一种单克隆抗体,包含该单克隆抗体的检测试剂盒及应用的制作方法

专利名称：一种单克隆抗体,包含该单克隆抗体的检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫应用领域，涉及动物分子生物学、免疫学等相关领域。具体地讲本发明涉及一种特异性单克隆抗体的制备，包含该单克隆抗体的试剂盒及其在鸡禽流感病毒抗体诊断检测中的应用。
背景技术：
众所周知，禽流感、新城疫、法氏囊、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、马立克、减蛋综合症等疫病是危害全球养禽业的重要疫病，其中尤以禽流感为甚。2004年初，亚洲部分国家和地区相继发生了H5N1亚型高致病性禽流感，我国也未能幸免，短期内全国十多个省(区)相继发生了不同程度的疫情，给亚洲部分国家和地区的养禽业造成了巨大的经济损失，因此亚洲各国政府都对禽流感的防制高度重视，并相继提出了一系列的防制措施。在已有的研究中，大多侧重于探索诊断和鉴定鸡禽流感病毒的新方法。例如在检索到的200410014289.9、200310107732.2等专利文献中分别介绍了这类检测方法。而对鸡禽流感病毒抗体的监测和检测仍停留在原有的经典方法上，如琼脂扩散试验(Agarose gelimmunodiffusion AGID)、血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition HI)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay；ELISA)、神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidaseinhibitor test NIT)、病毒中和试验(Virus Neutralization Test；VNT)等，这些方法有的耗费时间长，(如琼脂扩散试验需24～48小时；血凝抑制试验需2～3小时；ELISA试验需3～5小时以上等)，有的需要昂贵的仪器设备和繁琐的操作技术，只能在实验室完成，不便于适时和快速诊断。
免疫层析(immunochromatography)是出现于八十年代初期的一种独特的免疫分析方式(Glad C，Grubb AO.Immunocapillarymigration with enzyme-labeled antibodiesrapidquantification of C-reactive protein in human plasma.Anal Biochem，1981，116335-340)，该方法的核心技术是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细管作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生高特异、高亲和性的免疫反应。胶体金免疫层析分析(gold-immunochromatography assay GICA)是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术(Osikowicz G et al One-step chromatographic immunoassay for qualitative determination ofchoricogonadotropin in urine.Clin Chem.1990，36，1586)。层析过程中，金标记物与事先固相化于层析材料(例如硝酸纤维素膜，即NC膜)上的抗原或抗体(检测线)发生特异性的免疫反应而被截留，进一步富集，形成肉眼可见紫红色条带，从而得到直观的实验结果，达到检测的目的。这种方法对所使用的抗原抗体的要求较高，要求具有好的特异性和高纯度。
依据这种原理，已经发展出了很多胶体金免疫层析快速检测试纸条。在人医应用方面，国内外已在激素、传染病病原的抗原和抗体、性病病原、细菌、寄生虫、肿瘤标记物、心血管病标志物、药物以及其他一些蛋白质等方面应用了金标免疫层析试纸条。在兽医应用方面，例如在猪瘟、犬细小病毒病等方面也应用了金标免疫层析试纸条。在鸡疫病诊断和检测方面，中国发明专利公开说明书99101537.1，公开了一种畜禽疫病快速诊断试纸条的制备及应用，但该发明的要点是针对畜禽疫病病原的检测，并未涉及对鸡禽流感病毒抗体的检测。

发明内容
本发明的第一个目的是得到一种特异性强的抗鸡IgG Fc的单克隆抗体。
本发明的第二个目的是组装一种用于检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒。
本发明的第三个目是本发明的试剂盒在禽流感病毒抗体检测中的应用。
本发明的总体技术路线图见图1所示。
本发明是这样实现的本申请人制备了一种特异性强的单克隆抗体，它是抗鸡IgG Fc的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤子细胞系BDRPDP已于2005年3月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-C200501。申请人利用得到的单克隆抗体和禽流感病毒重组核衣壳蛋白(NP蛋白)为核心试剂构建了一种用于快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒。本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的96孔酶标板条、试纸条、样品稀释液组成。试纸条(结构图如图2、3所示)是本发明的试剂盒的核心，它由吸收垫(1)、硝酸纤维素膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)按图示的顺序依次粘附在不吸水的支撑薄片(7)上组装而成的。金标垫上涂覆有胶体金标记的本发明制备的单克隆抗体；硝酸纤维素膜上包被有检测线(5)和质控线(6)，其中检测线为本发明制备的禽流感病毒重组核衣壳蛋白(NP蛋白)，质控线为本发明制备的抗鼠IgG抗体。样品稀释液为8％盐水。所述硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫、不吸水的支撑薄片均购自Millipore公司。所述亲和层析柱购自AmershamBiosciences公司。所述用于筛选抗鸡IgG Fc单克隆抗体的鸡IgG Fc片断、鼠源单抗亚型鉴定试剂盒均购自ROCKLAND公司。
