专利名称：采用再循环微生物制备木糖醇的高产率方法
技术领域：
本发明涉及一种通过在真空微量过滤生物反应器中对浓缩菌株进行再循环培养，由木糖连续生产木糖醇的高产率工艺。
背景技术：
木糖醇由化学家Emil Fisher于1981年首次报导，其为具有五个碳原子的糖醇，自1960年就被用作甜料。木糖醇在天然植物中被发现存在的量很少，例如水果，蔬菜以及蘑菇，并且是哺乳动物碳水化合物新陈代谢的媒介。此外，由于其甜度与蔗糖相等，并且其在分解时吸收热量，木糖醇在口腔中使人感觉凉爽及清新的感觉。因此，木糖醇用作不含糖的糖果产品的原料。特别的，由于其在摄入后不需要胰岛素起代谢作用，木糖醇可用作糖尿病患者的糖替代品。
木糖醇可通过抑制引起牙齿腐蚀的链球菌属突变体的生长来防止产生龋齿，因此，木糖醇用作牙膏的原料。此外，木糖醇不参与梅拉德反应(Maillard反应)，而且是一种单糖，因此与蔗糖不同，不经过转化。因此木糖醇不存在降解的风险，即使是在酸性环境下使用。此外，木糖醇具有低至95℃的沸点，因而可在不变性的情况下达到其沸点。因此，当用作糖衣时，木糖醇不特别要求溶解于水中。
木糖醇通过对取自植物的半纤维素的水解产物进行化学还原进行工业生产，例如白桦树、玉米棒子等，或者采用微生物菌株将所述水解产物生物转化成木糖醇。然而，关于化学生产方法，木糖或木糖醇从其它由半纤维素碎片衍生的水解产物中的分离和纯化很困难，并且木糖或木糖醇的产量低至50-60％。而且，引起一些问题，例如高温高压反应的风险以及由于碱的使用而带来的废物处理问题。为了解决这些问题，已经报导了采用微生物菌株进行工业规模的木糖醇生产。采用微生物菌株进行木糖醇生产具有成本效益，并能够选择性地将木糖转化成木糖醇，从而有利于木糖醇的分离和纯化。然而，其缺点在于，木糖醇产率低至2.0-3.0g/l-h，而且微生物菌株只能使用一次。由于这种原因，一旦培养结束，常规的木糖醇生产技术涉及用于再培养的制备步骤，例如洗涤与灭菌，从而使生产成本增加。
在使用假丝酵母菌属菌株的木糖醇生产中，主要含有木糖的木糖或者半纤维素水解产物被用作碳源。作为氮源，使用含有各种维生素的复合氮源，例如酵母提取物、麦芽提取物、大豆粗粉等。这是因为假丝酵母菌属菌株是相对复杂的营养缺陷型，因而在化学合成培养基中几乎不产生木糖醇。在这方面，昂贵的复合培养基的使用就变成了增加木糖醇成本原因。
因此，为了解决上述采用微生物菌株的木糖醇生产问题，本发明开发了一种在化学成分确定的培养基中通过培养的微生物菌株的培养物来生产木糖醇的工艺。根据这种工艺，所述微生物菌株在从培养物中分离之后浓缩并进行再循环。这种木糖醇生产工艺可用于自动化的连续培养系统，由于简化了培养过程并连续生产木糖醇，从而使生产成本降低。本申请的发明人由此完成了本发明。
发明内容
考虑到这些问题，本发明提供了一种化学成分确定的培养基，其用于产生木糖醇的假丝酵母菌属菌株的培养。
本发明还提供了一种采用微生物菌株高产量生产木糖醇的工艺，其中菌株和培养滤液从培养物中分离，并且菌株被浓缩用于再循环。
按照本发明的一个方面，提供了一种用于发酵培养假丝酵母菌属菌株的化学成分确定的培养基，其包括1-10g/l的尿素，1-10g/l的二磷酸钾、0.01-1g/l的硫酸镁，0.1-10mg/l的MnSO4·4H2O，0.1-10mg/l的CoCl2·6H2O，0.1-10mg/l的NaMoO4·2H2O，0.1-10mg/l的ZnSO4·7H2O，0.1-10mg/l的AlCl3·6H2O，0.1-10mg/l的CuCl2·2H2O，0.01-5mg/l的H3BO3，1-100mg/l的FeSO4·7H2O，0.1-10mg/l的抗坏血酸，1-100mg/l的生物素，1-100mg/l的胆碱，和0.1-10mg/l的维生素B6。
