一种通过基因表达图谱预测胃癌术后存活状况的方法

专利名称：一种通过基因表达图谱预测胃癌术后存活状况的方法
技术领域：
本发明涉及一种预测癌症手术后存活率的方法，尤其涉及一种通过基因微阵列的分类图谱，以逆转录聚合酶链式反应预测胃癌术后存活状况的方法。
背景技术：
胃癌是世界上常见的癌症之一，且居台湾地区患癌率的第四位。目前临床上普遍是以内窥镜进行筛检，以期于癌症早期阶段诊断出，但仍有部分患者在诊断时，其癌症已处于较严重的癌症期(stage)。根据先前的研究报告指出，癌症I期(stage I)的患者通常具有较好的预后(prognosis)，而癌症IV期(stageIV)的患者则显示出非常差的预后。但令人困扰的是，癌症II期(stage II)与III期(stage III)患者的预后情形却有着极大的差异，目前尚无法得知其生物原因。
已有一些研究报告指出，公知的一些临床病理因子与多个有趣的分子，包括细胞周期调控因子(cell cycle regulation factors)(例如，p27或细胞周期蛋白E(cyclin E))、细胞粘附分子(cell adhesion molecules)(例如，细胞粘附连接分子(E-cadherin)、血管形成因子(angiogenic factors)(例如，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与胎盘生成因子(placenta growthfactor))、致癌因子(oncogenes)(例如，c-erbB2与c-myc)，以及肿瘤抑制基因(tumor suppressor genes)(例如p53))等，可能与胃癌患者的预后有关。然而，这在不同的研究中却存在着不一致的结果，并且由于疾病的生物学十分复杂，因此在这些先前报告中的参数仅能提供有限的个别患者的预后信息。由于胃癌的细胞与分子具有异质性(heterogeneity)，以及有许多的基因可能参与胃癌病变产生(pathogenesis)的多个步骤，因此这意味着着手研究这些多个基因的变异(alterations)是一件重要的事。
近来，由于能系统化进行基因表达研究的cDNA微阵列(microarray)技术的改良，使得我们得以看见人类肿瘤基因的表达图谱。这些基因表达图谱可用以帮助鉴别基因活化图形，据此来区别胃肿瘤的亚纲(subclasses)。基因图谱的研究也曾被使用于筛选有较高复发危险性的患者，以进行辅助治疗。最近，Grodon等人揭示一种使用4～6个自微阵列筛选出的基因的简单的基因表达量图形，其在间皮瘤(mesothelioma)的预测结果上有很高的准确度。
但由于前述公知的研究中，很少是从相当大量的基因中收集资料，且其大多使用昂贵的数据获取平台与复杂的演算及/或软件，加上该些方法并无法在不参考其它样本的状况下分析独立的样本，因此这使得公知方法在临床应用上有其限制。此外，目前仍也无实际有用的方法，可用以辨别各个患胃癌者，在手术切除后的复发危险性。

发明内容
为解决前述公知技术的缺点，本发明的目的在于提供一种通过基因微阵列的分类图谱，利用逆转录聚合酶链式反应，以公知统计方法建立一种D2胃切除术(D2 gastrectomy)后存活状况的预测模式的方法。
根据本发明所指出的一种通过基因表达的微阵列分类图谱，利用逆转录聚合酶链式反应，建立胃癌患者术后存活状况的预测模式的方法，包含以下步骤(1)通过多个已知胃癌术后存活状况的成对的肿瘤与非肿瘤组织样本，以其基因表达的微阵列分类图谱，在这些组织样本中筛选出表达显著不同的特异性基因；(2)对上述特异性基因进行逆转录聚合酶链式反应，并确认其结果与上述微阵列分类图谱结果的一致性；以及(3)以公知的统计模式选取法，从上述特异性基因中选出肿瘤调节基因，并通过一训练组样本以上述肿瘤调节基因建立该预测模式的公式。