本发明的原理是选用亲和纯化的对鸡禽流感病毒抗体有特异性的重组核衣壳蛋白(NP蛋白)作为检测线，抗鸡IgG Fc片断单克隆抗体作为胶体金标记的抗体，利用间接法Shyu RH等，Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin J Toxicon2002，40(3)255-258来检测被检材料中是否含有鸡禽流感病毒抗体。检测时，样品中所有的鸡IgG分子的Fc先和金标记抗鸡IgG Fc单克隆抗体结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有抗鸡禽流感病毒的特异性抗体，到达检测线时，遇到包被在硝酸纤维素膜上的重组核衣壳蛋白(NP蛋白)，就会形成NP蛋白-抗体-金标记单克隆抗体复合物，从而富集在检测线上，形成红色沉淀线；不是抗鸡禽流感病毒的非特异性抗体形成的抗体-金标记单克隆抗体复合物则通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀线，判为阳性结果。若样品中不含有鸡禽流感病毒抗体，反应复合物到达检测线时，遇到捕获抗原就不会形成NP蛋白-抗体-金标记单克隆抗体复合物，反应复合物通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀线，判为阴性结果。
与现有技术相比本发明具有如下优点1、对鸡禽流感病毒抗体的检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(15～20分钟)，检测样品范围宽(血清、卵黄、肌肉组织浸出液均可)的特点；2、本发明的检测方法不需要任何特殊仪器、设备，具有检测成本低的特点；3、本发明的检测试剂盒操作简便，不需由专业人员操作；4、本发明的试剂盒储存方便，对温度要求不高，在4～8℃下有效保存期可达一年；在室温下可保存六个月。


图1本发明的总体技术路线2本发明试纸条的侧视图，图中1为吸收垫，2为硝酸纤维素膜，3为金标垫，4为样品垫，5为检测线，6为质控线，7为不吸水的支撑薄片条图3本发明试纸条的俯视图，图中1为吸收垫，2为硝酸纤维素膜，3为金标垫，4为样品垫，5为检测线，6为质控线，7为不吸水的支撑薄片条图4本发明涉及的NP重组蛋白表达质粒的物理构建5本发明检测试纸条结果判定示意图，图中1为阳性结果，2为阴性结果，3、4为试纸条失效。
具体实施例方式
实施例11、抗鸡IgG Fc单克隆抗体的制备参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版，中的方法利用发明人所在的微生物与免疫实验室提取的鸡IgG免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医科院实验动物中心)，免疫程序是取含鸡IgG 50～100μg的蛋白溶液与等体积的佛氏完全佐剂(购自sigma公司)乳化，注射小鼠腹腔，以后每间隔十天加强一次，换用不完全佐剂乳化(sigma)。最后于融合前三天，(最好与上次免疫相隔4周以上)，腹腔强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞购自卫生部武汉生物制品所)按1～2×107u个SP2/0与108个免疫细胞(1∶10～1∶15)的比例于50mL离心管中混匀，1500r/m，离心10min。倒净上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8mL(购自sigma公司产品)，边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌1min。然后慢慢加入37℃预温的1640(购自sigma公司商业培养基)基础液10mL。具体方法为第一分钟逐滴滴入1mL。第二分钟加1mL，第3～4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL 1640液，也需慢慢加入。800r/m离心5min，去上清，于37℃放置5～8min。用HAT(购自Sigma公司商品)培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250μL/孔。一次融合可接种4～8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。融合后第二天开始观察有无污染，于第4天补加1滴HAT培养基，第8～10天吸去100μL培养基换HT(购自sigma公司)培养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。采用购自ROCKLAND公司的鸡IgG Fc片断作为筛选抗原，利用ELISA方法筛选出分泌抗鸡IgGFc片断抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版)进行克隆、筛选。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗鸡IgG Fc片断的单克隆杂交瘤细胞系。