专利名称：：一种pcr方法
技术领域：
：本发明涉及一种PCR方法。
背景技术：
：通过PCR步查法获得插入位点的毗邻序列较传统的建库筛选相比，操作简便、快捷且成本低廉，是分离与已知序列毗邻的未知序列或新基因的首选实验方法。现有的PCR步查法，如inversePCR、连接介导PCR、TAIL-PCR等存在着方法过于复杂、受酶切位点的限制、扩增的片段小(达不到研究者所要求的长度)、特异性差等弊端，常常扩增不到研究者所需要的DNA片段。目前用于分离与已知序列毗邻的未知序列的PCR方法已报道有几十种，按其采用的原理，可归纳为三种1、反向PCR(InversePCR)将未知序列端反折回来，与已知序列相连接，再用已知序列上的两引物作PCR。反向PCR主要有两个技术问题(1)要求在已知序列和未知序列端有相同的酶切位点，当一端没有或两端皆没有合适的酶切位点时，反向PCR不适用。(2)当两端皆存在合适的酶切位点时，反向PCR也不十分有效，因为连接反应多发生于分子间，分子内连接(环化)的几率很小。2、连接介导的PCR。连接介导的PCR是在未知序列端连接上一个接头，用已知序列端的特异引物和未知序列端的接头引物作PCR扩增。这类PCR方法的共同特点是特异性差。3、随机退火的PCR(randomlyprimedPCR)这类PCR也有两个技术问题，1)这类PCR要求在未知序列端有简并引物(arbitrarydegenaratedprimer)的结合位点，而实际情况是在很多情况下在未知序列端缺乏简并引物的结合位点。2)非特异性扩增问题十分突出，在多数情况下非特异性扩增掩盖了特异性扩增，从而得不到所需要的特异性PCR扩增产物的条带。
发明内容本发明的目的是提供一种具有较高特异性，并且操作简单的PCR方法。本发明所提供的PCR方法，称为SiteFind-PCR，包括以下步骤1)用SiteFinder起始PCR反应；所述SiteFinder包括46种单链寡聚脱氧核苷酸分子，所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的长度相同，均为50-100nt；所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的3′末端的4至6个脱氧核苷酸组成的序列均相同，紧密连接于该4至6个脱氧核苷酸的5′方向的6个脱氧核苷酸组成的序列均不同，紧密连接于该6个脱氧核苷酸的5′方向的38-90个脱氧核苷酸组成的序列均相同；2)进行巢式PCR反应；所述巢式PCR反应的引物由根据SiteFinder合成的SPF1和SPF2，和根据与待扩增的目标序列相邻的已知序列合成的基因特异引物GSP1，GSP2和GSP3组成；所述SPF1和SPF2的序列均选自步骤1)的SiteFinder的所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的38-90个脱氧核苷酸组成的序列；所述SPF1的3′末端序列和SPF2的5′末端序列相同，形成嵌套引物；所述GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待扩增的目标序列，其次是GSP2，离待扩增的目标序列最远的是GSP1；所述GSP3的3′端第一个脱氧核苷酸与所述已知序列的结合位置，与所述已知序列的3′端最后一个脱氧核苷酸间至少相距5nt。其中，为了便于对待扩增的目标序列的PCR产物进行选择和将得到的PCR产物克隆入载体，所述38-90个脱氧核苷酸组成的序列中，紧密连接于所述6个脱氧核苷酸5′方向的脱氧核苷酸组成的序列为一个限制性核酸内切酶识别序列的5′→3′走向的单链序列；所述限制性核酸内切酶的识别序列大于等于八个核苷酸对。其中，任何大于等于八个核苷酸对组成的限制性核酸内切酶的识别序列均可实现该目的，使用大于等于八个核苷酸对组成的限制性核酸内切酶的稀有识别序列的原因是避免将SiteFinder以外的目标序列切断。所述方法中还包括利用所述SiteFinder包含的各种单链寡聚脱氧核苷酸分子中的限制性核酸内切酶识别序列对应的限制性核酸内切酶，对待扩增的目标序列的PCR产物进行选择的步骤。