专利名称：表达缩胆囊素基因的重组t4噬菌体的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达缩胆囊素基因的重组T4噬菌体的特征和应用。本发明进一步涉及重组T4噬菌体对猪、兔、牛、鸡、鸭、鹅等动物的主动免疫技术及其应用。
背景技术：
缩胆囊素(Cholecystokinin，CCK)是一种调节动物采食量的有效因子。缩胆囊素又称胆囊收缩素或促胰酶素，是由小肠粘膜的I细胞分泌的多肽类激素。CCK前体为130个氨基酸，逐步分解成为小分子的CCK，目前发现的CCK有CCK-83，CCK-58，CCK-39，CCK-33，CCK-12，CCK-8和CCK-4。其不同部位主要在羧基端，但长度延伸在氨基端。餐后血浆中主要为大分子CCK，包括CCK-58，CCK-39，CCK-33和CCK-12。这些大分子CCK经胰蛋白酶水解后均成为8肽的氨基酸残基，即CCK-8。CCK-8具有CCK分子的全部活性，与8肽的胃泌素结构相似，都具有相同的氨基末端序列Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2，该序列是CCK和胃泌素发挥其生物活性所必需的。CCK存在于脑和胃肠道中，是脑内含量较多的一种脑肠肽(brain-gut peptide)类物质。CCK在各部位的含量则差别很大。在胃肠道，CCK有促进胆囊、胃和幽门括约肌收缩；促进远端十二指肠和空肠蠕动；促进胆汁、胃酸、胰液的分泌；增强胰酶的活性；促进胰岛素0胰高血糖素、降钙素的释放；调节胰多肽在肠道和胰液中的释放；抑制胃排空等功能。CCK受体有两种CCK-A受体和CCK-B受体，其中CCK-A受体在外周器官含量很高，而CCK-B受体在中枢神经系统中含量很高。CCK-A受体有两个结合位点高亲和力位点和低亲和力位点。近年来的研究表明CCK是和CCK-A的低亲和力位点结合使动物产生饱感从而使动物采食停止。
CCK可以降低多种动物的采食量。CCK-A受体基因敲除大鼠表现为肥胖、易饥饿、采食增加(Schwartz等，1999)。研究发现，在多种动物中，无论是外源性CCK，还是机体自身生成的内源性CCK都能使机体产生饱感(Della Fera等，1979，1981；Gibbs等，1973；Mc Laughlin等，1980)。外源性注入CCK也会降低动物的采食量。中枢和外周引入CCK具有相同的降低采食量的作用，CCK作为神经递质直接在脑内产生饱感。小剂量CCK就可以有效地抑制采食，在狗、鼠、兔、猴等多种哺乳动物及人体实验研究中发现，无论生理剂量或药理剂量的CCK都能抑制进食后的胃排空活动(Doong等，1998)，进而抑制动物采食。血浆CCK浓度与胃排空率呈反比关系。
对CCK免疫的研究已经开展了较长时间，早期研究表明，利用免疫调控技术可有效调控体内激素的分泌，从而调节动物的生产性能(Della等，1981；Lawrence等，1986；Pekas，1991，1993；Schanbacher等，1994)。目前，在猪和一些反刍动物上已有以CCK为抗原进行主动免疫和被动免疫的研究报道，结果表明对动物生产性能有一定的调控作用。Jens等(1978)用CCK-33单独免疫兔子，在加强免疫3次后，获得了效价很高的抗CCK-33的抗血清，说明CCK有一定的抗原性，可以用来接种动物使之产生抗体。而国内，陈均辉(1992)用CCK-8大分子与牛血清蛋白(BSA)联结形成全抗原免疫兔子，加强免疫后也获得了高滴度的抗CCK-8抗血清。虽然CCK免疫调控在猪、羊上有一定效果，但为了在生产中能够应用该技术，必须寻找到一种CCK免疫原，其免疫用量少，免疫过程方便可行，抗体相对稳定、易于保存使用，而且能大量生产抗体，又符合动物保护法规的方法。
用CCK作抗原主动免疫动物可以提高动物的采食量和增重。Pekas和Trout(1990)用CCK免疫生长猪后，其采食量和增重分别提高了8.2％和10.6％，胴体重提高8.7％，体长增加2.4％，对瘦肉/脂肪的比值和蛋白质/脂肪的比值没有影响，但CCK免疫猪的胴体瘦肉和脂肪重增加。由此可见，CCK免疫后，猪的生长速度增加是因为胴体增重增加，但对胴体组成没有影响。Mclaughlin等(1985)用CCK主动免疫鼠后发现，处理组比对照组的采食量增加了9％(P＜0.04)，增重提高了17％(P＜0.02)。这些研究结果表明应用CCK主动免疫动物对于动物的采食具有一定的促进作用，但结论也仅限于一些哺乳动物，对于其它动物方面的效果还有待进一步实验证实。
以上研究都是将化学合成的，或者是从动物组织中分离纯化的CCK或其活性部分与大分子物质(如BSA等)偶联，然后免疫动物。但还没有用噬菌体表达CCK或其活性部分(如CCK-33肽、CCK-8肽)的报道。