对筛选出的该单克隆杂交瘤细胞系，申请人将其命名为BDRPDP，并于2005年3月17日送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC-C200501。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体的平均数为70，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在80～94之间。均高于两亲本细胞的染色体数目，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物，杂交瘤细胞的染色体数目明显多于骨髓瘤细胞SP2/0的染色体。将该细胞系注射Balb/C小鼠腹腔，生产单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(MouseMab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG1亚类。
2、单克隆抗体的纯化参照朱立平等《免疫学常用实验方法》人民军医出版社2000版中的方法取所得的小鼠腹水5ml与适量的二氧化硅混合，加入等体积的巴比妥缓冲液，室温振荡1h后，室温静置30min，取上清于洁净离心管中，4℃，3000r/m离心10min；取上清液8ml，加入16ml0.06mol醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4.5，充分搅拌下缓缓加入辛酸132μl后，室温搅拌30min，然后转入4℃冰箱充分沉淀2h，4℃，15000r/m离心30min，得上清液22ml，加入2.2ml0.1M的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/ml，4℃冰箱充分沉淀2h后，4℃，12000r/m离心30min，弃上清，沉淀用5ml 0.1M的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5000ml 0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析后，再对2000ml蒸馏水透析，最后对3000ml三蒸去离子水透析，将充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇-20000(PEG-20000)浓缩至3ml，然后4℃，12000r/m离心30min，弃沉淀，收集上清液，测得蛋白浓度为1.6mg/ml。经SDS-PAGE电泳鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度为98％。该单克隆抗体可用于制备检测鸡禽流感病毒抗体的试剂。
实施例2鸡禽流感病毒NP蛋白的制备所使用的分子生物学方法参见文献萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁，黎孟枫等译)。分子克隆实验指南。第二版，北京科学出版社，1992中提供的方法进行。
1、NP基因的克隆与测序本发明所涉及的NP基因是申请人自己克隆得到的，该基因的序列已在GeneBank数据库中登录，登录号为AY788915。该序列与已知序列有97％的同源性。NP基因的克隆与测序具体方法是用发明人所在的微生物与免疫实验室分离得到的一株禽流感毒株A/chicken/China/HSS2004(H9N2)GeneBank登录号为AY788915，病毒的分离和鉴定见文献李自力等 湖北省禽流感的诊断及病毒株的分离与初步鉴定，中国预防兽医学报，2001，23(3)146-148尿囊腔接种AIV于9-11日龄健康鸡胚，弃24小时前死胚，收集24-96小时的鸡胚尿囊液；4℃条件下4,000rpm离心30min，取上清；4℃条件下30,000rpm离心60min浓缩病毒。用pH7.2的PBS(DEPC处理水配制)溶解沉淀，分装后-70℃保存备用。根据参考文献(邓国华等，禽流感病毒分离株A/Chicken/Xinjiang/1/96(H14N5)NP基因序列分析 中国预防兽医学报 1998年06期)设计引物，扩增NP基因。上游引物P1AGGGTACCTAA TCACTCACTGA；下游引物P2TGGAATTCTTTAATTGTCGTACTCCTC。P1位于启动子上游，加有KpnI位点，P2包含有终止密码子，加入了EcoRI位点，两酶切位点用下划线标出。两引物之间包含有NP基因完整的阅读框架。取适量病毒悬液提取RNA，按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1说明书中提供的方法，扩增出DNA，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(E.Z.N.A Gel Extraction Kit)回收纯化RT-PCR扩增产物，将回收的RT-PCR产物直接与购自TaKaRa公司的克隆载体pMD18-T进行连接反应，然后将连接产物转化到试剂盒(购自TaKaRa公司的商业试剂盒)中感受态细胞大肠杆菌DH5α中，用α互补检查转化效果。挑取阳性克隆，采用碱裂解法(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁，黎孟枫等译)。分子克隆实验指南。第二版，北京科学出版社，1992版)提取重组质粒DNA，并对重组质粒DNA进行鉴定。将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-NP，并送中国上海博亚生物技术公司进行测序，然后将序列测定结果与GeneBank中的有关数据进行同源性比较和分折。
