具有增强的cck和glp-1释放活性的蛋白水解产物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了具有增强的胆囊收缩素(CCK)和／或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)释放活性的蛋白水解产物组合物，以及掺入了所述蛋白水解产物组合物的食品形式，其能用于提升饱腹感。
【专利说明】具有增强的CCK和GLP-1释放活性的蛋白水解产物组合物
【技术领域】
[0001]本发明一般涉及蛋白水解产物。具体地，本发明的蛋白水解产物具有胆囊收缩素(CCK)和/或胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)释放活性。该蛋白水解产物可用于提供营养物质和/或提升饱腹感。
【背景技术】
[0002]在美国和全世界，超重和肥胖者以及与体重增加相关联的疾病的数量和比例正在上升。虽然深层的原因不是单一的，一个诱因可能是许多人久坐不动的生活方式以及同时增加的高热量食物消费，其中包括“快餐”。大多数“快餐”趋于高脂和/或高糖。
[0003]对抗流行性体重增加的一个可行目标是CCK。CCK是一种由肠胃细胞响应于营养物质而释放至循环系统的肽激素，具体地为一餐摄入的蛋白或脂质。在中枢和外周神经系统中CCK充当神经递质和神经调节物质。CCK从响应于餐后进入胃肠空腔的营养物质(例如，蛋白和脂肪)的十二指肠和空肠的细胞中释放出来。一旦释放出来，CCK启动了许多协调的反应以促进消化并调节食物摄入量，包括介导胆汁从胆囊排空，调节从胰腺释放消化酶，通过调节幽门括约肌控制胃排空，以及通过迷走神经传入神经元将神经信号传入中枢神经系统。据信神经元CCK介导了在CNS内的许多事件，包括调节多巴胺神经传递和致焦虑作用，以及影响认知和痛觉(参见例如J.N.Crawley和R.L.Corwin, 1994, Peptides,15:731-755 ；N.S.Baber, C.T.Dourish 和 D.R.Hill, Pain (1989)，39 (3)，307-28 ；以及 P.DeTullio, J.Delarge 和 B.Pirotte, Expert Opinion on Investigational Drugs (2000),9(1)，129-146)。CCK已经表明通过两种受体亚型介导了各种不同的激素和神经调节功能:CCK-A (CCK-1)和 CCK-B (CCK-2)亚型(参见例如 G.N.Woodruff 和 J.Hughes, Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(1991)，31:469-501)。CCK-1 和 CCK-2 受体亚型属于七跨膜 G 蛋白偶联受体超家族。许多研究表明CCK通过CCK-1受体介导了饱腹感效应，其通过迷走神经传入将中继餐后饱腹信号传入CNS从而引起饱腹的“感觉”(参见例如G.P.Smith等人，Science213 (1981)，第 1036-1037 页;和 J.N.Crawley 等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，257 (1991)，第 1076-1080 页)。
[0004]CCK施加了一些产生饱腹感的直接作用，包括抑制胃排空，抑制胃酸分泌，以及刺激胆囊收缩。无论是通过这些直接影响胃排空及小肠消化或通过中枢神经系统的途径，CCK引起饱腹感，这通常会导致更少的热量(卡路里)消耗。
[0005]对抗流行性体重增加的另一个可行目标是GLP-1。GLP-1已被描述为具有大阵列效应的肠促胰岛素。GLP-1发现于1984年，被认为是重要的肠促胰岛素(Nauck，M.A.；Kleine, N.；Orskov, C.；Hoist, J.J.；ffillms, B.；Creutzfeldt, ff.，Diabetologial993,36,741-744)。GLP-1由响应于葡萄糖和脂肪酸的远侧回肠释放，然而，已知肽类直接诱导和 / 或调节 GLP-1 的释放(Hira T 等人，(2009)Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol297:G663_G671)。GLP-1在餐后被释放至循环系统并强效刺激葡萄糖依赖性的β-胰腺细胞释放胰岛素。许多附加的效应也归因于GLP-1，包括刺激胰岛素生物合成、恢复胰岛的葡萄糖敏感性以及刺激葡萄糖转运蛋白GLUT-2和葡糖激酶表达的增加。GLP-1还具有许多效应:调节细胞群、刺激现有的细胞的复制和生长、抑制细胞凋亡以及来自导管前体细胞的新细胞的再生，这导致减少肝脏葡萄糖输出。GLP-1的有益的胰外作用也有报道诸如直接作用于降低肝脂含量和改善心功能(Abu-Hamdah R.等人，J Clin Endocrinol Metab.2009Jun ;94(6): 1843-52.Epub2009Mar31)。在食道，GLP-1是强效的蠕动和胃排空的抑制剂，并已被证明能够抑制胃酸分泌。抑制胃排空导致降低食物摄入以及随着时间推移降低体重(Flint, A.；Raben, A.；Astrup, A.；Hoist, J.J.,J Clin Inv1998,101,515-520 ；Zander, M.；Madsbad, S.；Madsen, J.L.；Hoist, J.J.,Lancet2002，359，824-830)。GLP-1也被证明对食物摄入有中枢影响，其通过控制食欲的下丘脑中心的GLP-1受体的作用控制食欲(Barber TM等人，(2010)Maturitas doi:10.1016/j.maturitas.2010.06.018)。
[0006]鉴于肥胖流行以及缺乏有效对抗方法，人们需要有营养的、容易获得的成分或食物产品，其可以食用并促进体重减轻或控制体重。食品应不仅美味而且还应是富有营养的；这就是说，食品应相对低脂、高蛋白、并含有必需的微量营养物质(例如，维生素和矿物质)。此外，如果成分或食品能够增加CCK和/或GLP-1的释放也将会是十分有益的。
[0007]为此，发明涉及新的蛋白水解产物，以及包含相同蛋白水解产物的食物形式，其能够促进体重控制和饱腹感。
【发明内容】
[0008]本发明提供了能够刺激CCK和/或GLP-1释放活性的蛋白水解产物组合物，并且其能用于促进体重控制和饱腹感。
[0009]在某些实施例中，本发明涉及包含多肽片段混合物的蛋白水解产物组合物，其中蛋白水解产物组合物刺激CCK和GLP-1释放活性。
[0010]在其它的某些实施例中，本发明涉及包含蛋白水解产物组合物的食物产品，所述蛋白水解产物组合物包含多肽片段混合物，其中蛋白水解产物组合物刺激CCK和GLP-1释放活性。
[0011]在其它的某些实施例中，本发明涉及诱发饱腹感的方法，其包括摄入包含多肽片段混合物的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物刺激CCK和GLP-1释放活性。
[0012]在其它的某些实施例中，本发明涉及诱发饱腹感的方法，其包括摄入包含蛋白水解产物组合物的食物产品，所述蛋白水解产物组合物包含多肽片段混合物，其中所述蛋白水解产物组合物刺激CCK和GLP-1释放活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1A =STC-1细胞与未消化或已消化的完整蛋白或蛋白水解产物孵育后释放的CCK。
[0014]图1B =STC-1细胞与未消化或已消化的完整蛋白或蛋白水解产物孵育后释放的GLP-1。
[0015]图2:根据尺寸排阻色谱法的例证性的色谱。[0016]图3:—定pH值范围内的蛋白水解产物组合物的溶解度。
[0017]图4:在本文所述不同酶和处理条件下生成的不同大豆蛋白水解产物的CCK和GLP-1释放活性图。
[0018]图5A:由与也刺激GLP-1释放的大豆水解产物孵育后的STC-1细胞释放的CCK的
剂量反应。
[0019]图5B:由与也刺激CCK释放的大豆水解产物孵育后的STC-1细胞释放的GLP-1的
剂量反应。
【具体实施方式】
[0020]一般来讲，已知蛋白刺激动物(包括人)肠道的肠内分泌细胞释放CCK而葡萄糖刺激释放 GLP-1 (Liddle, R.A.等人，(1986) Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.251(14):G243_G248 Jang H-J 等人(2007)PNAS104(38):15069-15074)。在肠内分泌细胞模型STC-1中大豆蛋白水解产物质已表明刺激了 CCK的释放(PCT申请PCT/US2009/069867)。由于蛋白被认为调节了 GLP-1 的释放(Hira T 等人(2009)Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol297:G663_G671),本发明研究蛋白水解产物诱导GLP-1释放的效应，并且其是本发明的主题。