噬菌体表面展示技术(phage display)是1980年代发展起来的一项新的生物技术(Smith，1985)，它能将表达的外源多肽和蛋白质以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，并保持相对独立的空间构象和生物活性。T4噬菌体属于有尾噬菌体中A群A2亚群的典型成员，其基本形态结构是头长径约95nm，横径约为65nm。T4噬菌体衣壳由3种必需衣壳蛋白组成，主要的衣壳蛋白gp23和2个次要衣壳蛋白gp24、gp20。其中分子量为45kDa的gp23在每个病毒颗粒中有960个拷贝，而其余2个次要衣壳蛋白拷贝数较少，gp24有55个拷贝，而gp20只有12个拷贝。此外，在衣壳的外表面包被着2种非必需外壳蛋白分子量为9kDa的SOC和分子量为40kDa的HOC，二者相距7nm，以对称的形式分布于噬菌体二十面体表面。SOC和HOC仅提供噬菌体额外的稳定能力，是在噬菌体衣壳装配完成后才组装到衣壳表面的，它们的缺失不影响T4噬菌体的繁殖和感染。将外源蛋白与T4噬菌体表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，从而可以获得具有外源蛋白的重组T4噬菌体。采用这样的方法，获得了表达爱滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰质炎病毒VP1(Ren et al，1996)、脑膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白、传染性囊病病毒VP2(曹永长等，2003)、禽流感H5亚型和H9亚型HA蛋白(吕英姿等，2002)的重组T4噬菌体。
发明内容
本发明的目的在于获得表达缩胆囊素基因的重组T4噬菌体，为主动免疫缩胆囊素和缩胆囊素抗体的检测提供一种新的抗原。
本发明提供的重组T4噬菌体是采用基因重组的方法获得的。其构建方法是首先是构建一系列含有缩胆囊素33肽基因多串联体的重组质粒。这些质粒是采用基因工程方法获得的，具体构建方法如下(1)根据鸡cck基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子，设计合成cck-33基因，基因序列为GGTTCTACTGGCCGCTTCTCTGTCCTTG GCAACCGTGTACAGAGCATTGATCCGACGCACCGTATTAATGACCGTGACTACATGGGCTGGATGGATTTT。
(2)将cck-33基因插入pRSETA质粒，获得重组质粒pRSETA-1CCK，具体操作如下根据人工合成的cck-33基因设计特异性引物，采用PCR方法，以人工合成的cck-33基因为模板，扩增cck-33基因片段。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到大小约120bp的特异性条带。
用SacI和BamHI在37℃分别消化CCK-33基因的PCR产物和质粒pRSETA，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的cck-33基因的PCR产物和质粒pRSETA。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得插入了cck-33基因的转化子。然后用特异性引物P1/P2对含有cck-33基因的转化子进行PCR筛选。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到大小约120bp的特异性条带。
对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组质粒命名为pRSETA-1CCK。
(3)根据BamHI和BglII互为同尾酶的特性，构建cck-33基因2串联体(简称2cck)，具体操作如下将重组质粒pRSETA-1CCK用两组酶在37℃进行消化第一组用BamHI和HindIII进行消化，回收较小的片段；第二组用BglII、HindIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得含有2cck的重组子。然后用特异性引物P1/P2对含有2cck的重组子进行PCR筛选。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到约230bp的特异性条带。
对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-2CCK。
(4)在pRSETA-2CCK的基础上构建cck-33基因的4串联体(简称4cck)，具体操作如下将重组质粒pRSETA-2CCK用两组酶在37℃进行消化第一组用BamHI和HindIII进行消化，回收较小的片段；第二组用BglII、HindIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得含有4cck基因的重组子。然后用特异性引物P3(5’-GATAAGGATCGATGGGGATCC-3’)/P4(5’-ATGGTACCAGCTG CAGATCT-3’)对含有4cck的重组子进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-4CCK。