作为本发明前述步骤(1)的例子，例如针对基因微阵列资料，采用三步骤分类方式，建立表达显著不同的基因分类图谱，但并不仅限于此。前述的三步骤包含(i)将位于该微阵列上的上述组织样本中与肿瘤调节相关的基因的表达量的对数比值(log ratio)进行标准化(Normalization)；(ii)利用折叠改变法(fold-change)滤除上述对数比值表达较不显著的基因；以及
(iii)以多重排列检定法(multiple permutation test)与交叉验证(crossvalidation，CV)进一步筛选出表达显著不同的基因。
前述微阵列上基因的表达量，例如可通过检测该基因的cDNA表达量来获得。
前述步骤(2)中，该特异性基因的逆转录聚合酶链式反应的结果与其cDNA表达结果进行比较，来确认一致性时，可通过一选定的筛选标准来执行，在本发明中可作为此筛选标准的例子，例如斯皮尔曼等级相关(Spearmanrank correlation coefficient)检定法p＜0.05。
前述步骤(3)中，优选为进一步包含结合罗吉斯回归分析(logisticregression)进行该肿瘤调节基因的选取。可应用于本发明中作为前述统计模式选取法的例子，例如逐步模式法，但并不仅限于此。为避免因样本数目不足，所产生的过度拟合(overfitting)问题，前述训练组样本的样本数目，优选为不少于预测模式中肿瘤调节基因数目的5倍。
本发明的另一目的在于提供一种通过基因表达图谱预测胃癌术后存活状况的方法，据此来预测胃癌患者于D2胃切除术后的存活率，以供后续治疗以及是否进行辅助性治疗(adjuvant chemotherapy)的参考。
根据本发明所指出的一种预测胃癌患者胃癌术后存活状况的方法，其包含如下步骤(a)从该胃癌患者获得肿瘤组织与非肿瘤组织的成对样本；(b)以逆转录聚合酶链式反应检测该成对样本中肿瘤调节基因的表达；以及(c)基于步骤(b)中所得的逆转录聚合酶链式反应结果，通过前述方法所得的预测模式计算该胃癌患者的存活状况。
本发明通过基因表达图谱所构成的预测模式，较公知技术能更正确的预测胃癌患者在治疗切除后的存活情况。本发明方法能成功的避免公知技术无法将微阵列技术应用在临床上的缺点。


图1(A)是表示6个基因与β肌动蛋白内参组的逆转录PCR结果；(B)是表示通过逆转录PCR确认6个所选基因的微阵列数据；
“N”表示正常组织；“T”表示肿瘤组织；“CD36”表示CD36抗原；“SLAM”表示信号转导淋巴细胞激活分子；“TFAP”表示转录因子AP-2α；“IGF-1”表示类胰岛素生长因子；“PIM-1”表示PIM-1致癌基因；“TIMP-4”表示金属蛋白酶的组织抑制剂-4；“G”表示良好存活；“P”表示不良存活。
图2是表示4个样本中每个所选基因的成对逆转录PCR状态；“CD36”表示CD36抗原；“SLAM”表示信号转导淋巴细胞激活分子；“TFAP”表示转录因子AP-2α；“PIM-1”表示PIM-1致癌基因；“β-actin”表示β肌动蛋白；“N”表示正常组织；“T”表示肿瘤组织；“TN”表示肿瘤的表达量高于非肿瘤的表达量；“NT”表示非肿瘤的表达量高于肿瘤的表达量；图3是表示被预测有良好存活与不良存活的患者的存活曲线；(A)全部测试患者的存活率；(B)第三期患者的存活率。
具体实施例方式
本发明中，对由不良存活与良好存活组所构成的18位患者，使用包含有328个已知基因序列的基因，以及具有显色检测的自制(in-house)尼龙膜小型微阵列，采用三步骤的分类筛选方式来寻找预测胃癌患者存活的基因表达图谱。第一步中，在此使用328个基因，分别分析其在肿瘤与非肿瘤组织中的cDNA表达量，并计算出其cDNA表达量的对数比值。为避免在每个微阵列样本上的系统误差，在此使用非线性的局部加权回归法(locally WeightedSactterplot Smoother，LOWESS)，将328个基因的对数比值(log ratios)标准化至经由MA做图拟合的LOWESS曲线上。