[0021]在餐后，蛋白在低pH下经过胃酶诸如胃蛋白酶消化，进入到肠道，在肠道上部被胰消化酶(胰酶)混合物进一步消化。我们在图1中表明经受胃蛋白酶和胰酶消化的蛋白水解产物没有丧失诱导肠内分泌细胞的CCK和GLP-1释放活性的能力。在体外消化的蛋白或蛋白水解产物的可溶性级份(2mg/mL蛋白浓度)与STC-1细胞分别孵育4小时和2小时以测量CCK和GLP-1。收集细胞培养基并用ELISA检测CCK和GLP-1。对照大豆蛋白水解产物为FXP950 (可以商品名SU`PRO? FP950商购自Solae, LLC)。测试的未受损的蛋白为大豆蛋白分离物Supro? 661和乳清分离蛋白ΑΡι?‘.:水解的大豆蛋白是由酶TL-1 (来自尖抱键抱菌(Fusarium oxysporum)的膜蛋白酶样蛋白酶(TL-1) (SWISSPR0T N0.P35049)(美国专利5，288，627和5，693，520，其中每个据此全文引入以供参考))消化产生的。本文所述用以生成数据的刺激蛋白水解产物消化的方法修改自以前公布的Schasteen的步骤，模拟了体内胃肠的消化(Schasteen, C.S.等人，(2007)Correlation of an ImmobilizedDigestive Enzyme Assay With Poultry True Amino Acid Digestibility for SoybeanMeal.Poultry Science86(2), 343-348)和 Higaki([Higaki, N.等人，(2006)Biosc1.Biotechnol.，Biochem.70 (12)，2844-2852)。蛋白样品溶解在 20 体积的 0.01M HCl 中，并且用胃蛋白酶(Sigma-Aldrich P7012)以I:200(w/w)的酶-底物比率在pH2.3和37°C下消化I小时。在胃蛋白酶消化后，将2.5M NaOH加入到混合物中以将pH调节至8.0,并且以1:200 (w/w)的比率加入胰酶(Sigma-Aldrich P3292)并继续再消化4小时。通过在预消化或已消化样品中的伯胺基团和邻苯二甲醛(OPA)的反应，对比酸水解后(110°C，24小时)样品中存在的伯胺的总量，来测定水解的程度(被称为“0ΡΑ方法”)。
[0022]如本文所教授和所述，体外已消化的水解产物与体外已消化的未受损大豆蛋白对照相比，显示出在STC-1细胞中显著更高的CCK和GLP-1诱导作用。以五个蛋白浓度检测已消化的样品。对于CCK释放，蛋白浓度范围为0.07至6.0mg/mL,并且对于GLP-1释放，蛋白浓度范围为0.25至4.0mg/mL。在体外消化的水解产物(以模拟体内消化)与体外消化的未受损的大豆蛋白相比，可看到更高水平的CCK和GLP-1释放，这表明在体内所述水解产物将会诱导肠里的肠内分泌细胞释放更多CCK和GLP-1，其将导致增加动物包括人的饱腹感。
[0023]另外，本发明的蛋白水解产物展示出一个或多个优点，包括例如增加了相对于例如在酸性PH(例如3-4)下未水解的大豆蛋白的溶解度和基于感官数据的快感得分计，表明在各种各样的食品应用中这些将是合适的成份。因此，本发明的蛋白水解产物是具有良好前景的新成份，其可被掺入各种食品中，或单独使用，并且它们可定向用于并由寻找具有增强饱腹感效果的食品的个人用于帮助控制食品摄入、保持或增加瘦身体质量和/或维持或失去非瘦身体质量。
[0024]1.制备蛋白水解产物的方法。
[0025]本发明一方面提供了蛋白水解产物及其制备方法。所述方法包括将蛋白材料与一种或多种酶接触，这些酶将蛋白材料裂解为可诱导CCK和/或GLP-1释放的多肽片段。在本发明的某些方面，多肽片段诱导CCK的释放。在本发明的其它方面，多肽片段诱导GLP-1的释放。在本发明另外的其它方面，多肽片段诱导CCK和GLP-1的释放。反应物和反应参数在下文中详述。
[0026](a)蛋白材料。
[0027]合适的蛋白材料的非限制性例子包括植物，诸如豆科或非豆科植物(例如大豆和其它豆科植物，桃豆(埃及豆)、扁豆、玉米、豌豆、卡诺拉、向日葵、高粱、稻、苋属植物、马铃薯、木薯、竹竽、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麦、燕麦、黑麦、大麦、荞麦、木薯、黑小麦、粟、大麻等)，坚果和种子(例如，杏仁、腰果、榛子、大麻种子、花生、南瓜种子、芝麻、向日葵种子、核桃仁等)，动物蛋白(例如，蛋类蛋白、乳品蛋白、肌肉蛋白、明胶等)，以及它们的组合。
[0028]在具体的实施例中，所述蛋白材料来源于大豆。可在本发明方法中使用多种大豆蛋白以生成大豆蛋白水解产物。一般来讲，大豆蛋白材料根据本领域已知的方法来源于全大豆。全大豆可以是标准大豆(即，非转基因大豆)、转基因大豆(例如具有修饰的油的大豆、具有修饰的碳水化合物的大豆、具有修饰的蛋白亚基的大豆等等)或它们的组合。大豆蛋白材料的合适例子包括大豆提取物、豆浆、豆浆粉、大豆凝乳、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白分离物、大豆蛋白浓缩物、大豆乳清蛋白、以及它们的级份和混合物。
[0029]在一个实施例中，所述方法中所用的大豆蛋白材料为大豆蛋白分离物(也称为大豆分离蛋白或ISP)。一般来讲，大豆蛋白分离物具有按无水基计至少约90%大豆蛋白的蛋白含量。大豆蛋白分离物可包括完整的大豆蛋白或部分水解的大豆蛋白。大豆蛋白分离物可具有高含量的不同亚基如7S、11S、2S等。本发明可使用的大豆蛋白分离物的非限制性例子可商购获得，例如从Solae，LLC (St.Louis, MO)商购获得，并且包括SUP丨<(广
500E、SUPRO* 620、SUPRO'* 760, SUPRO# 670、SUPEO* 710, SUPRO* EX33、
SlJPROli 313。
[0030]在另一个实施例中，大豆蛋白材料为大豆蛋白浓缩物，其具有按无水基计约65%至小于约90%大豆蛋白的蛋白含量。用于本发明中的合适的大豆蛋白浓缩物的例子包括例如 ALPHA* DSP-C、Procon?, ALPHA* 12 和 ALPHA* 5800，其从 Solae，LLC 商购获得。作为另外一种选择，大豆蛋白浓缩物可与大豆蛋白分离物共混作为蛋白材料的来源替代部分大豆蛋白分离物。
[0031]在另一个实施例中，大豆蛋白材料是大豆粉，其具有按无水基计约49%至约65%大豆蛋白的蛋白含量。大豆粉可以是脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、或全脂大豆粉。大豆粉可以与大豆蛋白分离物或大豆蛋白浓缩物共混。
[0032]当使用大豆粉时，原料通常为脱脂大豆粉或大豆片。全脂大豆包含按重量计约40%的蛋白和按重量计约20%的油脂。当脱脂大豆粉或大豆薄片构成起始蛋白材料时，所有全脂大豆可经由常规方法脱脂。例如，可将大豆清洗、脱壳、破碎、通过一系列压片辊，然后使用己烷或其它适宜溶剂使其经受溶剂萃取，以提取油并且制得“脱脂薄片”。脱脂薄片可被碾磨以制得大豆粉。虽然所述方法目前还没有用于全脂大豆粉，但是据信全脂大豆粉也可用作蛋白源。然而，在处理全脂大豆粉时，很可能需要采用分离步骤，诸如三级离心以移除油脂。
[0033]在另一个实施例中，大豆蛋白材料为一种或多种大豆储存蛋白，其已经在例如离心沉淀的基础上被分离成主要级份(15S、11S、7S和2S)。一般来讲，IlS级份高度富集了大豆球蛋白，并且7S级份高度富集了 β_大豆伴球蛋白。