识别序列大于等于八个核苷酸对的限制性核酸内切酶包括NotI(GCGGCCGC)，ASC(GGCGCGCC)，AsiSI(GCGATCGC)，FseI(GGCCGGCC)等。所述SPF1和SPF2的序列均选自所述40-90个脱氧核苷酸中，紧密连接于所述限制性核酸内切酶识别序列的5′方向的脱氧核苷酸组成的序列。所述起始PCR反应包括模板变性、SiteFinder中的单链寡聚脱氧核苷酸分子与模板退火、单方向延伸；所述SiteFinder中的单链寡聚脱氧核苷酸分子与模板退火的温度条件可为16-25℃1分钟；所述起始PCR反应的模板变性的温度条件可为先92℃2分钟，然后95℃1分钟。所述起始PCR反应的单方向延伸的温度条件为在至少3分钟内升温至68℃，然后68℃10分钟。所述巢式PCR反应包括第一轮和第二轮扩增反应，所述第一轮扩增反应是由SPF1和GSP1组成的一对引物进行的反应，所述第二轮扩增反应包括由SPF2和GSP2组成的一对引物进行的反应。为了根据SPF2和GSP2、GSP3所扩增DNA片段的大小差异来辨认PCR产物是否为特异性分子，所述第二轮扩增反应还包括由SPF2和GSP3组成的一对引物进行的反应。所述第一轮扩增反应和第二轮扩增反应的温度条件均为先94℃1分钟；然后95℃10-15秒，68℃6分钟，进行30-35个循环；最后72℃5分钟。本发明首先独特设计了用来起始PCR反应的由46种单链寡聚脱氧核苷酸分子组成的SiteFinder。图1示一种SiteFinder，其3’末端有4个特异的核苷酸，用来与DNA模板上相应位点互补配对，该4个特异的核苷酸上游有6个随机核苷酸，用来辅助3’末端退火；紧接着有一个由8个核苷酸组成的NotI的识别序列的5′→3′走向的单链序列，用来选择性地克隆目标分子。基于SiteFinder包含的各种单链寡聚脱氧核苷酸分子序列的5′端序列，合成2个嵌套引物，即SFP1和SFP2。图1示根据上述SiteFinder的5′端序列合成的SFP1和SFP2。根据与待扩增的目标序列相邻的已知序列，合成基因特异引物GSP1，GSP2和GSP3。GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待扩增的目标序列，其次是GSP2，离待扩增的目标序列最远的是GSP1。为了便于鉴定所扩增得到的产物是否为目的序列，所述GSP3的3′端第一个脱氧核苷酸与所述已知序列的结合位置，与所述已知序列的3′端最后一个脱氧核苷酸间至少相距5nt。SiteFind-PCR的原理如图2(粗线示已知序列，细线为未知序列)所示(1)基因组DNA；(2)通过模板变性、SiteFinder在低温下与基因组模板退火、单方向延伸，将SiteFinder序列引入基因组序列之中；(3)通过巢式PCR指数倍扩增目标DNA分子，而非目标分子因茎环结构的抑制作用而无法完成指数扩增，从而达到选择性扩增目标分子的目的；(4)通过限制性核酸内切酶识别序列(如NotI识别序列)选择性地克隆目标分子；(5)通过已知序列上GSP2下游的GSP3特异性地筛选目标分子。一般来说，为了保证PCR产物的特异性，在PCR过程中应该尽量避免非特异起始发生。但是，这种非特异起始是相对于整个引物来说的。对于引物的3’-末端的几个碱基来说，即使是错误的起始，也必然是精确地与模板DNA分子配对的，否则将无法完成DNA分子的扩增。利用这一特点，依靠SiteFinder的3’-末端的4-6个碱基寻找基因组上与其配对的位点，起动整个基因组上相应位点下游的DNA分子的扩增(图2)。随后完成了对目标分子的选择第一次选择(选择性扩增)，目标分子在基因特异引物的作用下，将SiteFinder的互补链填充完整，从而得到只有一端有SiteFinder序列而另一端是已知序列的DNA分子。在PCR过程中这种分子可以被指数倍扩增。然而，对于非目标DNA分子来说，绝大部分分子将只会在分子的一端具有SiteFinder序列，它们在后续的PCR过程中，只会被线性扩增；即使有少数分子两端都具有SiteFinder序列，因为它们在分子的两端构成反向重复序列，在PCR的变性退火过程中将因为空间距离接近而形成稳定的茎环结构，这种结构阻止了引物和模板的退火。