对数比值标准化后，第二步骤再通过折叠改变法(fold-change method)从328个基因中选出141个基因。最后，在第三步骤中使用多重排列检定法(multiple permutation test)与交叉验证(crossvalidation，CV)进一步筛选出6个表达显著不同的特异性基因。这些筛选出的特异性基因，包括CD36抗原、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)、转录因子AP-2α(transcription factor AP-2alpha，TFAP)、类胰岛素生长因子(insulin-likegrowth factor 1，IGF-1)、PIM-1致癌基因，以及金属蛋白酶的组织抑制剂-4(tissue inhibitor of metalloproteinase-4，TIMP-4)。
接着，再通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测前述6个基因在肿瘤和非肿瘤组织中的表达。将RT-PCR的结果与前述的微阵列结果比较。结果显示，前述6个基因中有4个(CD36、SLAM、TFAP与PIM-1)，在两者的结果中具有高度的一致性(60％以上)，且其斯皮尔曼等级相关检定也显示出具有显著性，且p＜0.05。
本发明中，另外随机从18位患者中所挑选出的4位患者用以进行重复研究，以测试此自制尼龙膜的微阵列的再现性。这4个患者的总RNAs用两个不同的微阵列尼龙膜在不同时间进行杂交。经计算交叉杂交所得的皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficients)都超过0.75(P＜0.05)，这表示本发明方法具有良好的重复性。
将每个所选基因在肿瘤组织与非肿瘤组织中的RT-PCR表达量的状态分成四类，分别为(1)肿瘤的表达量高于非肿瘤的表达量，以“肿瘤正常”表示；(2)非肿瘤的表达量高于肿瘤的表现量，以“正常肿瘤”表示；(3)肿瘤与非肿瘤均为阳性；以及(4)肿瘤与非肿瘤均为阴性。接着，选用数个已知存活情形样本，将其RT-PCR的结果按照上述四类进行分类，据此分别计算出每个所选基因在这四种RT-PCR状态中的样本的出现频率，据此建立预测模式。
基于Akaike’s法则(Akaike’s information criterion，AIC)采用罗吉斯回归分析(logistic regression)模式与逐步模式选择预测模式，再从前述4个基因中，获得由其中3个基因(CD36、SLAM与PIM-1)所组成的最有效的罗吉斯预测模式。
在前述这3个基因中，公知SLAM是由活化的T细胞、B细胞及树状细胞(dendritic cells)所表达的CD2相关的表面受体。常在胃癌患者中受损的Th0/Th1免疫反应也可为SLAM所诱发，以此来增强CD8+肿瘤专一性淋巴细胞的增殖与细胞杀伤能力。虽然SLAM在胃癌患者的肿瘤相关免疫反应中的真实角色仍然不清楚，但其似乎在抗肿瘤免疫反应上具有潜在性的影响。公知CD36是调节细胞凋亡(apoptosis)与血管生成(angiogenesis)以结合其配体凝血因子(ligand thrombospondin-1，TSP-1)的跨膜受体(trans-membranereceptor)。TSP-1位于肿瘤相关的细胞外间质(extracellular matrix)中，且CD36表达于肿瘤细胞的表面。肿瘤细胞中CD36表达的调节可能在肿瘤生长、转移与血管再生上扮演一个重要的角色。PIM-1是丝氨酸/酪氨酸激酶的产物，其可在胃的上皮细胞中由幽门螺旋杆菌(H.pylori)诱发，其可能参与胃的癌变形成。PIM-1在T细胞的增殖、分化与成熟中也扮演一个重要的角色，其可能与肿瘤的免疫反应有关。PIM-1可由组织缺氧(hypoxia)诱发，其参与实体肿瘤细胞的抗药性(drug resistance)与肿瘤形成(tumorigenesis)，并且会导致基因的不稳定性(genomic instability)。最近的研究显示，PIM的表达与前列腺癌(prostate cancer)的临床检查结果有显著的相关联性。因此，在本发明预测模式中所选用的三个基因可能以某种方式参与跟患者存活极为相关的肿瘤的血管生成与肿瘤免疫反应。