[0034]在另一个实施例中，蛋白材料可来自非大豆的植物。作为非限制性的例子，合适的植物包括其它豆科植物、桃豆(埃及豆)、扁豆、玉米、豌豆、卡诺拉、向日葵、高粱、稻、苋属植物、马铃薯、木薯、竹竽、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麦、燕麦、黑麦、大麦、荞麦、木薯、黑小麦、粟、大麻，以及它们的混合物。在具体的实施例中，植物蛋白材料为卡诺拉粗粉、低芥酸菜籽蛋白物、低芥酸菜籽蛋白浓缩物、或它们的组合。在另一个实施例中，植物蛋白材料为玉米或谷物蛋白粉、玉米或谷物蛋白浓缩物、玉米或谷物分离蛋白、玉米或谷物胚芽、玉米或谷物谷蛋白、玉米或谷物谷蛋白粗粉、玉米或谷物面粉、玉米蛋白、或它们的组合。在另一个实施例中，植物蛋白材料为大麦粉、大麦浓缩蛋白、大麦分离蛋白、大麦粗粉、大麦面粉、或它们的组合。在另一个替代实施例中，植物蛋白材料为羽扇豆粉、羽扇豆分离蛋白、羽扇豆蛋白浓缩物、或它们的组合。在另一个替代实施例中，植物蛋白材料为燕麦片、燕麦粉、燕麦蛋白粉、燕麦分离蛋白、燕麦蛋白浓缩物、或它们的组合。在另一个实施例中，植物蛋白材料为豌豆粉、豌豆分离蛋白、豌豆蛋白浓缩物、或它们的组合。在另一个实施例中，植物蛋白材料为马铃薯蛋白粉、马铃薯分离蛋白、马铃薯蛋白浓缩物、马铃薯粉、或它们的组合。在另一个实施例中，植物蛋白材料为是米粉、稻米粗粉、稻米蛋白粉、稻米分离蛋白、稻米蛋白浓缩、或它们的组合。在另一个替代实施例中，植物蛋白材料为小麦蛋白粉、小麦谷朊粉、麦芽精、面粉、小麦分离蛋白、小麦蛋白浓缩物、可溶性小麦蛋白、或它们的组合。
[0035]在其它实施例中，所述蛋白材料来源于动物来源。在一个实施例中，所述动物蛋白材料来源于蛋类。合适的蛋类蛋白的非限制性例子包括蛋粉、干燥蛋固体、干燥蛋清蛋白、液体蛋清蛋白、蛋清蛋白粉、分离卵清蛋白、以及它们的组合。蛋类蛋白可来源于例如鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋、或其它鸟类的蛋。在另一个替代实施例中，所述蛋白材料来源于乳品来源。合适的乳品蛋白包括例如脱脂奶粉、分离乳蛋白、乳蛋白浓缩物、酸酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙等)、乳清分离蛋白、乳清浓缩蛋白、以及它们的组合。所述乳蛋白材料可来源于例如奶牛、山羊、绵羊、驴子、骆驼、羊驼、牦牛、水牛等。在另一个实施例中，所述蛋白可来源于陆栖动物或水栖动物的肌肉、器官、结缔组织、或骨骼。在某些实施例中，所述动物蛋白为明胶，它通过部分水解胶原制备，胶原提取自牛或其它动物的骨、结缔组织、器官等等。
[0036]在本发明中也设想了使用大豆蛋白材料和至少一种其它蛋白材料的组合。即，可由大豆蛋白材料和至少一种其它蛋白材料的组合来制备蛋白水解产物组合物。在一个实施例中，由大豆蛋白材料和一种其它蛋白材料的组合来制备蛋白水解产物组合物。在另一个实施例中，由大?蛋白材料和两种其它蛋白材料的组合来制备蛋白水解广物组合物。在另外的实施例中，由大豆蛋白材料和三种其它蛋白材料的组合来制备蛋白水解产物组合物。
[0037]在其它实施例中，蛋白水解产物组合物还包含至少一种源于蛋白材料的未水解蛋白。适用的未水解蛋白的非限制性例子包括干奶粉、脱脂干奶粉、乳蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙等)、乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白、和大豆蛋白分离物。
[0038]组合物中使用的来源于大豆蛋白材料的蛋白和来源于其它蛋白原料的蛋白的浓度可能并且将有所不同。所述大豆蛋白材料的蛋白量的范围可为用于组合物的总蛋白的约1%至约99%。在某些实施例中，来源于所述大豆蛋白材料的蛋白量的范围可为用于组合物的总蛋白的约I %至约99、约5%至约95%、约10%至约90%、约15%至约85%、约20%至约80%、约25%至约75%、约30%至约70%、约35%至约65%、约40%至约60%、约45%至约55%、或约50%。同样，所述其它(至少一种)蛋白材料的范围可为用于组合物的总蛋白的约1%至约99、约5%至约95%、约10%至约90%、约15%至约85%、约20%至约80%、约25%至约75%、约30%至约70%、约35%至约65%、约40%至约60%、约45%至约55%、或约50%。
[0039](b)蛋白浆液。
[0040]在本发明的方法中，通常将蛋白材料混合或分散在水中以形成按重量计包括约1%至约40%蛋白(按原样计)的浆液。在某些实施例中，浆液可包含(按原样)按重量计约1%至约40%的蛋白、约5%至约35%的蛋白、约10%至约25%的蛋白、或约15%至约20%的蛋白。在具体的实施例中，浆液可包含(按原样)按重量计少于约10%的蛋白。在另一个具体的实施例中，浆液可包含(按原样)按重量计约2%、约4%、约6%、约8%、或约10%的蛋白。水可包括食品级分散剂诸如乙醇、甘油等。
[0041 ] 蛋白材料分散在水中后，蛋白材料的浆液可加热至约70V至约90°C，时间约2分钟至约20分钟(或至较高温度约110°C至约177°C，时间约2秒至约30秒)以使假定的内源性蛋白酶抑制剂失活。通常，对蛋白浆液的PH和温度进行调节以优化水解反应，特别是确保水解反应中使用的消化酶的功能接近其最佳活性水平。所述蛋白浆液的PH可根据本领域一般已知的方法进行调节及监控。所述蛋白浆液的PH可调节并保持在约pH2.0至约pHll.0。在其它实施例中，所述蛋白浆液的pH可调节并保持在约2.0至约3.0、约3.0至约
4.0、约4.0至约5.0、约5.0至约6.0、约6.0至约7.0、约7.0至约8.0、约8.0至约9.0、约9.0至约10.0、或约10.0至约11.0。在另一个实施例中，蛋白浆液的pH可调节并保持在约pH6.0至约pH9.0。在另一个实施例中，蛋白浆液的pH可调节并保持在约pH7.0至约PH8.0。根据本领域已知的方法，在水解反应期间所述蛋白浆液的温度可调节并保持在约25°C至约80°C。在某些实施例中，根据本领域已知的方法，在水解反应期间所述蛋白浆液的温度可调节并保持在约50°C。所述温度不应到达让显著量的水解酶失活的地步(例如，通过变性)。
[0042](C)酶消化。
[0043]一般通过将酶或组合酶加入到蛋白材料浆液中启动水解反应。酶通常可为食品级酶，在约2.0至约11.0的pH和约25°C至约80°C的温度具有最佳活性。酶可来源于植物、动物或微生物。
[0044]在本发明的某些实施例中，所述酶为内肽酶。内肽酶优选作用于远离N和C末端的肽链内部区域。多个内肽酶适用于实施本发明。在一个实施例中，肽酶为TL-1。在另一个实施例中，肽酶为来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的细菌蛋白酶，商售名为NFUTRASF,'.[0045]在本发明的其它实施例中，内肽酶为来自Nocardiopsis prasina的丝氨酸蛋白酶(SEQ ID N0:2国际申请WO 2005035747)。在另一个实施例中，内肽酶为来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的枯草杆菌蛋白酶，该菌株以商品名/\LC/\l..,ASL.:1:购自Novozymes (Bagsvaerd, Denmark)。在另一个实施例中，内肽酶为丝氨酸蛋白酶，也称为谷氨酰基内肽酶(称为“GE”)，它来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(UNIPROT:P80057公布并表征于美国专利4，266,031,5,874, 278和5, 459, 064以及国际申请W001/16285、W092/13964、W091/13553和W091/13554中，所述文献均全文以引用方式并入本文)。在一个替代实施例中，内肽酶为赖氨酰内肽酶(称为“LE”)，它来自水解无色杆菌(Achromobacter lyticus) (UNIPROT:P15636)。在另一个实施例中，内妝酶为来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的更纯化形式的枯草杆菌蛋白酶(称为“Aka丨asef 2”)。在其它实施例中，内肽酶为来自茄病镰孢菌(Fusarium solani)的胰蛋白酶样蛋白酶(GENESEQP:ADZ80577)。合适的酶还包括例如SPl (蛋白酶来自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis sp.)的 NRRL 18262，公开于 WO 2001/058276 和 WO 2009/155557)、枯草杆菌蛋白酶2(S2)、金属蛋白酶I (MPl)、以及天门冬氨酸蛋白酶I (ASP-1)。其它合适的酶包括例如菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、和弹性蛋白酶。在本发明的其它实施例中，使用了内肽酶的组合。