2、表达载体pKG-NP的构建pMD-NP用NcoI和SalI酶切后，回收1.5kb左右的片段，然后将此片段与用同样的酶酶切的Amersham Biosciences公司的表达载体pGEX-KG连接，构建表达载体。重组表达载体转化新鲜制备的DH5α感受态细胞，并将转化菌涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板37℃培养过夜。挑数个单菌落培养过夜后用碱裂解法小量制备质粒，进行酶切分析和PCR扩增鉴定。将得到的阳性克隆命名为pKG-NP。包含该重组质粒的大肠杆菌(Escherichia coliBL21/pKG-NP)保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日2005年3月29日；保藏编号CCTCC M205026。对阳性克隆用碱裂解法大量制备质粒DNA，并分装冻存于-20℃。重组表达质粒pKG-NP构建流程如图4所示3、NP蛋白的表达将构建好的表达质粒pKG-NP转入表达用大肠杆菌的感受态细胞BL21 codon plus(BL21codon plus购自Stratagene公司)中，涂布到含有相应抗生素(氯霉素25μg/mL，四环素10μg/mL，氨苄青霉素60μg/mL)的LB平皿上，37℃培养16-18h，长出单菌落。挑取数个单菌落于加有相应抗生素(氯霉素25μg/mL，四环素10μg/mL，氨苄青霉素60μg/mL)的3mL LB中培养过夜，进行细菌活化。将过夜培养物按比例1∶50稀释入新鲜的LB培养基中，37℃中振荡培养(250-300rpm)到OD600＝0.5-0.8时，加入终浓度为1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，继续培养诱导表达3h。4℃条件下8,000rpm离心15min，收集细菌。细菌用0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次后离心，反复快速冻融3-4次，用适量缓冲液STE(配方100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/L Tris-Cl，1.0mmol/L EDTA pH8.0)重悬。用大超声头，设定10个循环和50％的间隔时间，在冰浴中超声破碎1min。4℃条件下12,000rpm离心15min，弃沉淀，将上清对0.01M pH7.2 PBS进行充分透析后浓缩至体积为5mL，按蛋白纯化柱(HiTrap affiniy columns，Amersham Biosciences公司产品)说明书提供的程序进行亲和层析纯化，得到纯化的NP蛋白。该蛋白可用于制备检测禽流感病毒抗体的试剂。
实施例3兔抗鼠IgG抗体的制备参见何昭阳等主编，《动物免疫学实验技术》长春吉林科学技术出版社，2002中的方法利用发明人所在的微生物与免疫实验室提取的Balb/C小鼠IgG免疫健康家兔，制备高特异性、高效价的兔抗鼠IgG高免血清，对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG抗体。利用该抗体可作为质控线。
实施例4硝酸纤维素膜的制备1、包被缓冲液的配制含6％甲醇的0.01M pH7.2PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期一周。1000ml 6％甲醇的0.01M pH7.2PBS缓冲液配方NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，甲醇60ml，双蒸去离子水定容至1000ml。
2、硝酸纤维素膜的制备用包被缓冲液将NP蛋白稀释到5～10μg/ml，调整机器，划线为T线，即为检测线，T线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm；用包被缓冲液将兔抗鼠IgG抗体稀释到5～10μg/ml，调整机器，划线为C线，即为控制线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。两线距离5～8mm，线应细致、均匀。37℃烘干，封装备用。
实施例5胶体金、金标记单克隆抗体的制备1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000ml1％氯金酸溶液配方10g氯金酸；双蒸去离子水定容至1000ml。
(2)柠檬酸三钠的配制用双蒸去离子水溶解柠檬酸三钠，配成1％溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期容至1000ml。
(3)0.1M碳酸钾的配制用双蒸去离子水配制，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml 0.1M碳酸钾溶液配方13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。
(4)2％PEG-20000的配制用双蒸去离子水配制，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml2％PEG-20000溶液配方20g PEG-20000；双蒸去离子水定容至1000ml。
(5)标记洗涤保存液的配制2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％叠氮钠(NaN3)，0.01M pH7.2 PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml标记洗涤保存液配方20gBSA，0.5g NaN3，0.01M pH7.2 PBS溶液定容至1000ml。
2、胶体金的制备用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。
