专利名称：一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释pcr快速定量检测方法
技术领域：
本发明涉及油田水系统中常规污水、含聚污水、地面工艺的水处理过程中硫酸盐还原菌(SRB)的快速定量检测方法。
背景技术：
目前，油田系统内SRB菌的计数主要执行中国石油天然气行业标准，“油田注入水细菌分析方法——绝迹稀释法(MPN)”(部颁标准)、SY-T0532-93。上述的这种方法存在的问题是检测需要14天的时间，由于检测周期较长，不能有效的和即时的指导生产实践，在实际操作过程中有些严格的厌氧SRB菌无法生存，导致SRB菌的记数结果不准确，不能真实的反映生产实际情况，同时检测费用较高；并且由于现有检测方法是以核酸DNA为模板，存在着记数结果不准确的问题。
发明内容
针对现有的油田水质SRB菌检测中存在检测周期长、不能真实全面的反应水中的SRB菌的数量、不能即时的指导生产、检测费用较高的问题，从而提供一种记数结果准确、可有效的缩短计数时间、真实的反映生产实际情况、降低检测费用的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，它是以经倍比稀释的硫酸盐还原菌的菌体为模板直接进行PCR扩增检测。它依次包括以下步骤(1).制备菌体前处理缓冲液；(2).菌体的制备；(3).倍比稀释；(4).进行冰上的PCR操作；(5).PCR在扩增仪上的扩增；(6).1.0％的琼脂糖电泳检测；(7).结果观察，查表记数；所述“(4).进行冰上的PCR操作”过程中的PCR反应体系为20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、浓度为0.1μmol·L-1的正向引物SRBF 1μl、浓度为0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去离子水11.7μl，然后加2μl的样品。本发明方法针对硫酸盐还原菌特意性引物，采用PCR的扩增方法，直接以菌体为模板，具有记数更加准确的优点；由于可以精确到一个菌体，所以有效的缩短了计数时间，整个发明从做样到出结果只需要四个小时，远远小于14天的记数时间。由于真实的表证了水样的实际的SRB菌的数量，准确的反应了当时生产实际情况，所以可以直接有效的指导生产，降低了检测费用，利于推广应用。
图1是应用五管平行法计数1至4梯度电泳图谱，图2是应用五管平行法计数5至7梯度电泳图谱。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式为一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，它依次包括以下步骤(1).制备菌体前处理缓冲液；(2).菌体的制备；(3).倍比稀释；(4).进行冰上的PCR操作；(5).PCR在扩增仪上的扩增；(6).1.0％的琼脂糖电泳检测；(7).结果观察，查表记数；所述“(4).进行冰上的PCR操作”过程中的PCR反应体系为20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、浓度为0.1μmol·L-1的正向引物SRBF 1μl、浓度为0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去离子水11.7μl，然后加2μl的样品。
具体实施方式
二本实施方式的详细操作过程依次如下(1).制备菌体前处理缓冲液“菌体前处理缓冲液”的母液成分为70gNaCi、2g Kci、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰ SDS；将母液稀释10倍成为菌体前处理缓冲液；控制工作液的pH为7.5，在121℃条件下灭菌15～30min后即可。
(2).菌体的制备依次包括以下步骤a.菌体的制备在超净工作台下完成，需要先将超净工作台进行紫外线灭菌20～40min，然后将用含有高纯氮气的厌氧管取回的油田污水的水样，或生物反应器的污泥，取1mL注入到经灭菌的1.5mL的离心管中；b.对油田污水的水样在震荡器上充分震荡3～6min，对生物反应器的污泥在震荡器上充分震荡10～5min，13000r/min离心1min；从管中轻轻的弃上清液0.9mL；c.在剩余的0.1mL中加入“菌体前处理缓冲液”0.9mL，对油田污水的水样在震荡器上充分震荡3～6min，对生物反应器的污泥在震荡器上充分震荡10～15min；d.13000r/min离心2min，弃上清液0.98mL，充分震荡2min。
(3).倍比稀释倍比稀释在冰上进行，具体操作过程如下吸取2μl(2)步骤得到的菌体加入用于倍比稀释的管中，加入18μl的去离子水，得稀释液；然后再从稀释管中取2μl稀释液加入另一个稀释管中继续稀释，最终水样被稀释十倍；重复上述过程，直至稀释液中无SRB。
(4).进行冰上的PCR操作操作过程采用三管平行法，每个梯度3个或5个样。PCR反应体系为20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、浓度为0.1μmol·L-1的正向引物SRBF1μl、浓度为0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去离子水11.7μl，然后加2μl的样品。其中，正向引物SRBF的硫酸盐还原菌特意性探针的碱基组成为5’-CCTGACGCAGCGACGCCG-3’，共18bp；反向引物SRBR的硫酸盐还原菌特意性探针的碱基组成为5’-CTACCAGGGTATCTAATCC-3’，共19bp。
(5).PCR在扩增仪上的扩增操作程序为94℃预热5min，94℃变性30s，58.8℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。
(6).扩增产物于1.0％的琼脂糖电泳检测；需要一个半小时。
(7).结果观察，查表记数。
具体实施方式
三本实施方式用含有高纯氮气的厌氧管取回的油田污水作检测样，采用五管平行法进行冰上PCR操作，每个梯度5个样。1.0％的琼脂糖电泳检测，检测结果如图1、图2所示。进行结果观察，查表记数。
具体查表计算方法是选择后三个连续稀释梯度(10x、10x+1、10x+2)，将有菌体DNA条带出现的管数按稀释梯度由小到大的顺序排列成一个三位数称之为条带近似值(abc)。其中，第一个稀释梯度(10x)是最后一个5个试管中都有菌体DNA条带出现的稀释梯度，如果第三个稀释梯度(10x+2)再往下的梯度稀释管仍有菌体DNA条带出现，可将此管数加到第三个稀释梯度(10x+2)上。然后查阅哈尔滨工业大学出版社2002年出版的《污染控制微生物学实验》32-38页“每毫升稀释液的细菌近似值表”得出对应数值，计算出1mL检测样中反硝化细菌的总数。计算公式如下1mL检测样中反硝化细菌的总数(个)＝条带近似值(abc)表中对应数值×三个稀释梯度中第一个稀释梯度的稀释倍数(10x)×10×102％；本实施方式选择104、105、106三个稀释梯度，条带近似值(510)，查阅哈尔滨工业大学出版社2002年出版的《污染控制微生物学实验》32-38页“每毫升稀释液的细菌近似值表”得出其对应数值13.5。
