一(quintile)男性而言，白内障摘出术降低。[见Brown等人，Am.J.Clin.Nutr.，70517-524(1999)。]最近报道了玉米黄质的抗癌活性。玉米黄质抑制了TPA-诱导的Epstein-Barr病毒在Raji细胞中的早期抗原表达。玉米黄质还抑制了TPA-增强的32Pi向所培养细胞磷脂中的并合。在一项体内研究中，发现通过用以乳剂形式与饮用水混合的浓度为0.005％的玉米黄质进行处理而抑制了C3H/He雄性小鼠中自发性肝癌的发生。[见Nishino等人，Cancer and Metastasis Reviews，21257-264(2002)。]其它类胡萝卜素类物质的抗氧作用是已知的。US专利6,383,474(Soudant等人)教导了组合使用八氢番茄红素和六氢番茄红素可有效预防由于氧化和曝露于UV光所造成的损害。据认为这种组合可以用作局部制剂、药物或食品添加剂。
β-胡萝卜素和番茄红素是众所周知的食品添加剂，最近还报道摄入番茄红素可以降低前列腺癌的风险。[见Giovannucci等人，J.Natl.Cancer Inst.，87(23)1767-1776(1995)。]番茄红素以红色素的形式天然存在于番茄皮中，而β-胡萝卜素是胡萝卜中主要的类胡萝卜素色素。Hauptmann等人在US专利5,618,988教导了被转化的植物如胡萝卜的贮藏器官中类胡萝卜素色素如β-胡萝卜素的制备。Ausich等人在US专利5,858,700中教导了像从番茄皮中制备一样，可以从含油树脂中分离出番茄红素结晶。番茄红素和β-胡萝卜素的结构式如下所示。
番茄红素 β-胡萝卜素其结构式如下所示的虾青素，一种红色的叶黄质(red xanthophyll)被广泛用作人工养殖的鱼和水生贝壳类动物的着色剂 虾青素虾青素的完全生物医学性质仍然有待阐明，但是初步结果表明其在癌症和肿瘤的预防、以及由免疫系统引起的正性应答中起着重要作用。[见Tanaka等人，Carcinogenesis 15(1)15-19(1994)，Jyonouchi等人，Nutrition and Cancer 19(3)269-280(1993)和Jyonouchi等人，Nutrition and Cancer 16(2)93-105(1991)。]与使用纯类胡萝卜素类物质的饮食补充相比，得自食物来源的类胡萝卜素类物质具有较低的生物利用度和吸收。在增补物中，叶黄质可以酯或未酯化的形式被提供。因为可以被混入到人类饮食添加物中，已经确定了叶黄素二酯和未酯化的叶黄素制剂的叶黄素生物利用度。对于所研究的大多数个体而言，由特定叶黄素二酯制剂提供的叶黄素比由包含游离叶黄素制剂提供的叶黄素的生物利用度高。作者推断在所试验的剂量下，以叶黄素二酯制剂形式出现不会妨碍叶黄素的生物利用度。与之前研究的数据进行的比较表明制剂溶解比叶黄素酯水解对生物利用度的限制作用更高。油溶解的未酯化的叶黄素制剂产生的生物利用度比所报道研究的未酯化的或叶黄素二酯制剂的生物利用度高。[见Bowen等人，J.Nutr.1323668-3673(2002)和Bowen以及Clark的US专利6,313,169。]在自然界中发现的叶黄素最丰富的来源是万寿菊花朵(marigoldflower)，即Tagetes erecta，其一般包含3至5％的玉米黄质酯类。万寿菊属植物是菊科或者也被称为Asteraceae中的一员，并且包含大约三十个有浓郁香味的一年生或多年生的草本物种。万寿菊属植物的母产地为亚利桑那州和新墨西哥州至阿根廷[见Hortus Third A ConciseDictionary of Plants Cultivated in the United States and Canada，MacMillan Publishing Company(1976)。]栽培物种包括万寿菊(通常被称为非洲万寿菊African marigold)、孔雀草(Tagetes patula)(通常被称为法国万寿菊French marigold)、Tagetes erecta x patula[通常被称为三倍体万寿菊(Triploid marigolds)]和Tagetes tenuifolia[也被称为Tagetessignata或指环万寿菊(signet marigold)]。
万寿菊花序是由浓密的数百朵无柄或几乎无柄的、也被称为小筒花(florets)的小花簇组成的单头(solitary head)花序。万寿菊具有伞形头状花序，其中央为管状花形成的盘状小花，周围围绕着舌状或条状的外层伞形花序小花。万寿菊头状花序的一些形式为其盘状花的大多数被转化成边花并且如果有的话，也包含很少的盘状花。该类头状花序被称为重瓣花。
所说的边花或伞形花序小花常常被非专业人员(lay person)(其也将头状花序称为花)称为花瓣。为了易于理解，万寿菊头状花序在这里将被称为花或头状花序，而头状花序-组成的花或小花、雄蕊、柱头和心皮将被称为花瓣。
栽培的万寿菊具有艳丽的花朵并且可用于装饰目的。此外，还将这属植物看成天然色料、精油和噻吩类物质的来源。在养禽业中将干燥的万寿菊花瓣和得自所谓叶黄质万寿菊(xanthophyll marigolds)的万寿菊花瓣浓缩物用作饲料添加剂以增强蛋黄和烤子鸡皮的黄色。[见Piccalia等人，Ind.Crops and Prod.，845-51(1998)。]因为家禽不具备重新合成类胡萝卜素的能力，所以在家禽组织中所需的类胡萝卜素与其饮食浓度有函数关系。[见Balnave等人，Asian-Australiasian J.Animal Sci.，9(5)515-517(1996)。]叶黄质万寿菊在一些特性上与装饰性万寿菊不同。首要地，叶黄质万寿菊被用作提取类胡萝卜素的来源并且具有一些不同于装饰性万寿菊的植物习性。装饰性万寿菊一般仅从地面生长约45至约60cm，而叶黄质万寿菊从地面生长至约65至约70cm。叶黄质万寿菊以比装饰性万寿菊的灌木性更强的灌木性进行生长，并且可以行栽作物的形式生长，而装饰性万寿菊一般不能这样生长。叶黄质万寿菊在颜色上一般为暗橙色，而装饰性万寿菊的颜色可以为白色、黄色、或橙色、或者可以具有混合色，包括由于存在花青素苷色素而产生的红褐色。
万寿菊花瓣粉的着色能力大部分是由被称为叶黄质(主要是叶黄素酯)的氧化类胡萝卜素部分产生的。[见Piccalia等人，Ind.Crops andProd.，845-51(1998)。]已经表明也可以在万寿菊花瓣中找到的叶黄质玉米黄质可有效作为烤子鸡色素，产生高度受欢迎的黄色至橙黄色。[见Marusich等人，Poultry Sci.，551486-1494(1976)。]在叶黄质类物质中，色素叶黄素和玉米黄质在可商业获得的杂种中是最丰富的。叶黄素和玉米黄质的结构式如下所示。
叶黄素
玉米黄质叶黄素和玉米黄质各自在其末端的环状结构上包含一个羟基，从而使得每个分子中包含两个羟基。据信叶黄素可以由α-胡萝卜素两种独立的羟基化生物学反应产生，而玉米黄质是由β-胡萝卜素两种独立的羟基化生物学反应产生的。
α-胡萝卜素和β-胡萝卜素都被认为是由适宜的环化酶对番茄红素作用，首先产生δ-胡萝卜素或γ-胡萝卜素，其后分别被进一步环化形成α-胡萝卜素或β-胡萝卜素而形成的。番茄红素、γ-胡萝卜素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素各自是在现有技术中被称为胡萝卜素的烃类类胡萝卜素。这样，类胡萝卜素色素可以被分到下面两类中的一类中烃类胡萝卜素或氧化叶黄质。八氢番茄红素，该途径中的第一种C40类胡萝卜素，是无色的烃。除β-胡萝卜素外的该烃类胡萝卜素色素一般不会在万寿菊的叶子或花中积累，而叶黄质却能在其叶子和花两部分发生积累。


图1是表示叶黄素和玉米黄质产生的生物合成途径的图示，后一种产品是由八氢番茄红素通过番茄红素、γ-胡萝卜素、α-胡萝卜素和-胡萝卜素获得的。叶黄素和玉米黄质主要以脂肪酸单-和二-酯的形式存在于万寿菊花瓣中。图1还注释出了可以由玉米黄质产生的包含环氧化物的后一种产品，其中堇菜黄质是脱落酸生物合成途径中的中间体。
叶黄质万寿菊主要产自墨西哥、秘鲁、非洲、印度、中国和泰国。现代，商业变种包括‘Orangeade’，一种最初产生叶黄质的变种，和‘Orangeade’的商业改良品种，包括具有较大的花和较高色素产量的‘Deep Orangeade’、以及‘Scarletade’，一种对叶黄质浓度进行了改善的品种。这样，据报道，‘Orangeade’包含的叶黄质数量为约9-12mg/g整个头状花序干重(包括花萼)，‘Deep Orangeade’具有约10-13mg/g的这些色素，并且据说‘Scarletade’在与花萼一起称重的干头状花序中包含约12-18mg/g叶黄质色素。这些变种可从泛美种籽公司(622Town Road，West Chicago，IL 60185)获得。