采用相同的方法，分别获得含有cck-33基因6串联体(简称6cck)、8串联体(简称8cck)，相应地命名为pRSETA-6CCK、pRSETA-8CCK。
在获得含有cck-33基因多串联体重组质粒的基础上，构建含有cck-33基因多串联体的整合质粒。下面以含有4cck整合质粒的构建为例说明其构建方法。
(1)采用特异性引物Pup2(5′-ATTGAATTCTGATGACGATAAGGAT-3′)/Pdn2(5′-ATCGAATTCCTACATGGTACCAGCTGC-3′)，用PCR方法从质粒pRSETA-4CCK中扩增4cck基因。PCR反应体系(100μL)组成如下10×PCR buffer 10μl，dNTPs 8μL，Taq酶1μL，Pup2 1μL，Pdn2 1μL，pRSETA-4CCK 1μl，ddH2O 78μL。PCR扩增程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，64℃ 40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。用1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物。
(2)将4cck基因插入pR质粒(Ren et al，1996)中，构建重组整合质粒pR-4CCK，其操作步骤如下用EcoR I在37℃分别消化4cck基因的PCR产物和质粒pR，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的4cck的PCR产物和质粒pR。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得插入了4cck基因的重组子。然后用1对特异性引物SOC-S(5′-GAATCATATGGCTA GTCTCGCGG-3′)/Pdn2进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组整合质粒pR-4CCK。
然后，用重组整合质粒pR-4CCK和缺陷性T4噬菌体T4-Z1(Ren etal，1996)进行同源重组，获得表达CCK-33肽4串联体蛋白(4CCK)的重组T4噬菌体，其操作步骤如下用整合质粒pR-4CCK转化大肠杆菌E2，获得的大肠杆菌为E-4CCK；在装入500μL SC培养液的器皿中加入1μL氨卞青霉素(Amp)，然后加入10μL E-4CCK，在37℃培养至光密度值OD600大约为0.5时，加入50μL T4-Z1，在35℃200r/m振摇培养至有细菌碎片出现，获得的产物为未鉴定的重组T4噬菌体；在1个经过灭菌的器皿中加入培养超过12h的大肠杆菌E2600μL，不加溶菌酶，将在2～10℃储存的SC顶层培养基放在微波炉中溶解，待琼脂温度降到45℃左右的时候取2mL倒入装有大肠杆菌E2的器皿中，将混合液混匀，立即倒在预先配置的SC底层培养基平皿上，当琼脂完全冷凝时，在SC顶层培养基上分别点10μL未鉴定的重组T4噬菌体，待吸收完毕后，放在37℃培养16h以上。如果E-4CCK中的质粒与T4-Z1发生了重组，成功地将4cck基因转入T4噬菌体中，则在没有加溶菌酶的平皿上可以生长出噬菌斑；在平皿上铺含有E2细菌的SC顶层培养基，用灭菌牙签把生长出的噬菌斑在SC顶层培养基上点梅花斑，放在37℃培养12h以上，生长良好的梅花斑用消毒好的刀片将其剥下，浸泡在磷酸缓冲液中6h；用特异性引物Pup2/Pdn2从梅花斑浸泡液中扩增到特异性条带，则说明已获得表达4CCK蛋白的重组T4噬菌体，命名为T4-4CCK。
SC培养液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min后4℃保存。
SC底层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L Tris-Cl和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后倒平板，4℃保存。
SC顶层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，4℃保存。用时加热溶解，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/LTris-Cl和10mL 25％柠檬酸钠。2H2O溶液，摇匀后备用。
采用类似的方法，构建表达CCK-33肽(1CCK)和CCK-33肽8串联体(8CCK)的重组噬菌体，相应地将这些重组噬菌体命名为T4-1CCK和T4-8CCK。
表达CCK-33肽多串联体的重组T4噬菌体的特征为(1)本发明提供的重组噬菌体T4-1CCK、T4-4CCK和T4-8CCK都具有序列表中序列1的核苷酸序列，或序列1的串联体序列。序列1又称为cck-33基因，由99个碱基对组成，是根据鸡cck基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子而设计的。序列1的串联体序列，是用若干个碱基将两个cck-33基因以首尾相连的方式，将若干个cck-33基因连接起来形成的序列。对于序列1和序列1的多串联体，采用PCR方法可以扩增出特异性条带，也可以采用DNA序列测定的方法进行确定。