3、胶体金标记单克隆抗体的制备用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按8～10μg抗体/ml胶体金加入抗鸡IgG Fc单克隆抗体，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％，静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。
实施例6金标垫的制备1、封闭液的配制
2％ BSA，0.1％ Triton X-100、0.05％ NaN3，0.01M pH7.2 PBS溶液，0.22μm微孔滤膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方20g BSA，0.5g NaN3、1ml Triton X-100、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000ml。
2、金标垫的制备；将金标垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。
实施例7试纸条样品垫的制备1、封闭液的配制2％ BSA，0.1％Triton X-100、0.05％ NaN3，0.01M pH7.2 PBS溶液，0.22μm微孔滤膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方20g BSA，0.5g NaN3、1ml Triton X-100、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000ml。
2、样品垫的制备将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。
实施例8试纸条的组装将硝酸纤维素膜、玻璃纤维、吸收垫、样品垫按图依次层叠起来，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装。4～8℃保存，有效期一年；常温保存，有效期6个月。
实施例9快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒组成1、快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒包括①、试纸条 一包(10条/包)②、样品稀释液 一瓶(10ml/瓶)③、带底座的96孔酶标板条 一条(12孔/条)2、相关溶液的配制样品稀释液样品稀释液为8％ NaCl溶液。配制方法80g NaCl，加蒸馏水定容至1000ml。
实施例10本发明试剂盒的使用方法1、样品制备鸡血清样品的制备，取5μl待捡血清置于96孔板孔内，用8％盐水稀释至100μl；或者将血清样品用8％盐水稀释20倍后，取100μl置于96孔板孔内。鸡卵黄样品的制备，取5μl待捡卵黄置于96孔板孔内，用8％盐水稀释至100μl；或是将卵黄样品用8％盐水稀释20倍后，取100μl置于96孔板孔内。鸡肌肉组织浸出液样品的制备，取约1g肌肉组织置于玻璃匀浆器内，加入2ml 8％盐水，充分匀浆后，3,000rpm离心15min，取上清液100μl置于96孔板孔内。
2、检测取出试剂盒，室温平衡20分钟；打开包装袋，取出试纸条，将试纸条的样品垫端浸入制备好的样品中，15～20分钟内判定结果。
3、结果判定如图5所示，当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阴性，记为“-”；当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，同时也出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阳性，记为“+”；检测线颜色越深说明被检测样品的抗体水平越高；当试纸条没出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果都判为检测试纸条失效，应废弃。
实施例11快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒的制备及应用1、快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒的制备按实施例1-10的方法制备快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒。
2、快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒的应用2.1、鸡标准血清的检测①特异性试验分别将标准的鸡禽流感病毒H5、H7、H9亚型阳性血清、鸡新城疫(ND)阳性血清、鸡传染性支气管炎(IB)阳性血清、鸡传染性法氏囊(IBD)阳性血清(以上各标准血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)按实施例8所述本发明方法(GICA)进行试验。结果见表1。表1显示，本发明检测试纸条与标准的禽流感病毒H5、H7、H9亚型阳性血清试验后，质控线及检测线均出现明显的紫红色条带；而与生理盐水(空白)、SPF鸡阴性血清、标准鸡新城疫病毒(ND)、鸡传染性法氏囊病毒(IBD)、鸡传染性支气管炎病毒(IB)等阳性血清试验后，检测线不出现紫红色条带。这表明本发明试纸条特异性高，与鸡的其他呼吸道疫病病毒抗体无任何交叉反应。
表1 应用本发明的检测试纸条对鸡标准血清检测结果