按照本发明的另一方面，提供了一种通过将假丝酵母菌属菌株再循环培养来高产量生产木糖醇的工艺，其包括将菌株接种在含木糖的培养基中，并在生物反应器中培养在木糖培养基中的菌株；从所述生物反应器中释放培养物并将新配制的含木糖培养基引入到所述生物反应器中；从所述培养物中分离菌株和培养滤液；以及将菌株再循环到生物反应器中并从培养滤液中回收木糖醇。
所述假丝酵母菌属菌株可以是热带假丝酵母(Candida tropicalis)或者其变异菌株。
在本发明中使用的所述含木糖的培养基可以是上述化学成分确定的培养基(此后简单称之为“化学培养基”)，或者含有例如酵母提取物、麦芽提取物和大豆粗粉的复合氮源的复合培养基。然而，考虑到效率成本，例如生产成本，优选采用化学培养基。此时，木糖或者主要包括木糖的半纤维素水解产物用作碳源。
为了利于菌株的生长，所述化学培养基可辅以1-200mg/l叶酸，1-100mg/l的环己六醇，1-100mg/l的尼克酸，0.1-10mg/l的对氨基苯甲酸(p-aminobezoicacid)，1-100mg/l的泛酸，10-1000mg/l的核黄素，和1-100mg/l的维生素B1。
在本发明的生产工艺中，所述菌株通过补料分批培养法或分批培养法进行培养。
关于菌株的补料分批培养法，优选地，在培养基中逐渐补充木糖作为碳源，使木糖的浓度保持在40-50g/l(以培养基为基础)的水平。此时，以400-600rpm的速度进行搅拌。
同时，通过真空微量过滤系统或者离心将释放的培养物分离成菌株和培养物滤液。特别地，利用自动系统，优选使用真空微量过滤系统。真空微量过滤系统可以独立地与生物反应器连接或者安装于生物反应器中。
将从培养物中分离的菌株浓缩并再循环。优选地，所述菌株浓缩到浓度为10-100g/l培养基。
此后，将参照附图，更详细的描述按照本发明的用于高产量生产木糖醇的工艺的优选实施例。
然而，提供的这些实施例仅用于说明，而不限定本发明。
首先，本发明的整个生产工艺将参照图4简要描述，其图示了装备有真空微量过滤系统的生物反应器。
参见图4，在生物反应器10中培养微生物菌种。通过蠕动泵20将产生的培养物传送到微量过滤系统30中。此时，为了方便过滤，强迫性地将空气经进气口(未显示)供应到微量过滤系统30中。在供给空气过程中，当与固定在微量过滤系统30两侧上的中空纤维膜(未显示)连接的真空泵40运转时，在微量过滤系统30中通过压滴引起压差。由于所述压差，允许培养物通过固定在微量过滤系统30两侧上的中空纤维膜。此时，没有通过中空纤维膜的菌株浓缩在中空纤维膜的下部，然后通过用于再培养的蠕动泵20再循环到生物反应器10中。通过中空纤维膜的培养滤液通过真空泵40传送到培养罐50中，由此通过通用纯化工艺来产生木糖醇。
同时，当微量过滤系统30中的过滤完成时，以与培养物流动方向相反的方向将少量新鲜培养基加入到中空纤维膜中，以从中空纤维膜中除去菌株。然后，通过蠕动泵20将菌株再循环到生物反应器10中，并通过供给空气使中空纤维膜恢复到以前的状况。其后，在含有新鲜培养基的生物反应器10中再次进行培养，作为参照，数字11。
培养状态通过底物(木糖)浓度，产物(木糖醇)浓度以及转换成干重的菌株浓度来确定。此时，优选按照标准曲线法采用浊度计(tubidimeter)来测定菌株浓度。
附图简述
图1是表示木糖醇产率与热带假丝酵母细胞在本发明的化学培养基中的补料分批培养时间关系的曲线图；图2是表示木糖醇产率与热带假丝酵母细胞在复合培养基中的补料分批培养时间关系的曲线图；图3是表示对在本发明的化学培养基中初级培养的热带假丝酵母细胞进行离心，木糖醇产率与再循环培养时间关系的曲线图；图4是表示按照本发明的优选实施例的通过细胞再循环用于高产量木糖醇生产的仪器的模式图(生物反应器10；蠕动泵20；微量过滤系统30；中空纤维膜32；真空泵40；培养罐50；压缩机60；出风口12、31)；图5是表示对在本发明的化学培养基中初级培养的热带假丝酵母细胞进行真空微量过滤，木糖醇产率与再循环培养时间关系的曲线图；图6是表示对在复合培养基中初级培养的热带假丝酵母细胞进行真空微量过滤，木糖醇产率与再循环培养时间关系的曲线图；以及图7是表示对在本发明的化学培养基中初级培养的热带假丝酵母细胞进行压缩微量过滤，木糖醇产率与再循环培养时间关系的曲线图。