(2)本发明提供的重组质粒的表达产物具有序列表中序列2的氨基酸序列，或序列2的串联体序列。序列2又称为CCK-33肽，是由序列1编码的。序列2的串联体序列，是用若干个氨基酸将两个CCK-33肽以首尾相连的方式，将若干个CCK-33肽连接起来形成的序列。采用抗CCK-33肽的特异性抗体，或者抗CCK-8肽的特异性抗体，或者抗其它形式的CCK的特异性抗体，都可以检测到该多肽产物。
(3)本发明提供的重组质粒还包括具有CCK等同序列的质粒。CCK等同序列，是与cck-33基因的核苷酸序列，或CCK-33肽的氨基酸残基序列相比有一个或若干个核苷酸或氨基酸残基的差别，包括碱基或氨基酸残基的改变、缺失、添加、或插入，或与cck-33基因序列中的连续24个碱基以上的区段有75％以上的同源性。
本发明提供的重组噬菌体具有重要的应用价值。应用之一是将所述的重组噬菌体作为抗原，采用重组噬菌体直接免疫或将其与佐剂配合免疫猪、牛、兔、鸡等动物，可以促进动物采食，提高生产性能。
本发明提供的重组噬菌体的第二个应用，是采用重组噬菌体直接免疫或将其与佐剂配合制成疫苗免疫蛋鸡，通过收集免疫鸡的鸡蛋，可以大量获得抗CCK的特异性抗体。
本发明提供的重组噬菌体的另一个应用，是将所述的重组噬菌体作为抗原，应用于包括但不限于ELISA(酶联免疫吸附试验)，检测动物血清中的CCK特异性抗体。
本发明具有明显的优点和效果。(1)本发明根据大肠杆菌偏爱密码子设计基因序列，采用基因工程的方法获得的重组噬菌体，表达量高，易于纯化，成本低。(2)本发明获得的CCK-33肽多串联体具有很好的免疫原性。CCK在动物体内主要以羟基端酰胺化的CCK-8和CCK-33的形式存在。由于CCK-33和CCK-8的分子量太小，不能直接作为抗原免疫动物，一般需要将它们与大分子物质(如BSA)偶联。本发明提供的重组T4噬菌体巧妙地将CCK-33肽或其多串联体与T4噬菌体头部的SOC蛋白融合后，展示在T4噬菌体表面。由于SOC位点在T4噬菌体头部表面具有960个拷贝，所以与SOC融合表达的CCK-33肽或其多串联体的拷贝数高。由于CCK-33肽或其多串联体分布于T4噬菌体头部表面，因而T4噬菌体本身充当了CCK-33肽或其多串联体的载体，当本发明提供的重组T4噬菌体作为抗原时，CCK-33肽或其多串联体的免疫原性比单独的CCK蛋白的免疫原性强。作为疫苗的抗原、或者作为免疫检测的抗原使用时，比人工合成的CCK多肽，甚至和其它的蛋白表达系统表达的CCK多肽或其多串联体相比，本发明所述的重组T4噬菌体具有明显的优点。
以下结合实施例和附图对本发明提供的表达CCK-33肽多串联体的重组噬菌体的构建、重组噬菌体的特征分析、应用途径作具体说明。
图1为cck-33基因及其多串联体构建示意图。pRSET A为克隆质粒载体，pRSETA-1CCK为插入了cck-33基因的重组质粒，pRSETA-2CCK为插入了cck-33基因2串联体(2cck)的重组质粒，pRSETA-4CCK为插入了cck-33基因4串联体(4cck)的重组质粒，pRSETA-6CCK为插入了cck-33基因6串联体(6cck)的重组质粒，pRSETA-8CCK为插入了cck-33基因8串联体(8cck)的重组质粒。BamHI、HindIII、BglII、SacI是质粒上的限制性内切酶位点。
图2为cck-33基因及其多串联体的PCR鉴定结果图。泳道1、2是cck-33基因及其多串联体的PCR产物，泳道M为DNA分子量标记。A为cck-33基因PCR产物，B为cck-33基因4串联体(4cck)PCR产物，C为cck-33基因8串联体(8cck)PCR产物。
图3为用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对重组质粒pRSETA-1CCK、pRSETA-2CCK、pRSETA-4CCK、pRSETA-6CCK和pRSETA-8CCK进行双酶切的电泳鉴定图。M为DNA分子量标准DL2000；1泳道为pRSETA-1CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为120bp；2泳道为pRSETA-2CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为230bp；3泳道为pRSETA-4CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为450bp；4泳道为pRSETA-6CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为700bp；5泳道为pRSETA-8CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为1100bp。