[0046]在本发明的另一个实施例中，内肽酶混合了至少一种外肽酶。一般来讲，外肽酶仅仅作用于接近肽链N或C末端的端部。那些作用于游离N末端释放例如单氨基酸残基(即氨基肽酶)、二肽(即二肽肽酶)或三肽(即三肽肽酶)。所述外肽酶作用于游离C末端释放例如单氨基酸(即羧肽酶)或二肽(即肽基二肽酶)。一些外肽酶是二肽特异性的(即二肽酶)或除去异肽键取代的、环化的或连接的末端残基。异肽键为排除那些羧基基团与α-氨基连接的肽键，并且酶的这种基团特征在于Ω肽酶。
[0047]外肽酶的非限制性例子包括例如来自米曲霉(Aspergillus oryzae) (UNIPROT:Q2TZ11)的羧肽酶 D、来自米曲霉(Aspergillus oryzae) (UNIPROT:Q2TYA1)的羧肽酶 Y、来自米曲霉(Aspergillus oryzae)(国际申请W096/28542,其全文以引用方式并入本文)的氨基肽酶、和来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) (UNIPROT:Q65DH7)的氨基肽酶。
[0048]取决于所需的水解度和水解反应的持续时间，加入到蛋白材料中的酶量可能并且将会不同。所述酶量的范围可为每千克固体约Img至约5000mg酶蛋白。在本发明的某些实施例中，所述酶量的范围为每千克固体约Img至约IOOOmg酶蛋白、每千克固体约Img至约900mg酶蛋白、每千克固体约Img至约800mg酶蛋白、每千克固体约Img至约700mg酶蛋白、每千克固体约Img至约600mg酶蛋白、每千克固体约Img至约500mg酶蛋白、每千克固体约Img至约400mg酶蛋白、每千克固体约Img至约300mg酶蛋白。
[0049]在其它某些实施例中，所述酶量的范围为每千克固体约Img至约250mg酶蛋白。在另一个实施例中，所述酶量的范围为每千克固体约Img至约200mg酶蛋白。在另一个实施例中，所述酶量的范围为每千克固体约Img至约IOOmg酶蛋白。在另一个实施例中，所述酶量的范围为每千克固体约Img至约50mg酶蛋白。在另一个实施例中，所述酶量的范围为每千克固体约Img至约25mg酶蛋白。在另一个实施例中，所述酶量的范围为每千克固体约Img至约IOmg酶蛋白。在具体的实施例中，所述酶量的范围为每千克固体约75mg至约150mg酶蛋白。在其它具体的实施例中，所述酶量为每千克固体约75mg酶蛋白。在另外的其它具体的实施例中，所述酶量为每千克固体约IOOmg酶蛋白。在其它具体的实施例中,所述酶量为每千克固体约150mg酶蛋白。
[0050]技术人员将会认识到，取决于酶、蛋白材料和期望的水解度，水解反应的持续时间可能并且将会不同。一般来讲，水解反应的持续时间可以在几分钟至多个小时的范围内，诸如约30分钟至约48小时。为了终止水解反应，可将所述组合物加热至足以失活酶的温度。例如，把所述组合物加热至大约90°C将基本上热失活大多数酶。取决于所用的酶，其它失活方法包括冷却至低于10°C和/或将pH降低至低于约2.0。
[0051]I1.蛋白水解产物。
[0052]本发明的蛋白水解产物组合物一般来讲增强了 CCK和GLP-1的释放，从而在食用时提升了饱腹感。在某些实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物包含可溶性级份，不溶性级份、或它们的组合。在其它实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物具有一个或多个本文所述的性质(包括例如所用的酶、DH、CCK释放活性的效能、GLP-1释放活性的效能、分子量分布、溶解度、或其它特性)。
[0053]如例子中所示，本发明的蛋白水解产物组合物刺激了 CCK和/或GLP-1释放活性。具体地，经受胃蛋白酶和胰酶消化的本发明的蛋白水解产物组合物没有丧失诱导肠内分泌细胞的CCK和GLP-1释放活性的能力。体外已消化的水解产物(以模拟体内消化)与体外已消化的未受损的大豆蛋白相比，可看到更高水平的CCK和GLP-1释放，这表明在体内所述水解产物将诱导肠里的肠内分泌细胞释放更多CCK和GLP-1，其将导致增加动物包括人的饱腹感。
[0054]在本发明的某些实施例中，本文所述的蛋白水解产物组合物刺激了 CCK释放活性。在其它的某些实施例中，本文所述的蛋白水解产物组合物刺激了 GLP-1释放活性。在其它的某些实施例中，本文所述的蛋白水解产物组合物刺激了 CCK和GLP-1释放活性。在特定实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物是已消化的(即，胃蛋白酶-胰酶消化的)、未消化的(即未被胃蛋白酶-胰酶消化的)，或它们的组合。
[0055]在本发明的一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激CCK释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞4小时而释放的CCK的约50%至约1000%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激CCK释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞4小时而释放的CCK的约50%至约500%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激CCK释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞4小时而释放的CCK的约50%至约400%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激CCK释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞4小时而释放的CCK的约50%至约300%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激CCK释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞4小时而释放的CCK的约50%至约200%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激CCK释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞4小时而释放的CCK的约50% 至约 100%。
[0056]在特定实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激CCK释放活性为用2mg/mlFXP950刺激STC-1细胞4小时而释放的CCK的约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %、约 100%、约 110%、约 120%、约 130%、约 140%、约 150%、约 160%、约 170%、约 180%、约190%、或约 200% ο
[0057]在本发明的另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激GLP-1释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞2小时而释放的GLP-1的约50%至约1000%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激GLP-1释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞2小时而释放的GLP-1的约50%至约500%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激GLP-1释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞2小时而释放的GLP-1的约50%至约400%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激GLP-1释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞2小时而释放的GLP-1的约50%至约300%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激GLP-1释放活性为用2mg/mlFXP950刺激STC-1细胞2小时而释放的GLP-1的约50%至约200%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激GLP-1释放活性为用2mg/ml FXP950刺激STC-1细胞2小时而释放的GLP-1的约50%至约100%。