具体实施例方式
实验实施例木糖和木糖醇的浓度采用装配有Sugar-Pak I柱(Millipore，USA)的HPLC(Shimadzu C-R6A，Japan)折光率探测器(Shimadzu RID-6A，Japan)来测定。此时，用作溶剂的水可以在70℃以0.6ml/min的速率流动。细胞浓度通过在600nm下采用浊度计测定浊度，并将该值与事先制备的标准曲线的值进行比较，在所述标准曲线中浊度与细胞干重相关。溶解的氧浓度采用溶解氧电极(极谱型，Ingold Switzerland)来测定。
实施例1化学培养基种子培养将发表的热带假丝酵母细胞接种于装在250ml烧瓶中的50ml生长培养基上，在240rpm 30℃的条件下培养10小时。
主培养物将种子培养物引入到装有2L化学培养基的7L发酵罐(Biotron Ltd)中并培养，所述化学培养基包括150g/l木糖，5g/l尿素，5g/l的二磷酸钾，0.2g/l的硫酸镁，金属盐(7mg/l的MnSO4·4H2O，4mg/l的CoCl2·6H2O，2mg/l的NaMoO4·2H2O，2mg/l的ZnSO4·7H2O，1mg/l的AlCl3·6H2O，2mg/l的CuCl2·2H2O，0.5mg/l的H3BO3，40mg/l的FeSO4·7H2O)，以及维生素(5mg/l的抗坏血酸，10mg/l的生物素，25mg/l的胆碱，50mg/l的叶酸，10mg/l的环己六醇，25mg/l的尼克酸，1mg/l的对氨基苯甲酸(p-aminobezoic acid)，5mg/l的泛酸，1mg/l的维生素B6，100mg/l的核黄素，25mg/l的维生素B1)。补料分批培养以下述方式进行在发酵期间，将1L含有510g木糖的溶液连续补充到发酵培养基中，使最终培养物的体积保持在3L，也就是说，是加入的木糖总浓度保持在270g/l。发酵条件如下搅拌速度为400rpm，整个发酵过程中的pH为5.0，发酵温度为30℃，并且通风速率为1.0vvm。测定相对于发酵时间的木糖醇产率，结果显示于图1中。参见图1，发酵120小时后，从270g/l木糖得到240g/l木糖醇。结果，由木糖生产木糖醇的收率为89％，木糖醇的产率为2.0g/l-h。这些结果显示就木糖醇生产而言，可采用便宜的化学成分确定的培养基代替传统的木糖醇生产培养基。
比较实施例1复合培养基种子培养将发表的热带假丝酵母KCTC 7221细胞接种于装在250ml烧瓶中的50ml生长培养基上，在240rpm 30℃的条件下培养10小时。
主培养将种子培养物引入装有2L的复合培养基的7L发酵罐中并培养，所述复合培养基由150g/l木糖，10g/l酵母提取物，5g/l的二磷酸钾，0.2g/l的硫酸镁组成。补料分批培养以下述方式进行在发酵期间，将1L含有510g木糖的溶液连续补充到发酵培养基中，使最终培养物的体积保持在3L，也就是说，是加入的木糖总浓度保持在270g/l。发酵条件如下搅拌速度为400rpm，整个发酵过程中的pH为5.0，发酵温度为30℃，并且通风速率为1.0vvm。测定相对于发酵时间的木糖醇产率，结果显示于图2中。参见图2，发酵108小时后，从270g/l木糖得到230g/l木糖醇。结果，由木糖生产木糖醇的收率89％，木糖醇的产率为2.0g/l-h。
实施例2通过离心对细胞进行再循环培养在与实施例1中相同的化学培养基中进行培养，在木糖即将耗尽之前，立即将培养物以5000rpm的速度离心20分钟。将收集的细胞接种到2L的新配制的化学培养基上并进行再培养。此时，培养条件与实施例1中相同，并且木糖和木糖醇的浓度以与上述实验实施例相同的方式进行测定。