图4为重组整合质粒pR-CCK的构建示意图。1CCK表示cck-33基因，4CCK表示cck-33基因4串联体，8CCK表示cck-33基因8串联体。pR表示整合质粒，pR-1CCK表示插入了cck-33基因的重组整合质粒，pR-4CCK表示插入了cck-33基因4串联体(4cck)的重组整合质粒，pR-8CCK表示插入了cck-33基因8串联体(8cck)的重组整合质粒。Ampr表示氨卞青霉素抗性，Kpr表示卡那霉素抗性。e、soc、den V都是T4噬菌体上的基因。EcoRI、BamHI、NdeI、HindIII、PstI、PvuI是质粒上的限制性内切酶位点。
图5为cck-33基因4串联体(4cck)在重组T4噬菌体SOC位点展示模式图。A为重组整合质粒pR-4CCK；B为缺陷型T4噬菌体ΦT4-Z1；C为重组后携带有目的基因4CCK的重组T4噬菌体T4-4CCK。
图6为重组噬菌体T4-1CCK的PCR鉴定结果图。泳道1～3是含有cck基因的重组噬菌体的PCR产物，泳道4为阴性对照，泳道M为分子量标记。
图7为重组噬菌体T4-4CCK的PCR鉴定结果图。泳道1～9是含有4cck基因的重组噬菌体的PCR产物，泳道M为分子量标记。
图8为重组噬菌体T4-8CCK的PCR鉴定结果图。泳道1是含有8cck基因的重组噬菌体的PCR产物，泳道M为分子量标记。
图9为野生型T4噬菌体及重组噬菌体免疫电镜图谱。A为野生型T4噬菌体。B为重组噬菌体T4-4CCK。C为与CCK阳性血清反应的重组噬菌体T4-4CCK。
图10重组噬菌体和野生型噬菌体的SDS-PAGE(12％)检测图。M为蛋白质分子量标准；1泳道为重组噬菌体T4-4CCK；2泳道为野生型T4噬菌体。箭头所指为SOC-4CCK融合蛋白。
实施例实施例1.含有cck-33基因(1cck)的重组质粒的构建根据鸡cck基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子，设计合成cck-33基因，基因序列为GGTTCTACTGGCCGCTTCTCTGTCCT TGGCAACCGTGTACAGAGCATTGATCCGACGCACCGTATTAATGACCGTGACTACATGGGCTGGATGGATTTT。
根据人工合成的cck-33基因设计特异性引物P1(5’-CATGGATCCGGTTCTACTGGCCGCT-3’)/P2(5’-CATGAGCTCCCAAAATCCATCCAGCC-3’)，采用PCR方法，以人工合成的cck-33基因为模板，扩增cck-33基因片段。扩增cck-33基因片段的PCR反应体系(200μL)组成如下20μL 10×PCR buffer，16μL dNTPs，2μL Taq酶，1.5μL引物P1，1.5μL引物P2，0.5μL人工合成的cck-33基因模板，最后加水至总体积达到200μL。PCR温度循环程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到特异性条带。
用SacI和BamHI在37℃分别消化cck-33基因的PCR产物和质粒pRSETA，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的cck-33基因的PCR产物和质粒pRSETA。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得插入了cck-33基因的转化子。然后用特异性引物P1/P2对含有cck-33基因的转化子进行PCR筛选。检测cck-33基因片段的PCR反应体系(20μL)组成如下2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物P1，0.5μL引物P2，1μL待检菌液，最后加水至总体积20μL。PCR扩增在Mastercycler gra dient PCR仪(Eppendorf公司)上进行，温度循环程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到特异性条带(图2)。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组质粒命名为pRSETA-1CCK。
实施例2.含有cck-33基因2串联体(2cck)的重组质粒的构建将重组质粒pRSETA-1CCK用两组酶在37℃进行消化第一组用BamHI和HindIII进行消化，回收较小的片段；第二组用BglII、HindIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得含有2cck的重组子。然后用特异性引物P1/P2对含有2cck基因的重组子进行PCR筛选。PCR方法参照“实施例1”。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-2CCK。