[0058]在特定实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物刺激GLP-1释放活性为用2mg/mlFXP950刺激STC-1细胞2小时而释放的GLP-1的约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %、约 100%、约 110%、约 120%、约 130%、约 140%、约 150%、约 160%、约 170%、约 180%、约190%、或约 200% ο
[0059]取决于蛋白材料的来源、使用的蛋白酶和水解反应的条件，蛋白水解产物组合物的水解度(DH)可能并且将会不同。DH是指裂解的肽键相对于肽键起始数目的百分比。例如，如果包含五百个肽键的起始的蛋白水解至五十个肽键裂解，那么所得的水解产物的DH为10%。DH可使用本领域的技术人员已知的三硝基苯磺酸(TNBS)法或邻苯二甲醛(OPA)法。DH越高，蛋白水解程度就越大。通常，因为蛋白被进一步水解(即DH升高)，肽段的分子量降低，相应的肽特征图发生改变。DH可在整个水解产物(B卩，全级份)中测量，或DH可在水解产物的某个级份(例如，可溶性级份、分子量级份等)中测量。
[0060]通常，本发明的每个蛋白水解产物组合物将具有范围为约0.01%至约35%的水解度。在一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的DH范围为约0.0I %至约20 %。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的DH范围为约0.01%至约10%。在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的DH范围为约0.05%至约10%。在具体的实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的DH范围为约0.0I %、约0.05 %、约0.1 %、约
0.2%、约 0.3%、约 0.4%、约 0.5%、约 1.0%、约 1.5%、约 2.0%、约 2.5%、约 3.0%、约
3.5%、约 4.0%、约 4.5%、约 5.0%、约 5.5%、约 6.0%、约 6.5%、约 7.0%、约 7.5%、约8.0%、约8.5%、约9.0%、约9.5%、约 10.0%、约 10.5%、约 11.0%、约 11.5%、约 12.0%、约 12.5%、约 13.0 %、约 13.5%、约 14.0 %、约 14.5%、约 15.0 %、约 15.5%、约 16.0 %、约 16.5%、约 17.0 %、约 17.5%、约 18.0 %、约 18.5 %、约 19.0 %、约 19.5 %、约 20.0%、约 20.5%、约 21.0%、约 21.5%、约 22.0%、约 22.5%、约 23.0%、约 23.5%、约 24.0%、约 24.5 %、约 25.0%、约 25.5%、约 26.0 %、约 26.5 %、约 27.0%、约 27.5%、约 28.0 %、约 28.5%、约 29.0%、约 29.5%、约 30.0%、约 30.5%、约 31.0%、约 31.5%、约 32.0%、约
32.5%、约 33.0%、约 33.5%、约 34.0%、约 34.5%、或约 35.0V0o
[0061]一般来讲，本发明的蛋白水解产物组合物与蛋白原料相比将包含不同长度和分子量的多肽片段的混合物。肽片段的分子量可在75道尔顿(即游离甘氨酸)至大于100，000道尔顿的范围内，例如用尺寸排阻色谱法所测量。一般来讲，本发明的蛋白水解产物组合物的多肽片段具有不同长度和分子量的多肽片段级份。每个所述水解产物的代表性样品如实例中所述制备，并重新悬浮于固体浓度为2.5%的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH值7.4，Sigma货号P5368)中。不溶解的材料用16，OOOXg离心10分钟以去除，所得的上清液通过0.45微米注射器过滤器以去除任何残余的细小颗粒。
[0062]在一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约30%至约50%的多肽具有大于约20kDa的分子量。在具体的实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约30%、约31%、约32%、约33%、约34%、约35%、约36%、约37%、约 38%、约 39%、约 40%、约 41%、约 42%、约 43%、约 44%、约 45%、约 46%、约 47%、约48%、约49%、或约50%的多肽具有大于约20kDa的分子量。
[0063]在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约15%至约20%的多肽具有在约IOkDa和约20kDa之间的分子量。在具体的实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约15%、约16%、约17%、约18%、约19%、或约20%的多肽具有在约IOkDa和约20kDa之间的分子量。
[0064]在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约15%至约20%的多肽具有在约5kDa和约IOkDa之间的分子量。在具体的实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约15%、约16%、约17%、约18%、约19%、或约20%的多肽具有在约5kDa和约IOkDa之间的分子量。
[0065]在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约15%至约20%的多肽具有在约2kDa和约5kDa之间的分子量。在具体的实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约15%、约16%、约17%、约18%、约19%、或约20%的多肽具有在约2kDa和约5kDa之间的分子量。
[0066]在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约5%至约10%的多肽具有在约IkDa和约2kDa之间的分子量。在具体的实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约5 %、约6 %、约7 %、约8 %、约9 %、或约10 %的多肽具有在约IkDa和约2kDa之间的分子量。
[0067]在另一个实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中少于约5%的多肽具有小于约IkDa的分子量。在具体的实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份中少于约I %、少于约2%、少于约3%、少于约4%、或少于约5%的多肽具有小于约IkDa的分子量。[0068]一般来讲，本发明的蛋白水解产物组合物与蛋白原料相比具有增加的溶解度。所述溶解度在一定pH范围内将会有变化。
[0069]在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物在约pH3至约pH8之间是可溶解的。
[0070]在其它的某些实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物在约pH3至约pH5之间为约10%至约60%可溶的。在具体的实施例中，在这个pH范围所述溶解度为约30%至约60%、约35%至约55%、或约40%至约50%。在其它具体的实施例中，在这个pH范围所述溶解度为约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、或约60%。在另外的其它具体的实施例中，在这个pH范围所述pH为约pH3.0、约ρΗ3.25、约 ρΗ3.5、约 ρΗ3.75、约 ρΗ4.0、约 ρΗ4.25、约 ρΗ4.5、约 ρΗ4.75、或约 ρΗ5.0。在其它具体的实施例中，在该PH范围的pH为约pH3至约pH4。