从而得出本实施方式中1mL检测样中反硝化细菌的总数(个)＝条带近似值(510)×104×10×102％＝13.5×104×10×102％＝1.377×106(个)。
三管平行法记录的结果无论在检测样浓度低或高的情况下，数量级上与五管平行法无差别。本实施方式结果表明，采用五管平行法可以精确到一个菌体，使检测结果更加准确，置信度大于99％。
试验验证，采用五管平行法记数的结果与用硫酸盐还原菌细菌检测试剂瓶(北京华兴化学试剂厂)14天的记数结果相比数量级上平均大102，更能反应水样中实际的SRB菌的数量。
另外，本发明操作过程中所采用各成分的具体体积数值只在于表示相互间的比例关系，其在实际应用中不限于该数值的使用，只要符合相互间的比例关系即可实现本发明的目的，所以都应在本发明的保护范围之内；同时，由于在检测过程中有许可误差的存在，本发明所提到的数值也只是具有指导性的意义，所以在实际应用中只要使用了本发明所述过程的检测方法，即应在本发明的保护范围。
权利要求
1.一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于它依次包括以下步骤(1).制备菌体前处理缓冲液；(2).菌体的制备；(3).倍比稀释；(4).进行冰上的PCR操作；(5).PCR在扩增仪上的扩增；(6).1.0％的琼脂糖电泳检测；(7).结果观察，查表记数；所述“(4).进行冰上的PCR操作”过程中的PCR反应体系为20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、浓度为0.1μmol·L-1的正向引物SRBF1μl、浓度为0.1μmol·L-1的反向引物SRBR1μl，rTaq酶0.3U，其余加去离子水11.7μl，然后加2μl的样品。
2.根据权利要求1所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于正向引物SRBF的硫酸盐还原菌特意性探针的碱基组成为5’-CCTGACGCAGCGACGCCG-3’，共18bp；反向引物SRBR的硫酸盐还原菌特意性探针的碱基组成为5’-CTACCAGGGTATCTAATCC-3’，共19bp。
3.根据权利要求1或2所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于“(2).菌体的制备”过程依次包括以下步骤a.将用含有高纯氮气的厌氧管取回的油田污水的水样，或生物反应器的污泥，取1mL注入到经灭菌的1.5mL的离心管中；b.对油田污水的水样在震荡器上充分震荡3～6min，对生物反应器的污泥在震荡器上充分震荡10～15min，13000r/min离心1min；从管中轻轻的弃上清液0.9mL；c.在剩余的0.1mL中加入“菌体前处理缓冲液”0.9mL，对油田污水的水样在震荡器上充分震荡3～6min，对生物反应器的污泥在震荡器上充分震荡10～15min；d.13000r/min离心2min，弃上清液0.98mL，充分震荡2min。
4.根据权利要求3所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于(1).制备“菌体前处理缓冲液”过程中，“菌体前处理缓冲液”的母液成分为70g NaCi、2g Kci、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰SDS；将母液稀释10倍成为菌体前处理缓冲液；控制工作液的pH为7.5，在121℃条件下灭菌15～30min后即可。
5.根据权利要求3所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于菌体的制备在超净工作台下完成，需要先将超净工作台进行紫外线灭菌20～40min。
6.根据权利要求1或2所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于(5).“PCR在扩增仪上的扩增”程序为94℃预热5min，94℃变性30s，58.8℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于(5).“PCR在扩增仪上的扩增”程序为94℃预热5min，94℃变性30s，58.8℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。
8.根据权利要求1或2所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于(3).“倍比稀释”过程要在冰上进行且需要达到稀释液中无SRB。
9.根据权利要求8所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于倍比稀释过程如下吸取2μl(2)步骤得到的菌体加入用于倍比稀释的管中，加入18μl的去离子水，得稀释液；然后再从稀释管中取2μl稀释液加入另一个稀释管中继续稀释，最终水样被稀释十倍；重复上述过程，直至稀释液中无SRB。
10.根据权利要求1或2所述的一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于“(4).进行冰上的PCR操作”过程采用三管或五管平行法，每个梯度3个或5个样。
全文摘要
一种硫酸盐还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，涉及水处理过程中硫酸盐还原菌(SRB)的定量检测方法。现在检测方法存在检测周期较长、不能有效的和即时的指导生产实践和检测费用较高等缺点。本发明依次包括以下步骤(1).制备“菌体前处理缓冲液”；(2).菌体的制备；(3).倍比稀释；(4).进行冰上的PCR操作；(5).PCR在扩增仪上的扩增；(6).扩增产物于1.0％的琼脂糖电泳检测；(7).结果观察，查表记数。本发明所述方法记数结果准确、可有效的缩短计数时间、真实的反映生产实际情况、降低检测费用，利于推广应用。
文档编号C12Q1/04GK1769472SQ200510010459
公开日2006年5月10日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者马放, 魏利 申请人:哈尔滨工业大学