鉴于叶黄素是万寿菊中主要的叶黄质，一些目前的变种产生的提取产品其玉米黄质比值{[玉米黄质/(叶黄素+玉米黄质)]×100％}在3至5％范围内。(见Product Profile，Kemin Foods L.C.，600 E.Court Ave.Suite A，Des Moines，IA 50309)。正如由下文的结果看到的那样，用‘Scarletade’获得的玉米黄质与叶黄素的比例一般为约4至约7％，从而使得这些花包含高至约1.25mg/g玉米黄质或高至约0.125％干重的玉米黄质。
对由新鲜万寿菊花瓣获得的叶黄素酯进行的分析既鉴定出了单酯化的叶黄素，又鉴定出了二酯化的叶黄素。脂肪酸分布包括棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、月桂酸和十五烷酸[见Gomez等人，Revista Espanola de Fisiologia 34253-256(1978)。]Moehs等人，Plant Mol.Biol.，45281-293(2001)对万寿菊装饰性变种中类胡萝卜素的生物合成进行了分析，所说的变种包括具有暗橙色花朵的所谓野生型植物、和具有黄色、淡黄色和白色花朵的植物。在其它发现中，这些研究者报道了虽然不同植株具有颜色范围从白色(突变型)至暗橙色的花，但是据说这些花的颜色差异是由于相同的类胡萝卜素，即叶黄素数量十分不同的积累造成的，而不是由不同类胡萝卜素产物或中间体的积累造成的。表明所研究植株的差异主要与类胡萝卜素途径中通量的调节有关，而不是与所产生的类胡萝卜素的特定类型或生物合成中间体的积累有关。
此外，据报道，不管花的颜色是什么，所谓的野生型和突变型植株(开白花的植株)的叶子都包含大致相同相对数量的类胡萝卜素色素。这些色素与存在于花瓣中的色素不同。这样，花瓣所报道的唯一色素是叶黄素，而叶子中已报道的色素包含叶黄素以及β-胡萝卜素、堇菜黄质和新黄质。正如可以从图1看到的那样，后两种色素的前体可能是β-胡萝卜素而不是叶黄素。
Moehs等人及作者也对他们所分离的万寿菊基因与相似的得自拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶子中的能产生类胡萝卜素的基因(Pogson等人，见下文)进行了比较。约70至约80％的基因产品间的鉴定是在蛋白水平下报道的，如果排除推定的质体靶向信号肽则鉴定水平会更高，而在DNA水平下鉴定则水平较低。在拟南芥的叶子中，叶黄素是占优势的类胡萝卜素，也形成了β-胡萝卜素、堇菜黄质和新黄质，但是正常情况下不会发生玉米黄质的积累。
万寿菊中类胡萝卜素的生物合成是涉及许多基因的复杂系统，并且可能有两种途径。不能以先验论来预测基因突变对类胡萝卜素产生的影响。但是，标准的育种技术已经培育出了产生提升上述叶黄质水平的‘Orangeade’、‘Deep Orangeade’和‘Scarletade’万寿菊变种。一直没有对这些相对新近培育出的可获得的变种进行诱导基因突变的处理，以图增加玉米黄质比例。
一些工作者已经检查了一些诱变剂如γ辐射、甲磺酸乙酯(EMS)和亚硝基甲脲(NMU)对包括万寿菊在内的开花植物的影响。例如，Zaharia等人，Buletinul Institutului Agronomic Cluj-Napoca.Seria Agricultura44(1)107-114(1991)报告了在以各种数量的γ射线对百日菊(Zinniaelegans)、万寿菊和翠菊(Callistephus chinensis)的种子进行辐射后，对胚芽鞘中类胡萝卜素的叶绿素-缺乏的影响。Geetha等人在ActaBotanica Indica，20(2)312-314(1992)中的论文中报道了γ射线对孔雀草的叶绿素缺乏的影响。
Diaconu，Agronomie，34(1)17-21(1991)报道了EMS对得自通常被称为金盏花(pot marigolds或Calendula)的F2多系杂交物的正在发芽的种子的影响，所说的多系杂交物根本不是万寿菊属植物。这些研究者注意到了M2-M4植株中花色、花序结构、生物活性物质的产量和含量的广泛变化。
Pogson等人，Plant Cell，81627-1639(1996)的研究中用EMS对拟南芥植株进行诱变处理。这项用4000个M2系进行的详细研究报道了发现在由γ-胡萝卜素产生叶黄素时在叶子中涉及类胡萝卜素生物合成途径的两个部位。这些部位被称为lut1和lut2。据报道，lut2部位与番茄红素ε-环环化酶有关，而lut1部位与番茄红素ε-环羟化酶有关。这些研究者指出(第1631页)叶黄素生产的下降可被其它类胡萝卜素类物质丰度的等摩尔改变所补偿，虽然上述改变中只有小量是由于玉米黄质的产生增加来达成的。
Cetl等人，Folia Fac.Sci.Nat.Univ.Purkynianae Brun Biol.，21(1)5-56(1980)报道了对万寿菊和其它万寿菊属物种的广泛研究，这些物种从贫乏的描述来看都应是装饰性变种。在这些研究中，这些作者检验了各种浓度的NMU对万寿菊种子的影响，并且对大约2000株以上的植株进行了检验。记录了所有偏离亲代杂交(parental cross)表型的M2植株，并且还对得自表型不同植株M2种子的M3植株进行了研究。
这些研究者对植株高度、植株直径、头状花序直径和头状花序的高度、以及开花的时间、分支数量、分支长度、子叶和叶子的大小、以及花柄长度进行了分析。没有提及花色和叶子或花瓣中的类胡萝卜素水平。
公开的PCT申请WO 00/32788(DellaPenna等人)要求保护一些调节万寿菊物种中类胡萝卜素生物合成的方法。这些研究者提供了据说是编码从番茄红素制备玉米黄质所需的番茄红素β-环环化酶和番茄红素β-环羟化酶的序列的多核苷酸序列。还公开了与番茄红素β-环环化酶一起，用于由番茄红素制备α-胡萝卜素的番茄红素ε-环环化酶。没有提供制备叶黄素所需的番茄红素ε-环羟化酶的教导。
在PCT申请WO 00/32788中宣称可以通过表达已经存在于万寿菊属植物如上述这些植物中的编码类胡萝卜素合成酶的基因或者通过使用由所提供的这类核苷酸序列编码的反义RNA来调节类胡萝卜素的生物合成。在该申请中没有提供该类调节的证据。这些研究者没有涉及被称为共同抑制的现象，通过它可使同源基因的加入导致天然基因和转基因都不被表达。[见例如，Fray等人，Plant Mol.Biol.，22589-692(1993)或Finnegan等人，Bio/Technology，12883-888(1994年9月)。]在其共同拥有的PCT申请PCT/US02/20633和序列号为10/180,775的相关申请以及序列号为10/325,265的部分继续申请中，发明人对提供包含商业用量玉米黄质酯类的花瓣的突变种万寿菊植株进行了描述。这些植株具有改变的叶黄素和玉米黄质比例，从而使通常报道的玉米黄质水平4％至约7％得到提升并且使叶黄素数量降低。上述申请和共同拥有的PCT申请对该类万寿菊属植物进行了描述，而本发明考虑优选地由这样的植物获得浓缩的万寿菊属植物提取物，并对其进行配制从而提供有效数量的混合性玉米黄质酯，用于预防癌症或用于治疗或预防白内障形成、黄斑变性或自由基介导的疾病。
本发明的简要概述本发明考虑混合性玉米黄质酯并且更特定地为包含混合性玉米黄质酯的精制类胡萝卜素浓缩物、以及可以由该浓缩物制备的各种混合玉米黄质酯类组合物。所考虑的精制浓缩物是固体至半固体，其中混合性玉米黄质酯含量为该浓缩物的约50毫克/克或更多，同时在皂化后进行分析时，玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约20％或更多。在一个优选的实施方案中，当在皂化后进行分析时，所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约25％或更多。在一些实施方案中，所说的浓缩物包括至少一种另外的游离或被酯化形式的类胡萝卜素。在一个优选的实施方案中，该混合性玉米黄质酯是由万寿菊物种提取的。
本发明另一方面考虑包含溶解或分散于可食用稀释剂中的混合性玉米黄质酯的稀释的精制类胡萝卜素组合物。所考虑的该类组合物可以用上述浓缩物来制备并且其中混合性玉米黄质酯含量为该稀释组合物的约10毫克/克或更多，同时在皂化后进行分析时，玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约20％或更多。在一个优选的实施方案中，所说的稀释剂是油。在另一个实施方案中，所说的组合物被包封于小珠中。在另一个优选的实施方案中，当在皂化后进行分析时，所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约25％或更高。在一些实施方案中，所说的组合物包括至少一种另外的游离或被酯化形式的类胡萝卜素。在一个优选的实施方案中，该混合性玉米黄质酯是由万寿菊物种提取的。
本发明这方面所考虑的一种应用是适于口服施用的单位剂型中的营养有效量混合性玉米黄质酯，所述剂型有例如小包(packets)、片剂、胶囊、和位于小瓶或安瓿中的粉末。该营养有效量可以是足以预防癌症、或足以治疗或预防白内障形成、黄斑变性或自由基介导的疾病的数量。在一个优选的实施方案中，该组合物包含约2毫克或更多的混合性玉米黄质酯本发明这方面考虑的另一种应用包括把营养有效量的混合性玉米黄质酯作为食物或饮料的添加剂。所说的食物包括用于人类消费的食物以及宠物食品。所混入的营养有效量可以是足以预防癌症、或足以治疗或预防白内障形成、黄斑变性或自由基介导的疾病的数量。在一些实施方案中，所说的每份食物或饮料中包含约0.5毫克或更多的混合性玉米黄质酯。在一个优选的实施方案中，所说的食物是具有不超过40mg/天剂量的医学食品。