实施例3.含有cck-33基因4串联体(4cck)的重组质粒的构建将重组质粒pRSETA-2CCK用两组酶在37℃进行消化第一组用BamHI和HindIII进行消化，回收较小的片段；第二组用BglII、HinIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得含有4cck的重组子。然后用特异性引物P3(5’-GATAAGGATCGATGGGGATCC-3’)/P4(5’-ATGGTACCAGCTGCAGATCT-3’)对含有4cck的重组子进行PCR筛选。PCR方法参照“实施例1”。电泳检测PCR产物，观察到特异性条带(图2)。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-4CCK。
实施例4.含有cck-33基因6串联体(6cck)的重组质粒的构建将重组质粒pRSETA-2CCK用BamHI和HindIII在37℃进行消化回收较小的片段；将重组质粒pRSETA-4CCK用BglII、HindIII和CIAP进行酶切消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得含有6cck的重组子。然后用特异性引物P3/P4对含有6cck的重组子进行PCR筛选。PCR方法参照“实施例1”。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-6CCK。
实施例5.含有cck-33基因8串联体(8cck)的重组质粒的构建将重组质粒pRSETA-2CCK用BamHI和HindIII在37℃进行消化，回收较小的片段；将重组质粒pRSETA-6CCK用BglII、HindIII和CIAP进行酶切消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得含有8cck的重组子。然后用特异性引物P3/P4对含有8cck的重组子进行PCR筛选。PCR方法参照“实施例1”。电泳检测PCR产物，观察到特异性条带(图2)。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mLLA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16-20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-8CCK。
实施例6.含有cck-33基因4串联体(4cck)的整合质粒的构建采用特异性引物Pup2(5’-ATTGAATTCTGATGACGATAAGGAT-3’)/Pdn2(5’-ATCGAATTCCTACATGGTACCAGCTGC-3’)，用PCR方法从质粒pRSETA-4CCK中扩增4cck基因。PCR反应体系(100μL)组成如下10×PCR buffer 10μl，dNTPs 8μL，Taq酶1μL，Pup2 1μL，Pdn2 1μL，pRSETA-4CCK 1μl，ddH2O 78μL。PCR扩增在Mastercycler gradient PCR仪(Eppendorf公司)上进行，程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，64℃ 40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。
用EcoRI在37℃分别消化4CCK基因的PCR产物和质粒pR，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的4cck的PCR产物和质粒pR。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得插入了4cck基因的重组子。然后用1对特异性引物SOC-S(5’-GAATCATATGGCTAGTCTCGCGG-3’)/Pdn2进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组整合质粒pR-4CCK。
实施例7.表达CCK-33肽4串联体(4CCK)的重组T4噬菌体的获得用重组整合质粒pR-4CCK和缺陷性T4噬菌体T4-Z1(Ren et al，1996)进行同源重组，获得表达4CCK的重组T4噬菌体。
先用整合质粒pR-4CCK转化大肠杆菌E2，获得的大肠杆菌为E-4CCK。然后进行以下操作在装入500μL SC培养液的试管中加入1μL Amp，然后加入10μL E-4CCK，在37℃培养至OD600大约0.5时，加入50μL T4-Z1，继续在35℃ 200r/m振摇培养至有细菌碎片出现，获得的产物为未鉴定的重组T4噬菌体；