离心之前2L初级培养物含有218g/l的木糖醇。此时，木糖醇产率为2.3g/l-h，并且木糖醇相对木糖的收率为74％。作为14轮再循环的结果，通过离心，从28L全培养物中得到3076g木糖醇，木糖醇的产率和收率分别为5.4g/l-h和82％(见图3)。
与初级培养相比，通过离心14轮再循环培养后的产量、产率和木糖醇的收率，分别增加了14倍、2.4倍和8％。
通过上述结果，可以看出，与传统的分批培养相比，通过本发明的细胞再循环，木糖醇的生产效率是非常显著的。
实施例3通过真空微量过滤对细胞进行再循环培养(化学培养基)
在含有与实施例1相同的化学培养基的生物反应器中进行培养之后，在木糖即将耗尽之前，将培养物转移到与生物反应器连接的真空微量过滤系统中，以分离耗尽的细胞和培养物滤液。用过的细胞再循环到含有2L新配制的化学培养基的生物反应器中并进行再培养。培养条件与实施例1相同(见图4)。
此时，为真空微量过滤系统提供聚乙烯制成的中空纤维膜(孔隙率为0.45μm，Mitsubishi Rayon，Japan)。所述中空纤维膜与真空微量过滤系统两侧的硅管都连接。通过真空纤维膜，在由泵建立的真空中进行微量过滤。在与上述实验实施例相同的方式测定木糖醇的浓度。
离心之前2L初级培养物含有194g/l的木糖醇。此时，木糖醇产率为2.0g/l-h，并且木糖醇相对木糖的收率为72％。作为通过微量过滤的8轮再循环培养的结果，从16L全培养物中得到2026g木糖醇，木糖醇的产率和收率分别为5.8g/l-h和87％。与初级培养相比，通过微量过滤8轮再循环培养后的产量、产率和木糖醇的收率，分别增加了10.4倍、2.9倍和15％。(见图5)。
比较实施例2通过真空微量过滤对细胞进行再循环培养(复合培养基)在含有与比较实施例1相同的复合培养基的生物反应器中，在与实施例1中相同的培养条件下进行培养之后，在木糖即将耗尽之前，将培养物转移到与生物反应器连接的真空微量过滤系统中，以分离耗尽的细胞和培养物滤液。分离的细胞再循环到含有2L新配制的化学培养基的生物反应器中并再培养。此时，使用的真空微量过滤系统与实施例3中相同。
微量过滤之前2L初级培养物含有118g/l的木糖醇。此时，木糖醇产率为2.5g/l-h，并且木糖醇相对木糖的收率为79％。作为通过微量过滤的7轮再循环培养的结果，从14L全培养物中得到972g木糖醇，木糖醇的产率和收率分别为5.4g/l-h和85％。与初级培养相比，通过微量过滤，8轮再循环培养后的产量、产率和木糖醇的收率，分别增加了8.2倍、2.2倍和6％。(见图6)。
通过实施例3与比较实施例2的比较结果可以看出，化学培养基比复合培养基更适于再循环培养。
比较实施例3通过真空微量过滤对细胞进行再循环培养(化学培养基)在含有与实施例1相同的复合培养基和培养条件下培养之后，在木糖即将耗尽之前，采用加压微量过滤系统(孔隙率为0.65μm，AmershamBiosciences，CFP-6-D-4MA)，以实施例3中相同的方式将用过的细胞和培养物滤液分离，用过的细胞进行再循环，回收培养物滤液以测定培养物滤液中的木糖醇浓度。
如图7所示，微量过滤之前2L初级培养物含有110g/l的木糖醇。此时，木糖醇产率为2.3g/l-h，并且木糖醇相对木糖的收率为73％。作为通过微量过滤的2轮再循环培养的结果，从4L全培养物中得到179g木糖醇，木糖醇的产率和收率分别为2.7g/l-h和60％。与初级培养相比，通过微量过滤，2轮再循环培养后木糖醇产品的产量，和产率分别增加了1.6倍、1.2倍，但木糖醇的收率减少了13％。
通过上述结果可以判断，在加压微量过滤系统中通过加压会使一些细胞破碎。
实施例4在含有与实施例1相同的培养基和培养条件下进行培养，同时在2-5L的范围内改变培养基的体积。在真空微量过滤系统中将细胞浓缩到不同密度然后再循环。
将浓缩的细胞接种到新配制的化学培养基上(每个2L)并再次培养8小时。测定相对于细胞密度的木糖醇的总产率和具体产率，结果概述于下表1中。