本发明另一方面考虑包含溶解或分散于美容可接受的稀释剂中的混合性玉米黄质酯的稀释的精制类胡萝卜素组合物。所考虑的这类组合物可以用之前所述的浓缩物来制备，并且混合性玉米黄质酯含量为该稀释组合物的约10毫克/克或更多。同时在皂化后进行分析时，玉米黄质为存在的总胡萝卜素约20％或更多。在一个优选的实施方案中，当在皂化后进行分析时，所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约25％或更高。在一些实施方案中，该组合物包括至少一种另外的游离或被酯化形式的类胡萝卜素。在一个优选的实施方案中，该混合性玉米黄质酯是由万寿菊物种提取的。本发明这方面所考虑的应用包括局部应用于人类皮肤的包含于乳膏、洗剂、或软膏中的光保护有效量混合性玉米黄质酯。
本发明具有一些益处和优点。
本发明的一个益处是现在可以精制浓缩形式经济地提供大量混合性玉米黄质酯。
本发明的一个优点是现在可以获得包含营养有效量混合性玉米黄质酯和任选的一种或多种类胡萝卜素的食品增补剂。
本发明的另一个益处是提供了包含营养有效量混合性玉米黄质酯的食物或饮料。
本发明的另一个优点是提供了包含混合性玉米黄质酯的医学食品，其含量足以预防自由基介导的疾病。
本发明的另一个益处是提供了包含光保护有效剂量的混合性玉米黄质酯的局部的乳膏、洗剂或软膏。
本发明另外的益处和优点将由下面的详细描述而变得显而易见。
附图简要说明在形成本公开内容一部分的图中，图1是表示植物中产生叶黄素和玉米黄质的生物学合成途径的图示，其中在该途径中的八氢番茄红素，即第一种C40类胡萝卜素，分几步(四个箭头)通过ζ-胡萝卜素被转化成番茄红素，其后该途径分裂形成包含一个ε-环的δ-胡萝卜素，然后形成包含一个ε-环和一个β-环的α-胡萝卜素或者分裂形成包含一个β-环的γ-胡萝卜素，然后形成包含两个β-环的β-胡萝卜素，并且在几步后，分别形成叶黄素或玉米黄质，并且玉米黄质分枝继续形成包含环氧化物的叶黄质花药黄质、堇菜黄质和新黄质。
这里所用的术语“玉米黄质比例”被定义为用干燥的花瓣或叶子中存在的玉米黄质数量除以花瓣或叶子中存在的玉米黄质加叶黄素的数量[玉米黄质/(叶黄素+玉米黄质)]。同样，“新黄质加堇菜黄质比例”为新黄质+堇菜黄质除以这两种色素加叶黄素的和的比例形式。“β-胡萝卜素比例”、“番茄红素比例”、“α-隐黄质比例”、“八氢番茄红素比例”和“六氢番茄红素比例”同样是用其异构体之和形式所指定的色素数量作为分子，并用色素加叶黄素之和作为分母来进行计算的。对于这些计算而言，也可以使用适宜百分比之和。这些色素数量是如下文所讨论的那样，在将干燥的花瓣或叶子提取物皂化后用高效液相色谱(HPLC)来测定的，从而使得叶黄素和玉米黄质(或其它色素)各自的数量是以游离化合物的形式被测量的，例如，对于叶黄素和玉米黄质而言，其在皂化后是醇形式而不是存在于新鲜花瓣中的酯化形式，并且破坏了可能存在于叶提取物中的叶绿素。这里所讨论的植株的一些花瓣和叶子包含十分低或不可测量数量的叶黄素或叶黄素酯类物质，例如小于约0.1-0.2％的数量。在这种情况中，所说比例分母中的叶黄素数量接近0并且所说的比例接近1。
这里所用的词汇“含油树脂”指的是包含植物色素例如本文所讨论的以其酯化形式存在的叶黄质的植物组织的提取物，其有时还包含一定数量的其它植物产物和色素，如其它类胡萝卜素如β-胡萝卜素以及少量溶剂如己烷或丙酮，有机溶剂的数量一般小于1％。叶黄质一般以单-或二酯的形式存在于花瓣中，并且一般以游离醇形式存在于万寿菊属植物叶子中。胡萝卜素如β-胡萝卜素或番茄红素是以游离、非化学结合化合物的形式存在的。叶绿素存在于万寿菊属植物叶子中并且很大程度上不存在于花瓣中。这样，由花瓣制备的含油树脂包含叶黄质酯类和/或烃类胡萝卜素并且在很大程度上不含叶绿素，而由万寿菊属植物叶子制得的含油树脂包含叶绿素和游离叶黄质以及胡萝卜素类。含油树脂是一种固体或半固体物质。
本发明的详细描述本发明考虑浓缩物形式的混合性玉米黄质酯、该类浓缩物可以进行的一些应用以及可以由其制备的一些产品。正如在下文更详细讨论的那样，考虑的浓缩物典型地是植物组织如花的花瓣的提取物，如优选的一些万寿菊物种，万寿菊花瓣的提取物。干燥的花瓣典型地包含约0.2至0.3％的混合性玉米黄质酯，而这里考虑的干燥花瓣包含约0.4至约1.2％的混合性玉米黄质酯。第一种植物提取物在现有技术中被称为含油树脂，并且包含比干燥植物组织来源高出约10倍的所需混合性玉米黄质酯，以及其它植物材料。一种所考虑的浓缩物是精制含油树脂而产生的，并且每单位重量中包含的所需混合性玉米黄质酯的数量比干燥的植物组织来源高出至少40倍。
所考虑的一种浓缩物典型地为固体或具有树胶稠度的半固体。物理形式方面的差异在很大程度上是由于所存在的组分不同，更多的组分通常会产生一种更柔软的较不坚硬的材料。
玉米黄质酯类可以多种二酯、多种单酯、或二酯和单酯的混合物形式存在。玉米黄质是二元醇(二醇)并且因此可以被单酯化或二酯化。形成玉米黄质的单-和二酯的酸是在植物中、特别是花瓣中天然存在的脂肪酸。示例性的脂肪酸每个分子在具有零至约三个烯属不饱和度的直链中包含8至约20个碳原子。该类脂肪酸的实例包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、十五烷酸、癸酸、和亚麻酸。典型的脂肪酸包括棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、月桂酸、和十五烷酸。所考虑浓缩物的玉米黄质酯类是包含两种或多种上述羧酸的玉米黄质酯类的混合物，其中存在的特定羧酸和由其中可获得所说酯类的植物和植物部分相关连。该混合物可包含用不同的混合羧酸酯化的单一玉米黄质分子部分，或各自包含两个相同的羧酸部分的玉米黄质酯分子与包含不同的羧酸部分的不同玉米黄质酯分子的混合物。
由所说二酯的羧酸提供的质量为二酯分子质量的大约一半、为单酯分子质量的大约三分之一。但是，为了方便，如下文所讨论的那样，所考虑的浓缩物或这里所讨论的其它包含玉米黄质酯的组合物中存在的玉米黄质的数量是在将被分析样品水解或皂化后用HPLC以游离二元醇(二醇)的玉米黄质本身的形式被测定的。当在皂化后对所考虑的浓缩物进行分析时，玉米黄质含量可为存在的总类胡萝卜素的约20％或更多。在另一个实施方案中，在皂化后，玉米黄质含量可为存在的总类胡萝卜素的约25％或更多。在一个优选的实施方案中，在皂化后，玉米黄质含量可为存在的总类胡萝卜素的约30％或更多。
已知一般的类胡萝卜素和特定的类胡萝卜素如胡萝卜素类、八氢番茄红素和番茄红素、以及叶黄质如叶黄素和玉米黄质具有抗氧剂性质并能提供相关的健康益处。在所考虑的浓缩物或由其获得的稀释产品中包括至少一种游离或酯化形式的另外的类胡萝卜素，可以为该配制品的消费者提供增强健康的益处。所说的另外的类胡萝卜素可以是胡萝卜素、叶黄质、单酯化的叶黄质、二酯化的叶黄质或其混合物。胡萝卜素类物质的实例包括八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素、δ-胡萝卜素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、和β-胡萝卜素。叶黄质的实例包括α-隐黄质、叶黄素、β-隐黄质、玉米黄质、花药黄质、堇菜黄质、和新黄质。也可以混有玉米黄质酯或二酯的叶黄质酯或二酯的羧酸部分选自可以提供玉米黄质酯或二酯的羧酸部分的上述羧酸。
所考虑的包含混合性玉米黄质酯的精制浓缩物典型地是由含油树脂产生的。正如现有技术中众所周知的那样，含油树脂是包含被酯化形式的植物色素如叶黄素和玉米黄质的植物组织的固态提取物。所说的色素有时混有其它植物产物和色素，如其它叶黄质酯类或胡萝卜素类、以及少量的提取溶剂如己烷或丙酮。该含油树脂优选地是由万寿菊属植物一一万寿菊的花提取的，并且包含存在于植物花朵中的脂肪酸酯类和游离类胡萝卜素。含油树脂是商品，并且被销售给一些加工者对其进一步进行处理从而产生人类或其它动物的食品增补物。
在一种示例性的万寿菊属植物浓缩物制备中，用己烷、丙酮、乙酸乙酯或类似有机溶剂作为提取剂，从干燥的、通常被粉碎的万寿菊属植物花瓣中提取出混合性玉米黄质酯和可能存在的其它叶黄质酯类或胡萝卜素类。该提取步骤是根据现有技术中已知的操作方法来进行的。除去溶剂，一般是在真空下，得到包含高含量叶黄质酯类并且约99％并优选约99.9％不是提取有机溶剂，即包含少于约1％并且优选少于约0.1重量％有机溶剂的、被称为含油树脂的提取物。可以用低分子量的醇进一步对该含油树脂进行纯化以分离出非叶黄质类的脂质或农药残余物。然后，将其在真空下浓缩，从而获得足够高的浓度，适宜直接用于增补物制剂、局部应用或作为食品添加剂。还可将上述浓缩物稀释，从而形成诸如油溶液或被包封于小珠中的产物，以便出售用于增补物制剂、局部应用、或作为食品添加剂。