在1个经过灭菌的器皿中加入培养超过12小时的大肠杆菌E2600μL，不加溶菌酶，将在4℃储存的SC顶层培养基放在微波炉中溶解，待琼脂温度降到45℃左右的时候取2mL倒入装有大肠杆菌E2的器皿中，将混合液在旋涡震荡器上混匀，立即倒在预先配置的SC底层培养基平皿上。等到琼脂完全冷凝时，在SC顶层培养基上分别点10μL未鉴定的重组T4噬菌体，待吸收完毕后，放在37℃培养16h以上，如果E-4CCK中的质粒与T4-Z1发生了重组，成功地将4cck基因转入T4噬菌体中，则在不加溶菌酶的平皿上可以生长出噬菌斑；在灭菌的平皿上铺SC顶层培养基，然后用灭菌牙签把生长出的噬菌斑在SC顶层培养基上点梅花斑，放在37℃培养12h以上，生长良好的梅花斑用消毒好的刀片将其剥下，浸泡在磷酸缓冲液中6h；采用PCR筛选T4噬菌体转化子。检测4cck基因的PCR反应体系组成如下每25μL反应体系中含2.5μL 10×PCR缓冲液，2μL dNTPs，0.3μL Taq酶，0.5μL Pup2，0.5μL Pdn2，1μL梅花斑浸泡液和18.2μL双蒸水。将反应混合物混匀、离心后，在PCR仪上进行温度循环。温度循环程序如下首先94℃ 3min；然后94℃ 40sec、51℃40sec、72℃ 90sec，共循环30次；最后72℃ 10min。采用1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)电泳对PCR反应产物进行检测。如果观察到特异性条带，则说明已获得了表达4CCK蛋白的重组T4噬菌体，命名为T4-4CCK。
SC培养液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L Tris-Cl和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后铺平板，4℃保存。
SC底层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L Tris-Cl和10mL25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后铺平板，4℃保存。
SC顶层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，4℃保存。用时加热溶解，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L Tris-Cl和10mL 25％柠檬酸钠.2H2O溶液，摇匀后备用。
实施例8.重组T4噬菌体的免疫电镜观察分别取野生型T4噬菌体、重组T4噬菌体和1/3体积CCK阳性血清混合，37℃放置1小时后，直接涂片。同时用不加阳性血清的上述噬菌体作对照。磷钨酸负染，JEM-1010型透射电镜观察。比较与CCK抗血清反应前后的噬菌体形态，发现野生型T4噬菌体的形态不受CCK阳性血清的影响；而重组T4噬菌体的形态受CCK阳性血清影响明显。未与CCK阳性血清反应的重组T4噬菌体的形态与野生型T4噬菌体形态相同，头部为白色；而与阳性血清作用之后的重组T4噬菌体头部变黑。
实施例9.重组T4噬菌体的SDS-PAGE检测大量培养重组噬菌体T4-4CCK，离心浓缩，当噬菌体浓度达到1011个/mL时，进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE方法如下取重组噬菌体T4-4CCK和T4噬菌体SOC缺失株T4-Z1各100μL，然后加入2×上样缓冲液100μL，混匀后，样品在-80℃冰箱和37℃烘箱内分别冻融三次。参照汪家政等(2000)编《蛋白质手册》方法制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。成层胶浓度为5％，分离胶浓度为12％。将待检样品煮沸5min，取30μL加入凝胶点样孔中，在电场作用下进行电泳。电泳缓冲液为Tris-甘氨酸。电压为80v/cm，待溴酚蓝到达成层胶底部时电压升高到160v/cm。待溴酚蓝接近凝胶底部时，停止电泳，取下凝胶，置于1％考马斯亮蓝溶液中染色过夜，用脱色液脱色。在约30kD处可见特异性条带(图10)。
实施例10.重组噬菌体对肉鸡的免疫效果将重组噬菌体T4-4CCK制成油乳剂疫苗进行肉鸡免疫实验，疫苗中T4-CCK的含量为1010个/mL。将360只胡须肉鸡饲养至20日龄后随机分成2组，每组三个重复，每个重复60只鸡，1组为对照组，2组为重组噬菌体免疫组。20日龄免疫第一次，以后每隔20天免疫一次，共免疫3次。肉鸡饲养至90日龄结束。实验结束时，称重并统计耗料量，计算全期的平均增重、平均采食量和料肉比。结果表明重组噬菌体免疫组的体增重和采食量明显高于对照组，料肉比也有所下降。
表1重组噬菌体T4-4CCK免疫对肉鸡生长性能的影响
分别在35、55和90天龄时采血，测定血清中CCK抗体。