②敏感性试验 将鸡禽流感病毒H5、H7、H9亚型标准阳性血清(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)分别进行倍比稀释，最终稀释度为1∶2048，各取100μl稀释好的样品按本发明方法(GICA)进行试验。同时，用常规血凝抑制(HI)和琼脂扩散法(AGID)沈关心，周汝麟。现代免疫学实验技术(第二版) [M]，湖北科学技术出版社，2002测定H5、H7、H9标准阳性血清的效价。试验结果见表2。结果表明，本发明检测试纸条法的灵敏度高于琼脂扩散试验，与血凝抑制法的效果相当。
表2 本发明与常规检测方法对禽流感病毒抗体检测的敏感性试验结果

2.2、送检鸡血清样品的检测从湖北、河南等地的3个鸡场共采集166份鸡血清，按本发明方法(GICA)进行试验。同时，用常规血凝抑制(HI)和琼脂扩散方法(AGID)测定效价。结果见3。表3显示，GICA法检出率为56％(93/166)，HI法为58％(97/166)，二者符合率为84％(78/93，HI阳性/GICA阳性)；AGID法检出率为30％(50/166)，比GICA法检出率低，是因为GICA法的敏感度比AGID高128倍(8/1024)，使得GICA法阳性时而AGID法为阴性，二者的符合率为90％(45/50，AGID阳性/GICA阳性)。
表3 本发明的试纸条法与几种常规方法的比较检测效果

2.3 鸡卵黄样品的检测一般来讲，从鸡卵黄液中检测禽流感抗体时，卵黄液稀释1倍后的效价与血清效价相当。因此，也能直接用鸡的卵黄液来代替血清进行禽流感抗体效价的检测。从河南、湖北等地的鸡场随机抽取成年蛋鸡鸡蛋100枚，按本发明方法(GICA)进行试验。同时，用常规方法血凝抑制及琼脂扩散测定效价。结果见表4，显示GICA法检出率为68％(68/100)，HI法为72％(72/100)，二者符合率为96％(65/68，HI阳性/GICA阳性)；AGID法检出率为44％(44/100)，比GICA法检出率低，是因为GICA法的敏感度比AGID高128倍(8/1024)，使得GICA法阳性时而AGID法为阴性，二者的符合率为98％(43/44，GICA阳性/AGID阳性)。
表4 本发明的试纸条法与几种常规检测方法的比较


2.4 鸡肌肉组织浸出液样品的检测；从湖北某鸡场随机抽取成年蛋鸡100羽，采集血清后安常规方法进行HI试验和AGID试验，再将鸡处死后取肌肉组织，按本发明方法(GICA)进行试验，结果见表5。结果表明，GICA法检出率为52％(52/100)，HI法为55％(55/100)，二者符合率为100％(52/52，HI阳性/GICA阳性)；AGID法检出率为27％(27/100)，比GICA法检出率低，是因为GICA法的敏感度比AGID高128倍(8/1024)，使得GICA法阳性时而AGID法为阴性，二者的符合率为93％(25/27，GICA阳性/AGID阳性)。说明本发明的检测试纸条完全可以作为常规方法用于市场上鸡肉产品禽流感的快速检测。
表5 本发明试纸条法与几种常规方法对鸡肌肉组织浸出液样品检测效果的比较

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种杂交瘤细胞系BDRPDP，保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC-C200501。
2.一种能够专门识别鸡IgG Fc的单克隆抗体。
3.包含权利要求2的检测试剂盒。
4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所说的试剂盒是检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒。
5.一种适用于检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒，它包含盒体、设在盒体内的96孔酶标板条、试纸条和样品稀释液。
6.权利要求5所述的一种适用于检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒，其中的试纸条是由样品垫、吸收垫、涂覆有金标记抗鸡IgG Fc单克隆抗体的金标垫、包被有NP重组蛋白的检测线(4)和包被有抗鼠IgG的质控线(5)的硝酸纤维素膜依次按吸收垫(1)、硝酸纤维素膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)的顺序粘贴在不吸水的支撑薄片(7)上构成。
7.权利要求5和6所述的一种适用于检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒，其中的样品稀释液为8％盐水。
8.权利要求3-7任一项所述的试剂盒在检测鸡禽流感病毒抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于快速检测鸡禽流感病毒抗体的试剂盒。该试剂盒包含盒体、设在盒体内的96孔酶标板条、试纸条和样品稀释液。其中的试纸条是由样品垫、吸收垫、涂覆有金标记抗鸡IgG Fc单克隆抗体的金标垫、包被有NP重组蛋白的检测线和包被有抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜依次按吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫的顺序粘贴在不吸水的支撑薄片上构成。本发明还涉及一种能产生特异单克隆抗体的杂交瘤细胞系BDRPDP和能够专门识别鸡IgGFc的单克隆抗体的制备。所述的试剂盒检测禽流感病毒抗体具有特异性强、灵敏度高、操作简便和诊断快速的显著优点。
文档编号C12N5/16GK1687406SQ20051001152
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月1日 优先权日2005年4月1日
发明者毕丁仁, 彭大鹏, 李自力, 华艳, 胡思顺, 肖运才, 石德时, 刘梅, 许清荣 申请人:华中农业大学