该浓缩物是暗橙色-褐色的固体或半固体，如包含混合性玉米黄质酯的树胶，可以用分光光度法进行测量。将浓缩物溶解于己烷中，并在约450nm的最大吸收波长下，用1260的1％消光系数ε，对玉米黄质酯类进行测量。[见Levy US专利6,191,293。]。所考虑的精制浓缩物包含混合性玉米黄质酯，并且在皂化后进行分析时，该玉米黄质含量为存在的总胡萝卜素重量的约20％或更高。
在通过溶解和过滤制备浓缩物时所用的纯化方法可以采取现有技术中已知的类似方法。Tyczkowski等人开发了简单的提取和结晶方法，由可从商业获得的被皂化万寿菊属植物提取物得到了纯度为96.0至99.2％的叶黄素。叶黄素酯类被合成制备从而提供了用于实验室规模处理的化合物。[见Tyczkowski等人，Poultry Science 70651-654(1990)。]在US专利4,048,203中，Philip描述了从植物材料中提取叶黄素酯类物质，并用醇在75℃对这些酯类物质进一步纯化的方法。在US专利5,382,714中，Khachik描述了一种由被皂化的万寿菊属植物含油树脂中分离叶黄素、将其纯化和重结晶的方法，在US专利5,648,564中，Ausich等人描述了一种从植物中提取、分离并纯化可食用的叶黄质结晶的方法。后面这两种方法都需要皂化步骤，从而破坏了存在于植物材料中的天然叶黄质酯形式。
Schulz在US专利4,105,855中教导了一种合成对称的、可以是酯类的类胡萝卜素的方法。Schulz所提及的唯一的玉米黄质酯是在获得二醇的步骤中作为最后中间体形式的二醋酸酯。Schulz并没有教导混合性玉米黄质酯或其浓缩物的合成或提取。
在US专利6,191,293中，Levy举例说明了由枸杞(Chinesewolfberries，Lycium chinense)进行的叶黄质酯的制备。其它研究者表明枸杞具有单一的二酯，即玉米黄质二棕榈酸酯[见Kim等人，Arch.Pharm.Res.，20(6)529-532(1997)。]为了获得所需的混合性玉米黄质酯浓缩物，这里仍然使用了在该专利中所述的方法。
Montoya-Olvera等人在US专利6,504,067中描述了一种获得高纯度叶黄质浓缩物的工业方法。在不同的阶段消除或除去各种杂质，包括游离脂肪酸、树胶、蜡类物质、磷脂、类脂、甾醇、叶绿素和挥发性化合物。同时在各阶段后富集叶黄质浓缩物。用这种方法，由包括万寿菊属植物含油树脂在内的植物提取物制得了纯度高于90％的皂化后浓缩物。
可以将纯化过的混合性玉米黄质酯浓缩物溶解或分散于适宜的可食用稀释剂如可食用植物油、果胶、或干淀粉中从而制备出一种稀释的组合物，并且其混合性玉米黄质酯的含量为每克该稀释组合物约5毫克混合性玉米黄质酯。当在皂化后对所考虑的组合物进行分析时，玉米黄质含量为存在的总类胡萝卜素的约20％或更高。在一个优选的实施方案中，当在皂化后进行分析时，所说的玉米黄质含量为存在的总类胡萝卜素的约25％或更高。
油的实例包括小烛树油、椰子油、鱼肝油、棉子油、鲱油、橄榄油、棕榈油、玉米油、豆油、花生油、罂粟子油、红花油和向日葵油。优选使用具有相对高的不饱和脂肪酸浓度的油；即优选使用具有约100-150碘值的油。鲱鱼油、玉米油、棉子油、芥子油、罂粟子油、菜子油、红花油、芝麻油、豆油、向日葵油、和小麦胚芽油是该类油的说明性实例。
可以将精制的混合性玉米黄质酯浓缩物溶解或分散于适宜的美容可接受的稀释剂中，并且每克稀释组合物包含约5毫克混合性玉米黄质酯。所选择的稀释剂可以是固体、液体或半固体如矿脂，以制备出稀释的组合物。这样制备的稀释的精制混合性玉米黄质酯产品可以是分散体如固体-固体分散体、乳剂如水包油或油包水乳剂、或用别处所讨论的适宜油类作为稀释剂形成的溶液。当在皂化后对所考虑的组合物进行分析时，玉米黄质含量可为存在的总类胡萝卜素的约20％或更多。在一个优选的实施方案中，当在皂化后进行分析时，玉米黄质含量为存在的总类胡萝卜素的约25％或更高。
可接受的另外的稀释剂包括可可豆脂、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、纤维素、高岭土、甘露醇、干淀粉、糖粉、山梨醇和肌醇。对于乳剂型组合物而言，乳化剂可以是天然或合成乳化剂，并且可包括明胶、蛋黄、酪蛋白、果胶、月桂基硫酸钠、聚乙二醇400单硬脂酸酯、皂土、和三硅酸镁。在诸如Remington′s Pharmaceutical Sciences第18版，Gennaro编辑，Mack Publishing 1990和Handbook ofPharmaceutical Excipients，Rowe等人编辑，Pharmaceutical Press 2003之类的参考资料中给出了可食用和美容学可接受的另外的稀释剂。
为了制备稀释的产品，如众所周知的那样，典型地用混合装置来进行油和包含混合性玉米黄质酯浓缩物的混合。如US专利5,382,714(Khachik)所述的那样，还可以存在添加剂如α-生育酚以防止长期储存期间可能发生的氧化。
该包含混合性玉米黄质酯的稀释的精制类胡萝卜素组合物还可以被包封于通常称为“小珠”的球形小丸中的形式存在。实例性的小珠是水不溶性的，并可如US专利4,670,247所公开的那样，通过用交联明胶、或者如US专利6,150,086所公开的那样用藻酸盐如藻酸钠，对混合性玉米黄质酯的稀释类胡萝卜素组合物进行包封来制备。
用交联明胶作为说明性实例，通过形成包含混合性玉米黄质酯、水、明胶和糖的乳液来制备水不溶性的小珠。将该乳液转化成小滴，以得自小滴的颗粒彼此保持分开的方式，在大量淀粉粉末中各个收集这些小滴，直至永久性地确立了其颗粒形式。将该包含类胡萝卜素的颗粒从该淀粉收集粉末中分离出来，在约90℃至约180℃的温度下进行加热处理。该热处理步骤通过使糖的羰基与明胶分子的游离氨基部分相互反应而降低了该小珠明胶基质的溶解性。所得的小珠是水不溶性的，并且表现出在进料压丸时对各种应力的稳定性增加。该交联过程利用了制备小珠时所用的成分而不需要向该组合物中加入交联试剂或添加剂。
US专利5,695,794公开了这里可应用的另一种小珠形式。在这里，通过将包含于氢化植物油例如氢化的棉子油、小麦胚芽油、红花油、豆油等等中所需数量的混合性玉米黄质酯的熔化溶液进行喷雾来制备直径为约30至约55微米的小珠，所说的植物油还可包含甘油单-和二酯，如那些由氢化大豆单-和二脂肪酸甘油酯、棉子单-和二脂肪酸甘油酯等等制得的物质、以及作为抗氧剂的枸橼酸和2，6-二-叔-丁基-4-甲基苯酚(BHT)。正如众所周知的那样，还可以使用其它抗氧剂如ethoxiquin、维生素E等等。在约160°F(约70℃)的温度下将被熔化的混合物喷雾到喷雾冷却剂例如得自Niro，Inc.，Columbia，MD的冷却剂的旋流气流中，从而制得在冷却时固化的小珠。将该冷却的小珠上洒上防结块剂如众所周知的热解硅石、磷酸钙、粉状淀粉或纤维素，从而形成所说的小珠，优选地将其加入饲料中作为增补剂。
所考虑的包含混合性玉米黄质酯的精制浓缩物还可以由合成衍生的玉米黄质酯类来制备。玉米黄质的来源包括有机合成、天然存在和被基因改性的有机体。在US专利6,150,561中，Kreienbuhl等人描述了用Wittig反应进行玉米黄质的合成制备。合成的玉米黄质可由商业途径得自Roche Vitamins，Inc。在US专利5,747,544中，Garnett等人描述了通过多食黄杆菌细胞以及包含从这种多食黄杆菌菌株分离出来的基因的其它宿主细胞的发酵作用制得的、包含所需3R，3′R异构体的玉米黄质制剂。
编码将普遍存在的前体如焦磷酸牻牛儿酯和焦磷酸法尼酯转化成焦磷酸牻牛儿基牻牛儿酯(GGPP)、和将GGPP转化成β-胡萝卜素的酶的基因，在制造产生玉米黄质的基因改性的有机体方面是很重要的。Ausich等人在US专利5,684,238中公开了适宜的方法，用E.herbicola核酸序列和沉积下来的包含E.herbicola DNA的细胞来形成GGPP，并将GGPP转化成八氢番茄红素、将八氢番茄红素转化成番茄红素和将番茄红素转化成被转化的宿主植物中的β-胡萝卜素。该专利还教导了一些方法，用E.herbicola核酸序列和沉积的包含E.herbicola DNA的细胞来进行宿主有机体内β-胡萝卜素向玉米黄质的转化。宿主有机体进行表达这些基因中各基因的转化，各基因编码包含N-末端转移肽序列的嵌合酶，从而提供了一种可以产生玉米黄质酯类物质的转基因有机体。还应当清楚的是，可以用编码具有N-末端质体转移肽的嵌合酶的、得自E.uredovora[Misawa等人，US专利5,429,939]或其变种的适宜基因的DNA序列来代替得自E.herbicola的DNA序列。
然后，可以用混合性C8-C20羧酸酰氯将由上述来源制得的玉米黄质酯化，接着回收与万寿菊属植物分离出来的酯类物质相似的混合性玉米黄质酯。但是，这类化学合成制备的成本将比上述由万寿菊属植物制得浓缩物的成本高得多。不仅酯类产品化学合成的成本高，而且合成或由有机体发酵制备玉米黄质的成本也很高。此外，合成玉米黄质的方法会产生应当与所需3R，3′R异构体分离的、无生物学活性的异构体。虽然很昂贵，但是可以将这样获得的混合性玉米黄质酯与之前所述的类胡萝卜素浓缩物混合，或用其代替所说的浓缩物。