[0071]在另外的某些实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物在约pH5至约pH6之间为约20%至约75%可溶。在具体的实施例中，在该pH范围的溶解度为约20%、约25%、约30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、或约 75%。在其它具体的实施例中，在该PH范围的pH为约pH5.0、约pH5.25、约pH5.5、约pH5.75、或约pH6.00
[0072]在另外的某些实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物在约ρΗ6至约ρΗ8之间为约40 %至约85 %可溶。在具体的实施例中，在该pH范围的溶解度为约55 %至约85 %、约60%至约80%、或约65%至约75%。在其它具体的实施例中，在该pH范围的溶解度为约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、或约 85%。在其它具体的实施例中，在该PH范围的pH为约ρΗ6.0、约ρΗ6.25、约ρΗ6.5、约ρΗ6.75、约ρΗ7.0、约 ρΗ7.25、约 ρΗ7.5、约 ρΗ7.75、或约 ρΗ8.0。
[0073]在其它实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物具有降低血液胆固醇效应，只要满足终端食品形式的所有必需要求，其能够实现FDA批准的心脏健康权利要求(例如，每份蛋白的数量、每份饱和脂肪的数量等)。测定降低血液胆固醇效应是本领域已知的，因此能够对本发明的蛋白水解产物组合物或掺入相同成份的食物产品进行测定。
[0074]II1.包含蛋白水解产物的食物产品。
[0075]本发明的另一方面是包括可食用材料和本文所述的蛋白水解产物组合物的食品
女口
广叩ο
[0076]取决于所需食物产品，选择的与可食用材料组合的特定蛋白水解产物组合物能够并且将会不同。
[0077]在一些实施例中，食品中包括的蛋白水解产物组合物包含“前肽”，它在受试者的胃和/或肠中经由蛋白分解消化转化成“活性”肽。在其它实施例中，蛋白水解产物组合物包含“活性”肽，它不需要在受试者的胃或肠中进行附加的蛋白分解消化。
[0078]在一些实施例中，包括在期望的食物产品中的本发明的蛋白水解产物组合物为全部未分离组合物，其包括例如所有的可溶性和不溶性级份。例如，本发明的全部未分级蛋白水解产物组合物可用于焙烤食品中。在其它实施例中，包括在期望的食物产品中的本发明的蛋白水解产物组合物为分级的组合物，其包括例如所有的可溶性和不溶性级份。例如参照可溶性级份，本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份能用于酸性饮料。由本领域的普通技术人员能测定所述可溶性级份并掺入至期望的食物产品中例如调节PH至期望的水平并用本领域已知的方法除去任何残余的不溶解的材料，其包括例如离心、膜分级、以及它们的组合。例如参照不溶性级份，本发明的蛋白水解产物组合物的不溶性级份能用于谷类食品。
[0079]在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白水解产物组合物的不溶性级份是重要的。发明人已经发现，除了本发明的蛋白水解产物组合物的可溶性级份诱导CCK和GLP-1释放的能力，不溶性级份也有这些生物活性。因此，本发明涵盖了可溶性级份、不溶性级份、或它们的组合，以诱导CCK和GLP-1释放并用于包括本文所述可食用材料和蛋白水解产物组合物的食物产品。
[0080]取决于所需食物产品，合适可食用材料的选择也将会不同。所述可食用材料可为植物来源的材料(例如，蔬菜汁、谷类食物等)、动物来源的材料(例如，乳品产品、蛋类产品等)、或生物材料(例如，蛋白、碳水化合物、脂质等)，其分离自植物来源的材料或动物来源的材料等。
[0081]本发明的食物产品可包括例如热或冷的谷类食品、巴、烘焙食品、饮料、酸奶、甜点、小吃、面食和肉类(包括家禽和海鲜)。
[0082]在一个实施例中，所述食物产品可为液体饮料。液体饮料的非限制性例子包括果汁、水果饮料、果味饮料、蔬菜饮料、营养饮料、能量饮料、运动饮料、豆浆饮料、大豆风味饮料、米乳饮料、风味乳饮料、基于酸奶的饮料、婴儿代乳品、荼饮料、咖啡饮料、膳食替代饮料、蛋白混合饮料、营养补充饮料、体重控制饮料、以及它们的组合。
[0083]包含饮料食物产品的可食用材料可能并且将会不同。适用的可食用材料的非限制性例子包括果汁、蔬菜汁、脱脂乳、减脂乳、2%乳、全脂乳、奶油、淡奶、酸奶、酪乳、巧克力、可可粉、咖啡、茶等。
[0084]饮料食物产品可还包括天然和人造的甜味剂(例如，葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖糊精、三氯蔗糖、天冬甜素、糖精、甜叶菊、玉米糖浆、蜂蜜、枫糖浆等)、风味剂(例如，巧克力、可可、巧克力风味剂、香草精、香草风味剂、水果风味剂等)、乳化或增稠剂(例如，卵磷月旨、角叉菜胶、纤维素胶、纤维素凝胶、淀粉、阿拉伯树胶、黄原胶凝胶等)、稳定剂、脂质材料(例如，卡诺拉油、向日葵油、高油酸向日葵油、脂肪粉等)、防腐剂和抗氧化剂(例如，山梨酸钾、山梨酸、BHA, BHT、TBHQ、迷迭香提取物、维生素A、维生素C和维生素E及它们的衍生物、以及各种植物提取物诸如那些包含具有抗氧化性质的类胡萝卜素、生育酚和类黄酮等)、着色剂、维生素、矿物质、以及它们的组合。
[0085]在另一个实施例中，所述食物产品是一种食物巴(压成块的加工食品)，诸如格兰诺拉巴、谷类食物巴、营养巴、代餐巴、或能量巴。在另一个实施例中，所述食物产品是基于谷类的食物产品。基于谷类的食物产品的非限制性例子包括早餐谷类食物、早餐巴、意大利面食、面包、焙烤产品(即，粉饼、馅饼、卷状食品、饼干、薄脆饼干)和小吃产品(例如炸土豆片、脆饼干等)。基于谷类的食品的可食用材料可以例如来源于小麦(例如漂白面粉、全麦面粉、麦芽精、麦麸等)、玉米(例如玉米面、玉米粗粉、玉米淀粉等)、燕麦(例如膨化燕麦、燕麦片、燕麦粉等)、稻米(例如膨化稻米、米粉、稻米淀粉)等等。在另一个实施例中，所述食物产品可以是基于乳品的“固体”食品。合适的“固体”基于乳品的食品的非限制性例子包括硬奶酪产品、软奶酪产品、冰激凌产品、酸奶产品、冻酸奶产品、搅打类乳品产品、果汁冰霜等。在另一个实施例中，所述食物产品是营养补充剂。营养补充剂可以是液体或固体。在另一个替代实施例中，所述食物产品是肉类产品或仿肉产品。肉类食物产品的例子包括例如加工肉制品、碎肉制品和全肉制品。肉类材料可以是动物肉或海产品肉。肉类类似物可以是组织化植物蛋白或组织化乳品蛋白，它们的质地模仿动物或海产品的肉。在肉类食物产品中肉类类似物可以是部分或全部肉类材料。
[0086]IV.定义。
[0087]为了更好的理解本发明，下文定义了几个术语。
[0088]术语“约”是指数值，包括例如整数，分数和百分数，不论是否明确说明。一般来讲，术语“约”是指一定的数值范围(例如，引用值的+/-5-10% )，本领域的普通技术人员将考虑其等同于引用值(例如，具有相同的功能或结果)。在一些情况下，术语“约”可包括四舍五入到最接近的显著数字的数值。
[0089]术语“水解度”(DH)是指具体肽键水解的百分比(即，裂解的肽键数量和未受损蛋白中总肽键数量之比)。用三硝基苯磺酸(TNBS)法或邻苯二醛(OPA)法来估算％ DH0这些方法对于测定蛋白水解产物的DH是准确的、可再现的、一般来讲适用的方法。
[0090]术语“内肽酶”是指在低聚肽或多肽链中水解内部肽键的酶。内肽酶类包括酶亚类EC3.4.21-25 (国际生物化学与分子生物学联盟酶分类体系)。
[0091]术语“外肽酶”是指在或靠近其氨基-或羧基末端水解肽键的酶。外肽酶类包括酶亚类EC3.4.11-18(国际生物化学与分子生物学联盟酶分类体系)。
[0092]“食品级酶”是公认安全(GRAS)认可的酶并且当被生物体如人消耗时是安全的。通常，酶和可从其中得到酶的产品可根据适用的法律法规进行制备。
[0093]“水解产物”是通过键裂解获得的反应产物。蛋白水解产物或水解蛋白是通过蛋白肽键裂解获得的反应产物。蛋白水解产物产生在热反应、化学反应和/或酶反应之后。在反应期间，将蛋白分解成多肽和/或游离的氨基酸。这些产品可为可溶于或不溶于水或水基缓冲液。水解产物不应和用胃蛋白酶-胰酶消化的蛋白组合物相混淆。