第二次选择(选择性克隆)，在SiteFinder上设计了一个限制性内切酶的识别序列(如NotI识别序列)，一方面极大的方便了对目标分子的克隆，更重要的是又一次对目标分子进行了选择。理论上只有目标分子才满足一端是该限制性内切酶的识别序列(如NotI识别序列)，另外一端是平端，从而被连接到用该限制性内切酶(如NotI)和另一个核酸内切酶(如EcoRV酶切)线性化的载体(如pBlueScriptSK(+)质粒)中。非目标分子因两端具有该限制性内切酶的识别序列(如NotI识别序列)或者一端是该限制性内切酶的识别序列(如NotI识别序列)另一端是环状结构(loop)，而不能被克隆。第三次选择(选择性筛选)，克隆GSP2/SFP2引物对的产物而不是GSP3/SFP2引物对的产物，目的在于确保使用载体引物和GSP3筛选的时候，只有目标分子的特异扩增的产物能被筛选到，而其他来源的分子都不能被筛选出来。只有GSP3/SFP2引物对的扩增产物长度小于GSP2/SFP2引物对的扩增产物，才是目标分子的特异扩增的产物。本发明的SiteFind-PCR具有以下优点1.操作简单操作过程中没有酶切、沉淀、回收和连接过程，大大简化了操作步骤，减小了受污染的几率。2.高特异性在已有的步查PCR方法中只有反向PCR(InversePCR)和T-linkerPCR具有高特异性(Yan，Y.X.，An，C.C.，Li，L.，Gu，J.Y.，Tan，G.H.，andChen，Z.L.(2003).T-linker-specificligationPCR(T-linkerPCR)anadvancedPCRtechniqueforchromosomewalkingorforisolationoftaggedDNAends.NucleicAcidsRes.30，e68.)，但是它们都受酶切位点的限制，而且对于反向PCR来说，基因组内的目标DNA分子在非选择性的连接条件下环化困难，致使在有合适酶切位点的情况下也难扩增到目标DNA分子。其它步查PCR方法特异性差，扩增到的往往是与研究目的不相干的非特异性分子。因为SiteFind-PCR中茎环结构的抑制效应，以及后续的选择性克隆和筛选，保证了结果的高特异性。3.高成功率所进行的实验中，成功地从8个样品中得到8阳性结果，说明对于每一个样品来说都能够被有效地步查。4.容易得到大的片断因为不用限制性内切酶处理模板，理论上其起始位点到已知序列的最大距离只受Taq酶的扩增能力的制约，所以用SiteFind-PCR做染色体步查很容易得到较大的片断。SiteFind-PCR与现有PCR方法相比，具有操作简单、快速、特异性高、通用性强、重复性好、一次扩增片段较长且成本低廉等优点。SiteFind-PCR可广泛适用于分子生物学研究中多种目的的染色体步查，如转基因动、植物及微生物中外源基因插入位点的鉴定、基因未知区段新基因的分离等。图1为SiteFinder示意图及根据其合成的SFP1和SFP2的序列图2为SiteFind-PCR的原理3为DL3、DL2和DL1的序列图4为用SiteFind-PCR鉴定第一个拟南芥插入突变体的插入位点的第二轮PCR产物电泳图谱及对克隆产物的测序结果图5为用SiteFind-PCR同时鉴定7个拟南芥插入突变体的插入位点的第二轮PCR产物电泳图谱具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施实例1、利用SiteFind-PCR对复杂基因组上的未知序列的步查一、拟南芥突变体的获得以pSki015(WeigelWorld)为转化拟南芥的载体，按照文献(Chang，S.S.，Park，S.K.，Kim，B.C.，Kang，b.J.，Kim，D.U.，andNam，H.G.(1994).StablegenetictransformationofArabidopsisthalianabyAgrobacteriuminoculationinplanta.PlantJ.5，551-558.；Gelvin，S.B.(2003).Agrobacterium-mediatedplanttransformationthebiologybehindthe″gene-jockeying″tool.MicrobiolMolBiolRev67，16-37，tableofcontents；Tzfira，T.