此时，通过将8小时累计的木糖醇浓度除以8小时来计算木糖醇的总产率，通过总产率除以使用的细胞浓度来计算木糖醇的单位生产率。
结果，当细胞浓度为35g/l时，木糖醇产率为10.2g/l，收率为85％，得到最好的结果。
图1
从表1中可以看出，与48小时平均产生97g/l木糖醇(总产率为2.0g/l-h)的普通培养相比，浓缩细胞通过真空微量过滤进行的再循环培养可提供高5倍的木糖醇产率和高10％的木糖醇收率。
工业实用性通过上述描述，很明显，本发明提供了一种高产量的从木糖连续生产木糖醇的工艺，其通过将微生物菌株在化学成分确定的培养基中培养，在真空微量过滤生物反应器或者离心机中浓缩菌株，并对浓缩的菌株进行再循环。
因此，本发明的生产工艺可应用于自动化生产系统，并降低了培养前的准备过程的成本，这与普通发酵工艺不同，从而能够大规模生产廉价的木糖醇。
权利要求
1.一种用于假丝酵母菌属菌株发酵培养的化学成分确定的培养基，其特征在于包括1-10g/l的尿素，1-10g/l的二磷酸钾、0.01-1g/l的硫酸镁，0.1-10mg/l的MnSO4·4H2O，0.1-10mg/l的CoCl2·6H2O，0.1-10mg/l的NaMoO4·2H2O，0.1-10mg/l的ZnSO4·7H2O，0.1-10mg/l的AlCl3·6H2O，0.1-10mg/l的CuCl2·2H2O，0.01-5mg/l的H3BO3，1-100mg/l的FeSO4·7H2O，0.1-10mg/l的抗坏血酸，1-100mg/l的生物素，1-100mg/l的胆碱，和0.1-10mg/l的维生素B6。
2.一种通过将假丝酵母菌属菌株再循环培养来高产量生产木糖醇的工艺，其特征在于包括下列步骤将菌株接种在含木糖的培养基中，并在生物反应器中培养所述含在木糖培养基中的所述菌株；从所述生物反应器中释放培养物并连续的将新配制的含木糖培养基引入到所述生物反应器中；从所述培养物中分离菌株和培养滤液；以及将所述菌株再循环到所述生物反应器中并从所述培养滤液中回收木糖醇。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于其中所述假丝酵母菌属菌株可以是热带假丝酵母Candida tropicalis或者其变异菌株。
4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于使用的所述含木糖的培养基可以是权力要求1中的化学成分确定的培养基或者复合培养剂。
5.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于通过补料分批培养或者分批培养进行所述培养。
6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于在补料分批培养中，培养基逐渐补充木糖，使木糖的浓度以培养基为基础保持40-50g/l。
7.根据权利要求2、4、5和6中的任何一项所述的工艺，其特征在于其中所述培养以400-600rpm的搅拌速度进行搅拌。
8.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于通过真空微量过滤系统或离心从培养物中分离菌株和培养物滤液。
9.根据权利要求2或8所述的工艺，其特征在于将分离的菌株浓缩到浓度为10-100g/l并再循环。
全文摘要
本发明提供一种以高产量和产率连续生产木糖醇的工艺，所述工艺采用装有用于假丝酵母菌属菌株的发酵培养基的真空微量过滤生物反应器，所述培养基包括5－300g/l的木糖，1－10g/l的尿素，1－10g/l的二磷酸钾、0.01－1g/l的硫酸镁，0.1－10mg/l的MnSO
文档编号A23L1/236GK1890363SQ200480036526
公开日2007年1月3日 申请日期2004年11月22日 优先权日2003年12月8日
发明者吴德根, 金泽范, 金政勋, 金成俌, 朴承源, 金舜哲 申请人:Cj株式会社