[0094]如本文所用的“0ΡΑ方法”是指下述的步骤:将0.25g大豆蛋白水解产物溶解在50mL萃取缓冲液(0.025N氢氧化钠中含1% SDS,0.6mM DTT)中，在65°C振荡5分钟，然后冷却至25°C。然后在5000Xg离心样品5分钟以除去任何未溶解的材料。接下来，将0.2mL样品等分试样、丝氨酸标准物(3.6mM，在去离子水中)、和萃取缓冲液(用作空白对照)转移到(三等分)测试管中，用IOmL OPA显色剂(0.012M 0ΡΑ,0.1M四硼酸钠，2% SDS)稀释，涡旋混合。允许反应进行30分钟，其时用分光光度计测量340nm的吸光度。使用每个三等分样品的均值测定％ DH,如 Nielsen 所述(Nielsen, P.M 等人,(2001) “Improved Methodfor Determining Food Protein Degree of Hydrolysis' ’，J.Food Sc1.66 (5):642-646)。
[0095]如本文所用，术语“大豆蛋白分离物”或“大豆分离蛋白”是指按无水计具有至少约90%的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆蛋白分离物由大豆形成，其形成方式为:将大豆的皮和胚芽从子叶上去除，将子叶压成片或碾碎并将片状或碾碎的子叶去油，将子叶的大豆蛋白和碳水化合物与子叶纤维分离开，然后将大豆蛋白与碳水化合物分离。
[0096]如本文所用，术语“大豆蛋白浓缩物”是指基于无水计具有约65%至小于约90%大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆蛋白浓缩物也可包含大豆子叶纤维，通常基于不含水分按重量计约3.5%至最多约20%的大豆子叶纤维。大豆蛋白浓缩物由大豆形成，其形成方式为:去除大豆的皮和胚芽，将子叶压成片或碾碎并将片状或碾碎的子叶去油，然后将大豆蛋白和大豆子叶纤维与子叶的可溶碳水化合物分离。
[0097]如本文所用，术语“大豆粉”是指全脂大豆粉、酶活性大豆粉、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、以及它们的混合物。脱脂大豆粉是指脱脂大豆材料的粉碎形式，优选包含小于约1%的油，由尺寸使得颗粒可通过100目(美国标准)筛网的颗粒形成。利用常规的大豆研磨方法将大豆饼、碎片、薄片、粗粉、或这些材料的混合物粉碎成大豆粉。大豆粉具有基于不含水分约49%至约65%的大豆蛋白含量。优选将所述粉末研磨得非常细，最优选使得有小于约I %的粉末留在300目(美国标准)筛网上。全脂大豆粉是指碾磨全大豆，其包含所有的原有油脂，通常为18%至20%。所述粉可为酶活性的，或可为热处理的或烘烤的以最小化酶活性。酶活性大豆粉是指被最小程度热处理以不会使其天然酶无效的全脂大豆粉。
[0098]如本文所用，术语“豆浆”指下列的任意一种或多种含水混合物:细磨大豆、大豆粉、大豆薄片、大豆浓缩液、大豆分离蛋白、大豆乳清蛋白、以及下列的任意一种或多种含水提取物:大豆、大豆薄片或大豆粉，其中已经除去了不溶解材料。豆浆可包含附加组分，其包括例如脂肪、碳水化合物、甜味剂、着色剂、稳定剂、增稠剂、风味剂、酸和碱。
[0099]如本文所用，术语“豆浆粉”指脱水的豆浆。豆浆可通过多种方法脱水，其包括例如喷雾干燥、盘式干燥、隧道式干燥和冷冻干燥。
[0100]如本文所用，术语“简化三硝基苯磺酸(S-TNBS)方法”指一种用于测定食物蛋白水解产物的水解度的精确的、可再现的、以及一般适用的方法。对该方法而言，将0.1g大豆蛋白水解产物溶解在IOOmL的0.025NNa0H中。将水解产物溶液的等分试样(2.0mL)与8mL的0.05M硼酸钠缓冲液(pH9.5)混合。用0.20mL10 %的三硝基苯磺酸处理两mL经缓冲的水解产物溶液，然后室温暗处孵育15分钟。加入4mL0.1M亚硫酸钠-0.1M磷酸钠溶液(I: 99比率)以终止反应，在420nm处读取吸光度。使用0.1mM的甘氨酸溶液作为标准物。下述的计算是用来确定对于甘氨酸标准溶液的百分回收率:[(甘氨酸在420nm的吸光度-空白对照在420nm的吸光度)X (100/0.710)]。94%或更高的值被认为是可接受的。(Jens Adler-Nissen(1979) “Determination of the Degree of Hydrolysis ofFood Protein Hydrolysates by Trinitrobenzenesulfonic Acid,”J.Agric.Food Chem.,27(6):1256-1262)。
[0101]当介绍本发明或其实施例的要素时，冠词“一个”、“一种”和“所述”旨在表示有一个或多个要素。术语“包含”和其所有形式和时态(包括例如包含(comprise, comprised))与“包括”、“含有”或“其特征在于”为同义词，是包容性或开放式语言，并且不排除任何额外的未列举的元素、步骤或成分。术语“组成”和其所有形式和时态(包括例如组成(consist, consisted))是封闭式的语言,并且排除任何未列举的元素、步骤或成分。术语“基本上由...组成”及其所有形式和时态将本发明的范围限于指定的元件、步骤、或成分以及不会实质上影响受本发明权利要求保护的基本和新型特性的那些。 申请人:注意到，某些实施例中引用了过渡性短语包括(comprising);不论在任何地方 申请人:引用了这个过渡性短语，所述过渡性短语由...组成(consisting of)或基本上由...组成(consistingessentially of)也被 申请人:考虑到并形成了本发明的一部分。
[0102]在不脱离本发明范围的条件下，可对以上组合物、产品和方法进行各种更改，这意味着可将上文描述和下文实例中包含的所有内容理解为例证性的而非限定性的。[0103]V.实例。
[0104]实例1:TL1蛋白水解产物。
[0105]按下述制备TLl水解产物。将240g蛋白(lot#M310007644)重新悬浮于2760g温的自来水中，用适度的螺旋桨叶片在室温下混合，制备成3L8%固体浓度的含水的Supro?760大豆分离蛋白(ISP)蛋白溶液。所述悬浮液在热板上加热至50°C，用IN食品级NaOH调节至PH8，然后分装成4个650ml的等份。然后将TLl酶(Novozymes NS12001)加到每个小份中至终浓度为150mg酶/kg固体，用Hanson Research Dissolution Station将悬浮液在50°C孵育。在30和60分钟的间隔将两份样品转移到IL的烧杯中，用铝箔覆盖，并在热板上加热至80°C。一旦到达指定温度，去除铝箔并继续加热5分钟以失活TL-1酶。最后，用湿冰浴将所述水解产物冷却至40°C，然后在冻干前冻至_40°C。
[0106]实例2:中性蛋白酶蛋白水解产物。
[0107]按下述制备中性蛋白酶水解产物。2L烧杯中装入1380g自来水，然后水浴加热至50°C。将120g SupTO? 760(lot#M310007644)ISP重新悬浮于水中并温和搅拌，用IN食品级NaOH调节悬浮液pH至7或8.5。接下来，悬浮液中加入Neutrasey I.5mg(lot#PW200921)至终浓度为75或150mg酶蛋白/kg固体，然后所述悬浮液在50°C孵育120分钟。对于一些水解产物，在水解周期中用Mettler Toledo DL50 Graphix Titrator滴定NaOH来保持pH恒定。在孵育周期结束时，将烧杯移至热板加热水解产物至80°C，5分钟，以终止反应。然后在水浴和冰浴中冷却样品，再冻至-40 V并冷冻干燥。
[0108]实例3:SP~1蛋白水解产物。
[0109]按下述制备SP-1水解产物。在2L烧杯中装入920g自来水，然后水浴加热至70°C。将80gSupro? 760(lot#P220014935) ISP重新悬浮于水中并温和搅拌，用IN食品级NaOH调节悬浮液pH至9。接下来,悬浮液中加入丝氨酸蛋白酶SP-1至终浓度为IOOmg酶蛋白/kg固体，然后所述悬浮液在70°C孵育30分钟。在孵育周期结束时，将烧杯移至热板加热水解产物至80°C，5分钟，以终止反应。然后在水浴和冰浴中冷却样品，再冻至-40°C并冷冻干燥。
[0110]实例4:S2蛋白水解产物。
[0111]按下述制备S2水解产物。2L烧杯中装入1150g自来水，然后水浴加热至70°C。将120g Supro'8 760 (lot#M310007644) ISP重新悬浮于水中并温和搅拌，用IN食品级NaOH调
节悬浮液PH至7。接下来，悬浮液中加入枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶S2至终浓度为75或150mg酶蛋白/kg固体，然后悬浮液在70°C孵育30或120分钟。在水解周期中用MettlerToledo DL50 Graphix Titrator滴定NaOH来保持pH恒定。在孵育周期结束时，将烧杯移至热板加热水解产物至80°C，5分钟，以终止反应。然后在水浴和冰浴中冷却样品，再冻至-40°C并冷冻干燥。