，Li，J.，Lacroix，B.，andCitovsky，V.(2004).AgrobacteriumT-DNAintegrationmoleculesandmodels.TrendsGenet20，375-383)的方法，用浸花法转化拟南芥(哥伦比亚型生态种)，经除草剂筛选，在子一代植株中得到8株抗除草剂的T-DNA插入突变体。二、用SiteFind-PCR鉴定1个拟南芥插入突变体的插入位点1、SiteFinder、SFP1和SFP2、GSP3，GSP2和GSP1的设计合成(1)设计合成SiteFinder所设计合成的SiteFinder包括46种单链寡聚脱氧核苷酸分子SiteFinder，SiteFinder-4096。它们的大小均为61nt，它们的序列通式5’-CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCTCAAGCGGCCGCNNNNNNGCCT-3’，其中，3’末端的4个特异的核苷酸GCCT用来与DNA模板上相应位点互补配对，该4个特异的核苷酸上游有6个随机核苷酸NNNNNN(N为A或T或C或G)，用来辅助3’末端退火；紧接着有一个由8个核苷酸组成的NotI的识别序列5′→3′走向的单链序列GCGGCCGC，用来选择性地克隆目标分子。(2)设计合成SFP1和SFP2基于SiteFinder包含的各种单链寡聚脱氧核苷酸分子序列的5’端序列，合成2个嵌套引物SFP1和SFP2。SFP15’-CACGACACGCTACTCAACAC-3’，SFP25’-ACTCAACACACCACCTCGCACAGC-3’。(3)设计合成GSP3，GSP2和GSP1以穿梭载体pSki015的左边界序列附近的核苷酸序列作为已知序列，合成基因特异引物GSP3(DL3)，GSP2(DL2)和GSP1(DL1)。DL3的序列为5’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’，DL2的序列为5’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’，DL1的序列为5’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3’(图3)。DL3与序列1的起始结合位置是序列1的自5′端第172-194位脱氧核苷酸，DL2与序列1的起始结合位置是序列1的自5′端第113-136位脱氧核苷酸，DL1与序列1的起始结合位置是序列1的自5′端第1-24位脱氧核苷酸。2、用SiteFinder起始PCR反应以步骤一获得的一株拟南芥突变体的基因组DNA为模板，用SiteFinder起始PCR反应。其中，反应体系为20μL，包括0.1μg基因组DNA(1μL)，1μL5μmol/L的SiteFinder，1单位的Taq酶，1μL2.5mM的dNTP。反应的温度条件为先92℃(2min)，然后95℃(1min)使模板变性；再25℃(1min)使SiteFinder与模板退火；在3分钟内升温至68℃，然后在68℃(10min)，使SiteFinder向3′方向单方向延伸。3、用SFP1和SFP2，DL3，DL2和DL1进行巢式PCR反应在完成步骤2的起始PCR反应的20μL反应体系中，加入3.5μL10μmol/L的SFP1，1μL10μmol/L的DL1，0.5μL10×Taq酶缓冲液，进行第一轮扩增反应，温度条件为先94℃1分钟；然后95℃10秒，68℃6分钟，进行30个循环；最后72℃5分钟。在第一轮扩增反应结束后，取1μL产物稀释1000倍，再取1μL稀释产物作模板，再向反应体系中加入2μL10μmol/L的SFP2，2μL10μmol/L的DL2，0.5μL10mM的dNTP，1单位的Taq酶，用水补足到50μL，进行第二轮扩增反应。同时按上述体系设平行对照，所不同的是用DL3替换DL2。温度条件为先94℃1分钟；然后95℃10秒，68℃6分钟，进行30个循环；最后72℃5分钟。