在96孔酶标板上，每孔加上纯化的0.2mg/mL大肠杆菌表达的4CCK融合蛋白100μL，4℃包被过夜。弃去包被液，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入5％脱脂奶粉100μL封闭液，37℃封闭2h。弃去封闭液，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液，每孔加入最适稀释浓度的一抗100μL，37℃反应1h。弃去一抗，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入用1∶1000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体)100μL，37℃反应1h。弃去二抗，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入显色缓冲液100μL，当达显色高峰时(约10～30min)加入1mol/L H2SO4100μL终止反应，在酶标仪上读取OD450值。用P/N表示抗体水平。空白对照组3次检测的结果均为P/N＜2，且三次的结果变化幅度非常小。而免疫组3次检测P/N均超过2，且后两次结果高于第一次(表2)。
表2 重组噬菌体T4-4CCK免疫后鸡血清中CCK抗体的ELISA检测(P/N)
序列表<110>华南农业大学<120>表达缩胆囊素基因的重组T4噬菌体<140>
<141>
<160>2<210>1<211>99<212>DNA<213>缩胆囊素-33(Choleystokinin-33，CCK-33)<220>
<221>cDNA<222>(1)…(99)<220>
<221>CDS<222>
<400>1ggt tct act ggc cgc ttc tct gtc ctt ggc aac cgt gta cag agc att 48Gly Ser Thr Gly Arg Phe Ser Val Leu Gly Asn Arg Val Gln Ser Ile15 10 15gat ccg acg cac cgt att aat gac cgt gac tac atg ggc tgg atg gat 96Asp Pro Thr His Arg Ile Asn Asp Arg Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp20 25 30ttt 99Phe33<210>2<211>33<212>PRT<213>缩胆囊素-33(Choleystokinin-33，CCK-33)<400>2Gly Ser Thr Gly Arg Phe Ser Val Leu Gly Asn Arg Val Gln Ser Ile1 5 10 15Asp Pro Thr His Arg Ile Asn Asp Arg Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp20 25 30Phe3权利要求
1.一种重组T4噬菌体，其含有SEQ ID No.1的核苷酸序列或SEQ IDNo.1的串联体序列或与SEQ ID No.1有75％以上同源性且具有一个或几个核苷酸残基的改变、缺失、添加或插入的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组T4噬菌体，其特征在于含有SEQ IDNo.1的多串联体序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组T4噬菌体，其特征在于核苷酸SEQID No.1编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。
4.一种构建重组T4噬菌体的方法，包括步骤1).克隆核苷酸序列SEQID No.1，或根据BamH I和Bgl II互为同尾酶的特性，获得SEQ ID No.1的多串联体序列；2).将核苷酸序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的多串联体序列插入pR质粒中构建相应的重组整合质粒；3).将2)中获得的重组整合质粒与缺陷性T4噬菌体T4-Z1进行同源重组，获得表达CCK-33肽的重组T4噬菌体。
5.一种提高动物采食量并增重的方法，其包括将包含任一权利要求1-3中的重组T4噬菌体的疫苗用于所述动物。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述动物为猪、牛、兔或鸡、鸭、鹅。
7.一种制备抗CCK的特异性抗体的方法，包括将任一权利要求1-3中的重组T4噬菌体直接免疫或将其与佐剂配合制成疫苗免疫蛋鸡，并收集免疫鸡的鸡蛋来获得抗CCK的特异性抗体。
8.任一权利要求1-3中的重组T4噬菌体作为抗原在检测动物血清中CCK特异性抗体中的应用。
全文摘要
本发明涉及一个表达缩胆囊素基因的重组T4噬菌体，所述重组T4噬菌体具有鸡缩胆囊素33肽基因或其多串联体的核苷酸序列。本发明也提供了鸡缩胆囊素33肽或其多串联体的氨基酸残基序列，以及利用重组T4噬菌体对动物进行主动免疫的技术及其应用。
文档编号C12N7/01GK1687407SQ20051001158
公开日2005年10月26日 申请日期2005年7月15日 优先权日2005年7月15日
发明者曹永长, 覃健萍, 毕英佐, 舒鼎铭, 马静云, 谢青梅 申请人:华南农业大学