混合性玉米黄质酯的精制浓缩物或稀释组合物的一种考虑的应用，是用于适宜口服施用的组合物中，并想要、且十分适用于被引入到哺乳动物主体，如人体中。混合性玉米黄质酯可以得自万寿菊属植物提取物，以及之前所述的通过合成获得的酯类。所考虑的用于口服施用的组合物，可以根据常规的食品增补或药学实践，用混合性玉米黄质酯活性成分来制备。可以使用的稀释剂、赋形剂、或载体是该类制剂众所周知的物质，并且可以根据给定的背景对其形式进行选择。
适于口服施用的组合物优选地为单位剂型。在该类形式中，组合物被分成包含适宜数量混合性玉米黄质酯物质的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，包装中包含分散量的制剂，例如，小包、片剂、胶囊、和小瓶或安瓿中的粉末。该单位剂型还可以是胶囊、扁囊剂、或片剂本身，或者可以是适宜数目的这些被包装形式中的任何一种形式。
在一些实施方案中，所考虑的组合物以预防癌症、或治疗或预防白内障形成、黄斑变性或自由基介导的疾病的有效量，被用于营养有效的单位剂量中。这里所用的术语“营养有效量”指的是当被施用时，能获得所需达到预防或治疗作用的混合性玉米黄质酯数量。营养有效量典型地为每份0.5mg，其最大剂量一般不超过40mg/天。在一个优选的实施方案中，单位剂量形式的组合物提供2毫克或更多的混合性玉米黄质酯。
混合性玉米黄质酯所考虑的另一种应用是作为食品制剂中的添加剂，这些食品制剂有烘焙物品和烘烤混合物、豆乳、饮料和饮料粉、冷冻的乳制品甜点和混合物、加工的水果和蔬菜产品、蛋产品和鸡蛋替代品、早餐谷类食品、脂类和油类、硬糖、水果点心、乳制品、糖浆、包括宠物食品在内的肉制品和不经受苛刻烹饪条件[例如高于约400°F、约205℃的温度]的其它类似食品。
当被人或其它哺乳动物消费时，在所考虑的组合物中使用的混合性玉米黄质酯的数量，为能预防癌症或治疗或预防白内障形成、黄斑变性或自由基介导的疾病的量。在一个优选的实施方案中，所考虑的食物或饮料每份可提供约0.5毫克至约8毫克的混合性玉米黄质酯。在一个更优选的实施方案中，所考虑的食物或饮料每份可提供约2毫克至约6毫克的混合性玉米黄质酯。
精制的混合性玉米黄质酯浓缩物或稀释组合物所考虑的另一种应用是打算以单独的饮食项目形式用于医学食品中。医学食品被“弧儿药品条例”(the Orphan Drug Act)定义为被制备成在医生的监督下消费或口服施用，并被用于根据公认的科学原理通过医学评估确定有特殊营养需要的疾病或状况的饮食控制食品。在一些实施方案中，所考虑的组合物以用于预防癌症或治疗或预防白内障形成、黄斑变性或自由基介导的疾病的数量被使用。在一个优选的实施方案中，所说的医学食品每天可提供高至约40毫克的混合性玉米黄质酯。在一个更优选的实施方案中，该医学食品每天可提供约30毫克至约40毫克的混合性玉米黄质酯。
混合性玉米黄质酯具有抗氧剂的性质并可吸收蓝光以及紫外(UV)光区域中的一部分光，从而使其可有效防止由于与有害辐射相接触而导致的损害。320至400纳米波长的紫外辐射范围在化妆品工业上被定义为“UVA”波长范围，并且已知其可造成皮肤的炎症或发疱(即晒伤)。除日光造成的短期危害外，与这种UV辐射接触还会造成一些长期危害。这些长期危害中的一种是皮肤表面的恶性变化。已经进行了许多流行病学(epidemologic)研究，其结果证明暴露于日光下和人类皮肤癌之间有紧密的关系。紫外线辐射的另一种长期危害是使皮肤过早老化。
当所考虑的制剂被用于皮肤上时，被减轻或防止的损害可以是任何皮肤损害如灼伤、水疱、或长期曝露于日光下出现的损害，例如皮肤过早老化。保护所需的准确数量将根据防晒系数(SPF)而变化。常用SPF来测量防晒剂的光保护作用。包含可以在不同UV波长下吸收光从而可以保护皮肤的分子的混合物的防晒剂组合物在现有技术中是已知的。[见Haffey等人的US专利5,087,445和Turner等人的US专利5,073,372。]在本发明的一个实施方案中，将光保护有效量的混合性玉米黄质酯溶解或分散于稀释剂中，用作局部乳膏或洗剂。这里所用的术语“光保护有效量”指的是当被施用时，可以达到所需保护作用的混合性玉米黄质酯的数量。局部的乳膏、洗剂、或软膏可以是凝胶、水包油或油包水乳剂或油膏的形式。在一个优选的实施方案中，混合性玉米黄质酯的光保护量为所说局部的乳膏、洗剂或软膏的约0.5至约20重量％，并且更优选地为该局部乳膏、洗剂或软膏的5至15重量％。
将得自菊科植物花朵的花瓣，并且特别是得自万寿菊物种即万寿菊花朵的花瓣进行大规模提取，从而得到的一些叶黄素酯类物质，并制备成含10％的小珠和15％油的混悬液。在这些商业制剂中，玉米黄质酯类是较次要的组分。在水解后，对15％叶黄素酯油性混悬液进行的分析确定了其叶黄素含量为75.7毫克/克，玉米黄质含量为3.9毫克/克和隐黄质(crytoxanthin)含量为0.4毫克/克。[见Cognis Corp.web siteat cognis.com]。
虽然不能进行商业水平的提取，但是已经在包括柑橘、马铃薯、辣椒、柿和桃子在内的其它来源中鉴定出了玉米黄质酯类。已经表明柑橘果汁包含37.6nmol/g玉米黄质酯类和柿子的果实中包含8.57μg/g玉米黄质酯类。[见Wingerath等人，J.Agric.Food Chem.，442006-2013(1996)；Breithaupt等人，J.Agric.Food Chem.507175-7181(2002)；Breithaupt等人，Eur.Food Res.Technol.，21152-55(2000)；Philip等人，J.Food Sci.，53(6)1720-1722，and 1745(1988)；和Khachik等人，J.Agric.Food Chem.，37(6)1465-1473(1989)。]来自上面Wingerath等人论文的数据表明β-隐黄质的脂肪酸酯高于由柑橘制得的浓缩物中类似的玉米黄质酯类并且在将该浓缩物皂化后，β-隐黄质数量远远高于玉米黄质，而这里表6和7的数据表明，在所考虑的由万寿菊属植物制得的浓缩物中，在皂化后，玉米黄质的数量高于β-隐黄质。Wingerath等人的论文还表明在由橘子汁制得的浓缩物中仅存在游离、未被酯化的玉米黄质和β-隐黄质。上面Philip等人的论文提供的数据同样表明β-隐黄质酯的数量远远超过由柿子制得的浓缩物中存在的玉米黄质酯类。
目前可获得的一些万寿菊物种不适用于混合性玉米黄质酯的商业提取，这是由于在花中存在的数量低。但是，可以用具有改变了其中类胡萝卜素分布的万寿菊来提供浓缩物或稀释组合物中的混合性玉米黄质酯。如在上述共同拥有的专利申请中所公开的那样，可以通过各种诱变方法或者用基因工程来产生具有改变了类胡萝卜素分布的植株，从而形成转基因物种。
与使用这类试剂的方法一样，用于改变植物的诱变剂在现有技术中也是众所周知的。化学诱变剂的实例包括亚硝基甲脲(NMU)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍和乙基亚硝基脲，其中优选使用EMS。NMU可以如Cetl等人，Folia Fac.Sci.Nat.Univ.Purkynianae Brun.Biol.，21(1)5-56(1980)所讨论的那样被使用，而EMS一般是以约0.25至约1体积％(v/v)，并且优选约0.2至约0.8体积％的数量被使用的。
除化学突变种外，可以用电离辐射如通过γ射线或中子来使植物突变，从而影响类胡萝卜素分布的改变。已经将γ射线和快中子轰击用于其它一些植物来引起其中一种或多种基因的缺失。当在200至约20,000拉德(0.2至约20千拉德)的剂量下对种子进行辐射时，γ辐射是一种有用的诱变剂。还有一些本领域技术人员众所周知的其它技术。这类突变后的植物因此分别被称为化学诱导的或电离辐射诱导的突变物种。结果，突变种宿主植物如万寿菊在这里被定义为通过化学诱导的突变或电离辐射诱导的突变获得的万寿菊物种。
不管所用的诱变剂是什么，大多数所得突变种物种的表型，包括与类胡萝卜素有关的特性如花瓣中的玉米黄质比例和叶黄质数量通常与亲代的特性基本相同，从而使所得突变种物种中很大百分比的物种是不能用的。此外，必需对看起来具有与亲代的表型相同的植物进行筛选以找出所需的突变种物种。虽然冗长乏味，但是这些筛选是要例行地进行的，并且包括对一个或多个花瓣或叶子或两者中的类胡萝卜素色素进行分析。这样，所需突变种的样本相对较为稀少，但是是可以重复的事件。例如，在这里的一项研究中，由所检查的大约22,000株突变种植株中仅获得二十三株有用的、具有约1∶10或更高的玉米黄质比例的突变种，并且在这二十三株中仅有两株植珠具有高于约9∶1的玉米黄质比例。在另一项研究中，所检查的约8200株植株中仅约43株突变种表现出约1∶10或更高的玉米黄质比例。