第二轮扩增反应结束后，将得到的PCR产物进行电泳，电泳结果如图4A所示，泳道1和2分别是SFP2/DL2和SFP2/DL3引物对扩增的产物，泳道1中得到3条带，泳道2中得到2条带，泳道1中较大的两条带分别比泳道2中相应的两条带大，说明得到的PCR产物是目标分子的特异扩增产物。为了确保使用载体引物M13R和DL3筛选阳性克隆的时候，只有目标分子的特异扩增的产物能被筛选到，而其他来源的分子都不能被筛选出来，将DL2/SFP2引物对的产物进行克隆。回收泳道1中最大的条带(2.2kb)对应的DNA片段，用NotI酶切后，与经NotI和EcoRV酶切的载体pBlueScriptSK(+)进行连接，按常规方法将连接产物转化大肠杆菌、用M13R和DL3进行菌落PCR筛选阳性克隆，进行测序，测序结果显示泳道1中最大的条带对应的DNA片段的长度为2270bp，该片段中，在距DL3的783bp处有一个GCCT位点(图4B)，这与电泳结果相吻合(图4A中白色箭头所指的条带)。测序结果表明得到泳道1中最大的条带为2.2kb。将所得到的序列与GeneBank中的序列比对分析T-DNA插入位点。结果表明在该拟南芥突变体中，外源片段的插入位置是拟南芥基因组的第三号染色体上。该插入位点的鉴定结果与按TAIL-PCR鉴定的插入位点相同，但是步查的片断比通过TAIL-PCR步查的片断长1.6kb。实施例2、对7个拟南芥突变体插入位点序列的特异性扩增为了验证SiteFind-PCR的广泛的适用性，对实施例1步骤一中的其它7个突变体进行插入位点的分析。除模板分别为该7个突变体的基因组DNA不同外，其它的反应材料(如SiteFinder，GSP3，GSP2和GSP1，SFP1，SFP2)和反应条件均与实施例1相同。结果如图5所示，根据电泳条带的差别判断有7个样品得到了特异扩增产物，其中样品4有3条特异扩增的产物。图5中，泳道II和III为每个突变体样品的SFP2/DL2和SFP2/DL3引物对的扩增产物；1-7分别表示7个突变体的样品。序列表<160><210>1<211>421<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1gacaacatgtcgaggctcagcaggacctgcaggcatgcaagcttatcgatatctagatct60cgagctcgagatctagatatcgatcgtgaagtttctcatctaagcccccatttggacgtg120aatgtagacacgtcgaaataaagatttccgaattagaataatttgtttattgctttcgcc180tataaatacgacggatcgtaatttgtcgttttatcaaaatgtactttcattttataataa240cgctgcggacatctacatttttgaattgaaaaaaaattggtaattactctttcttttcct300ccatattgaccatcatactcattgctgatccatgtagatttcccggacatgaagccattt360acaattgaatatatcctgccgccgctgccgctttgcacccggtggagcttgcatgttggt420t42权利要求1.一种PCR方法，包括以下步骤1)用SiteFinder起始PCR反应；所述SiteFinder包括46种单链寡聚脱氧核苷酸分子，所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的长度相同，均为50-100nt；所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的3′末端的4至6个脱氧核苷酸组成的序列均相同，紧密连接于该4至6个脱氧核苷酸的5′方向的6个脱氧核苷酸组成的序列均不同，紧密连接于该6个脱氧核苷酸的5′方向的38-90个脱氧核苷酸组成的序列均相同；2)进行巢式PCR反应；所述巢式PCR反应的引物由根据SiteFinder合成的SPF1和SPF2，和根据与待扩增的目标序列相邻的已知序列合成的基因特异引物GSP1，GSP2和GSP3组成；所述SPF1和SPF2的序列均选自步骤1)的SiteFinder的所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的38-90个脱氧核苷酸组成的序列；所述SPF1的3′末端序列和SPF2的5′末端序列相同，形成嵌套引物；所述GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待扩增的目标序列，其次是GSP2，离待扩增的目标序列最远的是GSP1；所述GSP3的3′端第一个脱氧核苷酸与所述已知序列的结合位置，与所述已知序列的3′端最后一个脱氧核苷酸间至少相距5nt。