[0112]实例5:S1蛋白水解产物。
[0113]按下述制备SI水解产物。2L烧杯中装入1150g自来水，然后水浴加热至70°C。将IOOg Supro? 760 (lot#M310007644) ISP重新悬浮于水中并温和搅拌，用IN食品级NaOH调节悬浮液pH至8.0或9.0。接下来,悬浮液中加入枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶SI至终浓度为IOOmg酶蛋白/kg固体，然后悬浮液在70°C孵育120分钟。在水解周期中用MettlerToledo DL50 Graphix Titrator滴定NaOH来保持pH恒定。在孵育周期结束时,用蒸汽爸加热水解产物至90°C，然后在这个温度再保持2分钟以终止反应。然后在水浴和冰浴中冷却样品，再冻至_40°C并冷冻干燥。
[0114]下表给出了本发明的各种蛋白水解产物组合物的水解条件和水解度(用Nielsen, Petersen,和 Damdmann (2001)，].Food Sci66 (5):642-646 的 OPA 方法测定)。
[0115]
【权利要求】
1.包含多肽片段混合物的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物刺激胆囊收缩素(CCK)和胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)释放活性。
2.根据权利要求1所述的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约30%至约50%的多肽具有大于约20kDa的分子量。
3.根据权利要求1所述的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物包含可溶性级份、不溶性级份、或它们的组合。
4.根据权利要求1所述的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物基本上由可溶性级份组成。
5.根据权利要求1所述的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物为植物蛋白材料、动物蛋白材料、或它们的组合的水解产物。
6.根据权利要求1所述的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物为植物蛋白材料的水解产物，并且其中所述植物蛋白材料为豆科或非豆科植物。
7.根据权利要求6所述的蛋白水解产物组合物，其中所述植物蛋白材料来源于大豆。
8.根据权利要求7所述的蛋白水解产物组合物，其中所述植物蛋白材料为大豆蛋白分离物、大豆蛋白浓缩物、大豆粉、或它们的组合。
9.根据权利要求8所述的蛋白水解产物组合物，其中所述植物蛋白材料为大豆蛋白分离物。
10.根据权利要求1所述的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物在用胃蛋白酶和胰酶消化后刺激CCK和GLP-1释放活性。
11.包含蛋白水解产物组合物的食物产品，所述蛋白水解产物组合物包含多肽片段混合物，其中所述蛋白水解产物组合物刺激CCK和GLP-1释放活性。
12.根据权利要求11所述的食物产品，其中所述蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约30%至约50%的多肽具有大于约20kDa的分子量。
13.根据权利要求11所述的食物产品，其中所述蛋白水解产物组合物包含可溶性级份、不溶性级份、或它们的组合。
14.根据权利要求11所述的食物产品，其中所述蛋白水解产物组合物基本上由可溶性级份组成。
15.根据权利要求11所述的食物产品，其中所述蛋白水解产物组合物为植物蛋白材料、动物蛋白材料、或它们的组合的水解产物。
16.根据权利要求11所述的食物产品，其中所述蛋白水解产物组合物为植物蛋白材料的水解产物，并且其中所述植物蛋白材料为豆科或非豆科植物。
17.根据权利要求16所述的食物产品，其中所述植物蛋白材料来源于大豆。
18.根据权利要求17所述的食物产品，其中所述植物蛋白材料为大豆蛋白分离物、大豆蛋白浓缩物、大豆粉、或它们的组合。
19.根据权利要求18所述的食物产品，其中所述植物蛋白材料为大豆蛋白分离物。
20.根据权利要求11所述的食物产品，其中所述蛋白水解产物组合物在用胃蛋白酶和胰酶消化后刺激CCK和GLP-1释放活性。
21.诱发饱腹感的方法，包括摄入包含多肽片段混合物的蛋白水解产物组合物，其中所述蛋白水解产物组合物刺激CCK和GLP-1释放活性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约30%至约50%的多肽具有大于约20kDa的分子量。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物包含可溶性级份、不溶性级份、或它们的组合。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物基本上由可溶性级份组成。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物为植物蛋白材料、动物蛋白材料、或它们的组合的水解产物。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物为植物蛋白材料的水解产物，并且其中所述植物蛋白材料为豆科或非豆科植物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述植物蛋白材料来源于大豆。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述植物蛋白材料为大豆蛋白分离物、大豆蛋白浓缩物、大豆粉、或它们的组合。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述植物蛋白材料为大豆蛋白分离物。
30.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物在用胃蛋白酶和胰酶消化后刺激CCK和GLP-1释放活性。
31.诱发饱腹感的方法，包括摄入包含蛋白水解产物组合物的食物产品，所述蛋白水解产物组合物包含多肽片段混合物，其中所述蛋白水解产物组合物刺激CCK和GLP-1释放活性。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物的可溶性级份中约30%至约50%的多肽具有大于约20kDa的分子量。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物包含可溶性级份、不溶性级份、或它们的组合。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物基本上由可溶性级份组成。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物为植物蛋白材料、动物蛋白材料、或它们的组合的水解产物。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物为植物蛋白材料的水解产物，并且其中所述植物蛋白材料为豆科或非豆科植物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述植物蛋白材料来源于大豆。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述植物蛋白材料为大豆蛋白分离物、大豆蛋白浓缩物、大豆粉、或它们的组合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述植物蛋白材料为大豆蛋白分离物。
40.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白水解产物组合物在用胃蛋白酶和胰酶消化后刺激CCK和GLP-1释放活性。
【文档编号】A61P3/04GK103561589SQ201280010910
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年2月23日 优先权日:2011年2月23日
【发明者】E.S.克鲁尔, B.图克, M.K.帕里克, J.F.洛姆巴迪 申请人:索莱有限责任公司