可作为混合性玉米黄质酯物质源材料的万寿菊物种可以是由已确定的被诱变植物本身或者杂交的种子生长起来的物种。源性万寿菊物种可以是通过将两种植物的花杂交形成的杂种(M1×M1)，所说的两种植物是由得自独立M1植物的两种不同诱变过的植物生长起来的。它也可以是通过将一种诱变过的植物花朵与未被诱变的植物花朵杂交形成的杂种、或者通过将杂种彼此或者与其直接亲代花朵回交形成的杂种。此外，还可以将两种不同的杂交植物杂交或者可以使杂种自交。根据所需的类胡萝卜素特性对产生出的植株进行筛选和选择。
无需进一步详细说明，相信本领域技术人员可根据前面的描述能在最大程度上利用本发明。因此，下面优选的特定实施方案仅仅是用来进行举例说明，而不是以任何方式对本公开内容的其余部分进行限制。
实施例1万寿菊‘Scarletade’的EMS处理将被命名为‘Scarletade’的万寿菊，即叶黄质万寿菊的种子(通过商业途径得自泛美种籽公司，622 Town Road，West Chicago，IL 60185)用甲磺酸乙酯(EMS，通过商业途径得自Sigma化学品公司，圣路易斯，密苏里州63178)进行处理。将大约2,500粒种子加入到400ml 0.4％(v/v)或0.8％(v/v)EMS中并将其在环境温度下温和搅拌八小时。在EMS处理后的4小时内，将这些种子洗涤十六次，每次用400ml蒸馏水在连续搅拌的情况下进行洗涤。然后，将处理过的被鉴定为M1种子的种子播种到包含无土盆栽混合物的托盘中。
在数周后，将这些幼苗移植到包含无土盆栽混合物的盆中并将其放入温室中。使这些植株产生的花朵天然自花授粉。从大约2,300棵植株收获所得的被鉴定为M2的种子。在这2,300棵植株中，大约1,500棵是由用0.4％EMS处理过的种子长出的；大约800棵植株是由用0.8％EMS处理过的种子长出的。为了帮助进行突变型物种的鉴定，将得自50棵M1植株的M2种子合并成一批，从而得到一共47批种子。在2000年的夏天，将得自这47批每批500粒种子播种并使所得的植株在加州Santa Paula，CA 93060泛美种籽公司的野外生长。
实施例2EMS-处理过的万寿菊‘Scarletade’的HPLC筛选使EMS处理过的‘Scarletade’植物在加州Santa Paula，CA 93060泛美种籽公司的野外生长，并且就改变的玉米黄质比例用HPLC对其进行筛选。选择大约98％都全部开放的花朵来进行分析。从各花朵上从离该花朵中心处三分之一的距离取下一瓣花瓣并将其放到一个包含约5克玻璃珠的3.5″×0.75″的玻璃小瓶中。该小瓶被储存在-80℃之前一直用干冰将其包裹起来。
为了进行分析，用一种包含单注射器阀Gilson 232XL和4022S1V稀释器的机器人系统[Gilson，Inc.USA，3000W.Beltline Highway，Middleton，WI]来完成溶剂传递和等分试样的取样。为进行皂化，向各小瓶中加入3ml 50％氢氧化钾水-乙醇溶液(4水∶1乙醇)，然后向其中加入3ml辛醇。在室温下，用被维持在IKA HS 501水平振荡器[Labworld-online，Inc.Wilmington，NC]上的小瓶在250次运动/分钟的振荡下进行十五小时皂化处理，然后是大约一小时的静止期。
在皂化后，将上清液用0.9ml甲醇稀释。在压力下进行甲醇的加入以确保样品的均匀性。用0.25ml注射器取出0.1ml等分试样并将其转移到用于进行分析的HPLC小瓶中。
为进行HPLC分析，可使用具有四元泵(quaternary pump)、真空脱气系统、六通注射阀、温度受控的自动采样器、柱温箱和光电二极管矩阵检测器的Hewlett Packard 1100型HPLC仪[AgilentTechnologies available through Ultra Scientific Inc.，250Smith Street，North Kingstown，RI]。所用的柱是Waters YMC 30，5-微米，4.6×250mm柱，其具有使用相同材料的预柱[Waters，34Maple Street，Milford，MA]。流动相的溶剂是0.2％BHT(2，6-二-叔-丁基4-甲基苯酚)稳定化的81甲醇∶4水∶15四氢呋喃(THF)。注射量为20μl。在30℃以1.7ml/分钟的流速进行恒溶剂洗脱(isocratic)分离。通过在447nm处的吸光度来测量峰响应。
用这种方案，对由第一批2,546个样品获得的结果进行统计分析以确定叶黄素和玉米黄质含量的平均值。因为这是一种半定量的分析筛选，所以使用峰面积值。为了确定具有高于平均叶黄素和/或玉米黄质浓度的突变种，计算高于均值的三个标准偏差的值。所计算的峰面积均值、标准偏差和玉米黄质比例如下面的表1所示。
表1叶黄素和玉米黄质置信区间计算

根据上面的这些值，选择叶黄素峰面积高于1565和/或玉米黄质峰面积高于91的样品。还可以仅选择叶黄素峰面积高的样品和玉米黄质比例高于10％的样品。用这些选择参数从所分析的21,754个样品中一共确定了88个突变种。由各EMS种子处理产生的突变种的总数如下面表2所示。
表2‘Scarletade’突变种与EMS处理的相关性

就叶黄素和玉米黄质相对水平而言，这些试验更具体的结果如下面的表3所示。
表3所确定的‘Scarletade’突变种

约21,700株植株表现出约4至约7％(约1∶25至约1∶15)的典型玉米黄质比例。上面的数据阐明了所考虑突变的相对稀有性，并且几乎相等数目的植株表现出玉米黄质水平降低。该数据也没有表明这里所用的一种诱变剂水平优于另一种诱变剂水平。
实施例3万寿菊13819的EMS处理将被命名为13819的万寿菊叶黄质万寿菊种子(泛美种籽公司，622Town Road，西芝加哥，伊利诺斯州，IL 60185的专有育种选择)用甲磺酸乙酯(EMS，通过商业途径得自Sigma化学品公司，圣路易斯，密苏里州63178)进行处理。将大约7,000粒种子加入到600ml 0.2％(v/v)或0.4％(v/v)EMS中并将其在环境温度下温和搅拌八小时。在EMS处理后的4小时内，将这些种子洗涤十六次，每次用600ml蒸馏水在连续搅拌的情况下进行洗涤。
然后，将处理过的被鉴定为M1的种子播种到包含无土盆栽混合物的托盘中。在三至四周后，将这些幼苗移植到田地中。将由这些植株产生的花朵用袋子套起来以防止其异花传粉，并使其天然自花授粉。从大约2,391棵植株收获所得的被鉴定为M2的种子。在这些植株中，大约951棵是由0.2％EMS处理过的种子长出的，大约1,440棵是由0.4％EMS处理过的种子长出的。
为了帮助进行突变种植株的鉴定，将得自50棵植株的M2种子合并成一批。这种分组一共得到48批种子。在2000年的十月下旬至十一月中旬，将经过0.4％EMS处理过的15批种子中每批选取1000粒种子播种，并使每批的700棵植株在Seaview Nursery in El Rio，CA93060的温室中进行生长。此外，将所有48批种子中每批选取1,500粒种子在2000年十月末播种，并且使每批的765棵植株在Semillas PanAmerican Chile LTDA，in Pichidegua，Chile的野外进行生长。
实施例4EMS-处理的万寿菊13819的HPLC筛选使EMS-处理的13819 M2植株在Seaview Nursery in El Rio，CA93060的温室中进行生长和在Semillas PanAmerican Chile LTDA，inPichidegua，Chile的野外进行生长，并且就改变的玉米黄质比例对其进行筛选。选择大约98％都全部开放的花朵来进行分析。从这些花朵上离该花朵中心处三分之一的距离取下一些花瓣。将大约100mg花瓣组织放入塑料袋中并将其冷冻储存直至进行分析。测定被放到包含约5克玻璃珠的3.5″×0.75″玻璃小瓶中的两瓣花瓣的干重。
为了进行分析，用一种包含单注射器阀Gilson 232XL和4022S1V稀释器的机器人系统来完成溶剂传递和等分试样的取样。为进行皂化，向各小瓶中加入3ml 50％氢氧化钾水-乙醇溶液(4水∶1乙醇)，然后向其中加入3ml辛醇。在室温下，用被维持在IKA HS 501水平振荡器上的小瓶在250次运动/分钟的振荡下进行十五小时皂化处理，然后是大约一小时的静止期。
在皂化后，将上清液用0.9ml甲醇稀释。在压力下进行甲醇的加入以确保样品的均匀性。用0.25ml注射器取出0.1ml等分试样并将其转移到用于进行分析的HPLC小瓶中。
为进行HPLC分析，可使用具有四元泵(quaternary pump)、真空脱气系统、六通注射阀、温度受控的自动采样器、柱温箱和光电二极管矩阵检测器的Hewlett Packard 1100型仪器。所用的柱是WatersYMC 30，5-微米，4.6×250mm柱，其具有使用相同材料的预柱。标准品得自DHI-Water & Environment，DK-2970 Horsholm，丹麦和Sigma化学品公司，圣路易斯，密苏里州63178。流动相的溶剂是0.2％BHT稳定化的81甲醇∶4水∶15四氢呋喃。注射量为20μl。在30℃以1.7ml/分钟的流速进行恒溶剂洗脱(isocratic)分离。通过在447nm处的吸光度来测量峰响应。