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述38-90个脱氧核苷酸组成的序列中，紧密连接于所述六个脱氧核苷酸5′方向的脱氧核苷酸组成的序列为一个限制性核酸内切酶识别序列的5′→3′走向的单链序列；所述限制性核酸内切酶的识别序列大于等于八个核苷酸对。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中还包括利用所述SiteFinder包含的各种单链寡聚脱氧核苷酸分子中的限制性核酸内切酶识别序列对应的限制性核酸内切酶，对待扩增的目标序列的PCR产物进行选择的步骤。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述SPF1和SPF2的序列均选自所述38-90个脱氧核苷酸中，紧密连接于所述限制性核酸内切酶识别序列的5′方向的脱氧核苷酸组成的序列。5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述起始PCR反应包括模板变性、SiteFinder中的单链寡聚脱氧核苷酸分子与模板退火、单方向延伸；所述SiteFinder中的单链寡聚脱氧核苷酸分子与模板退火的温度条件为16-25℃1分钟。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所与模板退火的温度条件为25℃1min；所述起始PCR反应的模板变性的温度条件为先92℃2分钟，然后95℃1分钟。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述起始PCR反应的单方向延伸的温度条件为在至少3分钟内升温至68℃，然后68℃10分钟。8.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述巢式PCR反应包括第一轮和第二轮扩增反应，所述第一轮扩增反应是由SPF1和GSP1组成的一对引物进行的反应，所述第二轮扩增反应包括由SPF2和GSP2组成的一对引物进行的反应。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述第二轮扩增反应还包括由SPF2和GSP3组成的一对引物进行的反应。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述第一轮扩增反应和第二轮扩增反应的温度条件均为先94℃1分钟；然后95℃10-15秒，68℃6分钟，进行30-35个循环；最后72℃5分钟。全文摘要本发明公开了一种具有较高特异性，并且操作简单的PCR方法。该PCR方法，通过模板变性、SiteFinder在低温下与基因组模板退火、单方向延伸，将SiteFinder序列引入基因组序列之中；通过2轮PCR指数倍扩增目标DNA分子，而非目标分子因茎环结构的抑制作用而无法完成指数扩增，从而达到选择性扩增目标分子的目的；通过限制性内切酶识别位点选择性地克隆目标分子；最后，通过已知序列上GSP2下游的GSP3特异性的筛选目标分子。本发明的PCR方法与现有PCR方法相比，具有简单快速、特异性高、通用性强、重复性好、一次扩增片段较长且成本低廉等优点，广泛适用于分子生物学研究中多种目的染色体步查，如转基因动、植物及微生物中外源基因插入位点的鉴定、基因未知区段新基因的分离等。文档编号C12P19/00GK1891832SQ200510080550公开日2007年1月10日申请日期2005年7月4日优先权日2005年7月4日发明者安成才,谭桂红,高音,石苗,张欣跃,何善平,陈章良申请人:北京大学