用这种方案，对由第一批507个样品获得的结果进行统计分析以确定叶黄素和玉米黄质含量的平均值。为了确定具有高于或低于平均叶黄素和玉米黄质浓度的突变种，计算高于或低于均值的三个标准偏差的值。所计算的均值、标准偏差和玉米黄质比例如下面的表4所示。
表4叶黄素和玉米黄质置信区间计算

根据上面的值，选择具有高于10％的玉米黄质比例、高于1.12mg/g鲜重汇合的叶黄素和玉米黄质含量以及低于0.24mg/g鲜重汇合的叶黄素和玉米黄质含量的样品。用这些选择参数从8192个样品中一共鉴定出347个叶黄素+玉米黄质的和高于1.12mg/g的突变种，以及43个具有高于10％的玉米黄质比例的突变种。由每批经EMS种子处理产生的突变种的总数如下面的表5所示。
表513819突变种与EMS处理的相关性

在具有高于约10％玉米黄质的玉米黄质比例的突变种中，约47％植株的该比例值为10至13％，而53％呈现出13％或更高的值。
实施例5选择的万寿菊属植物花瓣中的类胡萝卜素组成测定了选自用实施例2所述筛选方法确定的那些植物的‘Scarletade’野生型和突变种样品的类胡萝卜素组成。将花瓣样品存储在-80℃的冷冻器中直至对这些突变种进行确定。将这些样品冷冻干燥，并将被干燥的组织在-80℃储存在氩气下直至进行分析。
在红光下进行提取操作。干燥的花瓣被研磨，使其通过40号筛的网孔。研磨过的样品精确称重并将其转移到一个100ml的红色容量瓶中。向该样品中加入500微升(μl)H2O并将该混合物旋动1分钟。向其中加入30ml提取溶剂(10ml己烷+7ml丙酮+6ml无水乙醇+7ml甲苯)并将该烧瓶在160rpm下振摇10分钟。
为了进行皂化，向该烧瓶中加入2ml 40％KOH的甲醇溶液，然后将其旋动1分钟。将该烧瓶在56℃的H2O浴上放置20分钟。连接空气冷凝器以防止溶剂的逸失。与所连接的冷凝器一起将该样品在黑暗中冷却一小时。在冷却后，向其中加入30ml己烷，然后将该烧瓶在160rpm下振摇10分钟。
用10％硫酸钠溶液将振摇过的样品稀释至一定体积(100ml)并再次剧烈振摇1分钟。将该样品在黑暗中再至少放置30分钟。从大约50ml上部相中取出35ml等分试样并将其转移到样品杯中。再向该烧瓶中加入30ml己烷，然后将其在160rpm下振摇10分钟。在大约1小时后，将上部相合并。为了进行HPLC分析，将10ml等分试样在氮气下干燥并将其在氩气下存储在-80℃。
HPLC装置为配有冷却自动采样器、柱加热器和Waters光电二极管阵列996检测器的Alliance 2690(Waters Corp.，34 Maple StreetMilford，MA 01757)。用具有相同材料预柱的YMC C30柱，3μm，2.0×150mm进行分离。标准品得自ICC Indofine Chemicals Somerville，新泽西088876和得自DHI-Water & Environment，DK-2970Horsholm，丹麦。
将干燥过的突变种样品重新混悬于四氢呋喃和甲醇中至200μl的总体积并将其过滤，而对照样品不另外进行浓缩。用梯度方法来分离类胡萝卜素。初始的梯度条件为90％甲醇∶5％水∶5％甲基叔-丁基醚，流速为0.4毫升/分钟(ml/min)。从0至15分钟，将流动相从初始条件变为80甲醇∶5水∶15甲基叔-丁基醚，从15至60分钟，变成20甲醇∶5水∶75甲基叔-丁基醚。接下来的10分钟，流动相回复至初始条件并且将该柱平衡另外10分钟。柱温维持在27℃并且流速为0.4ml/分钟。注射量为10μl。大多数峰响应是在450nm波长下进行测量的，并且从286、348、400和472nm提取通道(extracted channel)加入另外的面积。
所选择突变种的类胡萝卜素分布如下面的表6a、6b和6c所示，使用的峰面积值为所占总面积的百分数。所示化合物的鉴定基于所提取的光谱和各色谱中主要峰在乙醇中的最大吸收(lambda maxima，λmax；ETOH)，其中一些峰是用已知标准品的保留时间来证实的。这些值结合了相同化合物一些可疑的异构体。一些化合物可能包含少量杂质。表中包含Quackenbush等人，J.Assoc.Off.Anal.Chem.，55(3)617-621(1972)所述的黄色美国万寿菊(American marigolds)(黄色万寿菊)的值。在表6a-6c中使用了用于不能用这里的方法分离的新黄质/堇菜黄质和菊黄质/毛莨黄素化合物对的单一列表值。
表6a万寿菊和突变种花瓣中类胡萝卜素分布的相对％

*nf＝未发现**nr＝未报告表6b万寿菊和突变种花瓣中类胡萝卜素分布的相对％

*nf＝未发现**nr＝未报告表6c万寿菊和突变种花瓣中类胡萝卜素分布的相对％

*nf＝未发现**nr＝未报告实施例6通过突变种的育种进行的具有低叶黄素和高玉米黄质、八氢番茄红素、番茄红素或β-胡萝卜素水平的万寿菊的制备使与野生型相比呈现出玉米黄质对叶黄素比例增加的万寿菊突变种精选品124-257发生自交，并保留所得的种子。用由万寿菊精选品124-257自交获得的植株作为与母本PanAmerican Seed专有育种系F9Ap(85368-4)杂交中的父本。由这种杂交产生出F1植株并使其自交，从而得到F2种群。
用薄层色谱(TLC)对得自F2杂交的十五株幼苗进行叶黄素的缺乏的分析。将大约50mg得自各幼苗的新鲜叶组织称重到一个包含五个玻璃珠的100×13mm的顶部有螺旋的管中。密封后的小瓶储存在-20℃。
为了进行分析，向其中加入500μl提取溶剂(10ml己烷+7ml丙酮+6ml无水乙醇+7ml甲苯)并将该密封管至少旋动45分钟。在旋动后，将该溶液转移到一个4ml的琥珀色小瓶中并在氮气下对其进行蒸发。将这些样品重新混悬于125μl上述提取溶剂中，将10μl样品点样到19槽硅胶板上。将这些板干燥约10分钟，然后将其在包含100ml 2∶1的乙酸乙酯∶己烷溶液的25cm两通道展开槽中展开25分钟。在取出时，对样品叶黄素的缺乏程度进行评估。
由这种筛选确定出了F2万寿菊精选品14649-3。这种精选品被用作与突变种101-190和100-198杂交的母本，与野生型相比，除具有降低的环氧类胡萝卜素(epoxycarotenoid)(例如新黄质和堇菜黄质)产量外还表现出玉米黄质对叶黄素比例的增加。
使万寿菊突变种精选品100-198自交并保留所得的种子。用由万寿菊精选品100-198自交获得的植株作为与上述母本精选品14649-3杂交的父本。由这种杂交收集F1种子并将其中的30粒种子栽种。使所得植株中的十一株植株自交。从这种杂交收集F2种子，将其中的400粒种子栽种并使其生长。
如上述那样，用TLC分析来对151株幼苗的叶子进行分析。在突变种精选品100-198中典型地表现出环氧类胡萝卜素产量降低的基础上鉴定出三十二株植株。用高效液相色谱(HPLC)来对剩余的TLC提取物进行分析，用修改后的实施例5方案进行操作。修改包括下列方面将干燥的样品重新混悬于甲基叔-丁基醚和甲醇中，所有的梯度条件都使用增加至6％的水，同时甲醇相应地降低1％，并且将柱温维持在25℃。
分析证明32棵植株中的七株表现出突变种精选品124-257典型的玉米黄质对叶黄素比例的增加。对所说七株精选品的花瓣和叶子样品进行提取并按照上述修改后的实施例5方案对其进行分析。对花瓣进行分析的结果如下面的表7a所示。此外，对未进行皂化的花瓣样品进行分析以确定，如果有的话，任何未被酯化的玉米黄质的百分比。这些数据被列在表9中。
使万寿菊突变种精选品101-190自交并保留所得的种子。用万寿菊精选品101-190作为与上述母本精选品14649-3杂交的父本。由这种杂交收集F1种子并栽种其中的30粒种子。使所得植株中的六棵植株自交。从这种杂交收集F2种子，将其栽种并使其生长。
已经确定通常的TLC分析方法对这种种群无效果。因此，在具有橙色萼片表型的基础上选择大约30棵植株进行HPLC分析。
如TLC那样对这些样品进行提取，但是进行HPLC分析。发现这30株精选品种的十株除具有精选品124-257典型的玉米黄质对叶黄素比例值增加以外，还具有突变种精选品101-190典型的环氧类胡萝卜素产量的降低。
对这十株精选品的花瓣和叶子样品进行提取，并用上述修改后的实施例5的方案进行分析。花瓣的分析结果如表7b和7c所示。此外，对未被皂化的花瓣样品进行分析以确定未被酯化的玉米黄质的百分比。这些数据被列于表8中。
表7a万寿菊和突变种杂交物花瓣中类胡萝卜素分布的相对％

表7b万寿菊和突变种杂交物花瓣中类胡萝卜素分布的相对％

表7c万寿菊和突变种杂交物花瓣中类胡萝卜素分布的相对％

表8万寿菊和突变种杂交物花瓣中未被酯化的玉米黄质的相对％

实施例7混合性玉米黄质酯的精制用配有陶瓷滤器的玻璃柱、用8升己烷对1千克干燥的万寿菊花冠进行渗漉，所说的万寿菊花冠用索格利特提取法获得等分试样，随后在445nm下用分光光度法对其进行测量时具有1.0重量％的混合性玉米黄质酯含量，所说的波长是其最大光学吸收波长。在真空下于60℃蒸发掉所得提取溶液中的己烷。得到35克含油树脂，在用HPLC峰面积进行测定时，其中混合性玉米黄质酯含量为9.0％。
将该含油树脂在20℃下与100ml异丙醇一起搅拌3小时。将所得的混悬液用滤纸过滤并在环境温度下在真空下除去溶剂。使所得的固体在65℃下熔化并将其倾倒到一个模具中。在冷却3小时冷却至室温后，得到一根重5克并具有约16重量％混合性玉米黄质酯含量(在己烷中用分光光度法测得)的混合性玉米黄质酯棒。或者，将该混合性玉米黄质浓缩物研磨成颗粒状。
本文所引用的各专利和文章都被并入本文作为参考。所用的冠词“一(“a”或“an”)”指的是包括一个或多个。
上述描述和实施例是用于进行说明，不应将其看成限制。还可以在本发明的主旨和范围内进行其它改变，并且这些改变对本领域技术人员而言将是显而易见的。
权利要求
1.包含混合性玉米黄质C8-C20羧酸酯的精制类胡萝卜素浓缩物，其中所说的混合性玉米黄质酯占所说浓缩物的约50mg/g或更多并且在皂化后进行分析时，其中所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约20％或更多。
2.如权利要求1所述的类胡萝卜素浓缩物，其中所说的玉米黄质酯类是单酯化的玉米黄质、二酯化的玉米黄质或其混合物。
3.如权利要求1所述的类胡萝卜素浓缩物，其中所说混合性玉米黄质酯的酸部分包括多种选自棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、月桂酸、棕榈油酸、十五烷酸和癸酸的酸。
4.如权利要求1所述的类胡萝卜素浓缩物，其中当在皂化后进行分析时，所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约25％或更多。
5.如权利要求1所述的类胡萝卜素浓缩物，其中所说的总类胡萝卜素包括至少一种另外的游离或被酯化形式的类胡萝卜素。
6.如权利要求5所述的类胡萝卜素浓缩物，其中所说的另外的类胡萝卜素选自胡萝卜素、叶黄质、单酯化的叶黄质、二酯化的叶黄质以及其混合物。
7.如权利要求1所述的类胡萝卜素浓缩物，其中所说的混合性玉米黄质酯是由菊科植物提取的。
8.如权利要求7所述的类胡萝卜素浓缩物，其中所说的混合性玉米黄质酯是由万寿菊中提取的。
9.一种包含溶解或分散于可食用的稀释剂中的混合性玉米黄质C8-C20羧酸酯的稀释的精制类胡萝卜素组合物，其中所说的混合性玉米黄质酯占所说稀释组合物的约10mg/g或更多并且在皂化后进行分析时，其中所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约20％或更多。
10.如权利要求9所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的可食用的稀释剂是油。
11.如权利要求9所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的组合物以被包封于小珠中的形式存在。
12.如权利要求9所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的玉米黄质酯类是单酯化的玉米黄质、二酯化的玉米黄质或其混合物。
13.如权利要求9所述的类胡萝卜素组合物，其中所说混合性玉米黄质酯的酸部分包含多种选自棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、月桂酸、棕榈油酸、十五烷酸和癸酸的酸。
14.如权利要求9所述的类胡萝卜素组合物，其中当在皂化后进行分析时，所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约25％或更多。
15.如权利要求9所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的总类胡萝卜素包括至少一种另外的游离或被酯化形式的类胡萝卜素。
16.如权利要求15所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的另外的类胡萝卜素选自胡萝卜素、叶黄质、单酯化的叶黄质、二酯化的叶黄质以及其混合物。
17.如权利要求9所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的混合性玉米黄质酯是由菊科植物提取的。
18.如权利要求9所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的混合性玉米黄质酯是由万寿菊中提取的。
19.一种适于口服施用的组合物，其包含溶解或分散于可食用的稀释剂中的混合性玉米黄质酯，并以营养有效量存在于单位剂型中。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所说的单位剂型包括颗粒制剂。
21.如权利要求19所述的组合物，其中所说的营养有效量是足以治疗或预防黄斑变性或白内障形成的数量。
22.如权利要求19所述的组合物，其中所说的营养有效量是足以预防癌症的数量。
23.如权利要求19所述的组合物，其中所说的营养有效量是足以治疗或预防自由基介导的疾病的数量。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所说的自由基介导的疾病选自炎性-免疫性损伤、酒精损害、放射损伤、过早老化病症、与年龄有关的免疫缺陷、癌症、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、老年痴呆、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病(MPTP)、肌肉硬化、白内障形成、变性性视网膜损害和太阳辐射。
25.如权利要求19所述的组合物，其中所说的营养有效量为约2毫克或更高。
26.适宜哺乳动物消费的食物或饮料，其包含溶解或分散于可食用稀释剂中的并以营养有效量存在的混合性玉米黄质酯添加剂。
27.如权利要求26所述的食物或饮料，其中所说的营养有效量为每份约0.5毫克至约8毫克。
28.如权利要求26所述的食物或饮料，其中所说的食物是宠物食品。
29.如权利要求26所述的食物或饮料，其中所说的食物是医学食品。
30.如权利要求29所述的医学食品，其中所说的营养有效量是足以治疗或预防黄斑变性或白内障形成的数量。
31.如权利要求29所述的医学食品，其中所说的营养有效量是足以预防癌症的数量。
32.如权利要求29所述的医学食品，其中所说的营养有效量是足以预防自由基介导的疾病的数量。
33.如权利要求32所述的医学食品，其中所说的自由基介导的疾病选自炎性-免疫性损伤、酒精损害、放射损伤、过早老化病症、与年龄有关的免疫缺陷、癌症、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、老年痴呆、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病(MPTP)、肌肉硬化、白内障形成、变性性视网膜损害和太阳辐射。
34.如权利要求29所述的医学食品，其中所说的营养有效量是在单次或多次施用时足以提供每天高至约40mg的数量。
35.一种包含溶解或分散于美容可接受的稀释剂中的混合性玉米黄质C8-C20羧酸酯的稀释的精制类胡萝卜素组合物，其中所说的混合性玉米黄质酯占所说稀释组合物的约10mg/g或更多，并且在皂化后进行分析时，所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约20％或更多。
36.如权利要求35所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的玉米黄质酯是单酯化的玉米黄质、二酯化的玉米黄质或其混合物。
37.如权利要求35所述的类胡萝卜素组合物，其中所说混合性玉米黄质酯的酸部分包含多种选自棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、月桂酸、棕榈油酸、十五烷酸和癸酸的酸。
38.如权利要求35所述的类胡萝卜素组合物，其中当在皂化后进行分析时，所说的玉米黄质为存在的总类胡萝卜素的约25％或更多。
39.如权利要求35所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的总类胡萝卜素包括至少一种另外的游离或被酯化形式的类胡萝卜素。
40.如权利要求39所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的另外的类胡萝卜素选自胡萝卜素、叶黄质、单酯化的叶黄质、二酯化的叶黄质以及其混合物。
41.如权利要求35所述的类胡萝卜素组合物，其中所说的混合性玉米黄质酯是由菊科植物提取的。
42.如权利要求41所述的类胡萝卜素，其中所说的混合性玉米黄质酯是由万寿菊中提取的。
43.局部的乳膏、洗剂或软膏，其包含溶解或分散于稀释剂中并以光保护有效量存在的混合性玉米黄质酯。
全文摘要
公开了混合性玉米黄质C
文档编号C12N15/82GK1832737SQ200480021539
公开日2006年9月13日 申请日期2004年5月18日 优先权日2003年6月3日
发明者R·豪普特曼, M·帕丰, A·查尔斯 申请人:克里桑蒂斯公司