本发明预测模式使用取自RT-PCR状态的资料，来建立成对样本中3个基因的表达分类。由于本发明方法是通过独立的微阵列平台来执行，因此仅需要少量的RNA(例如，当使用RT-PCR时仅需要2μg)即可在一般的实验室中执行。
在本发明中，微阵列的数据经以LOWESS法标准化后，可避免在每个微阵列样本中可能过度标准化的系统化错误。在预测模式的选择过程中，过度拟合问题是一个重要的关键。在本发明中使用随机产生样本以克服此潜在的缺陷，并建立较使用1或2个基因的模式灵敏且特异性高的3基因预测模式。
已有公知报告指出，辅助性治疗对全部已施予D2胃切除术的胃癌患者皆具有边缘效应(marginal effect)。假如胃癌患者的存活结果能被合理的预测，辅助治疗将可用以帮助这些不良存活可能性高的患者，而良好存活可能性高的患者则可省去辅助治疗的副作用。虽然被预测为不好结果可能性高的患者，是否能从辅助治疗获得实质的利益仍无法得知，但是此预测的结果可被用于开发新的医药组合物的临床实验中，或是恶化的胃癌患者(特别是第III期患者)的控制上。
实施例1预测模式的建立18对肿瘤与非肿瘤的胃组织样本，获自台大医院18位患有胃癌，并接受过D2胃切除术(gastrectomy)且无显著残留肿瘤的患者。患者所处肿瘤期(tumor stage)的范围从第I期至第IV期。其中，9名患者于手术后12个月内死于肿瘤复发，在此将其定义为“不良存活(poor survival)”，而另外9名患者于手术后存活超过30个月，在此将其定义为“良好存活(good survival)”。不良存活组中，包含2位第II期的患者、4位第III期的患者，以及3位第IV期的患者。良好存活组中，包含3位第I期的患者、2位第II期的患者，以及4位第III期的患者。在不良存活组中没有第I期的患者，且在良好存活组中也没有第IV期的患者。所有的患者都没有接受手术后化学治疗及放射线治疗。将此18位患者的肿瘤与非肿瘤组织的成对样本进行解剖，并于30分钟内移至液氮桶中冷冻。其中，非肿瘤的粘膜样本取自位于离肿瘤区域至少3cm以上，且明显正常的粘膜区域。
本发明在此使用自制尼龙膜cDNA微阵列，其是由包含384个点(spots)的尼龙膜，采用公知cDNA微阵列的制造方法所制备。位于尼龙膜上的384个点是以每列16个点、每行24个点，以及点距为250μm的方式排列。cDNA微阵列包含328个选自被认为可能与癌症有关的且已知的人类基因的经定序确认的(sequence verified)cDNA克隆(clone)，用以作为杂交反应的靶标。这些基因包括致癌基因、肿瘤抑制基因、细胞凋亡相关的基因(apoptosis-relatedgenes)、基质蛋白酶基因(matrix proteinase genes)、血管生成相关的基因(angiogenesis-related genes)、免疫相关的基因(immune-related genes)等等。在此另以16个植物基因及甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehydes phosphatedehydrogenase，GAPDH)作为微阵列的内参基因。
接着，分别从前述18对样本中抽取其RNAs，以用于进行微阵列杂交(hybridizations)。在此使用Trizol试剂(Invitrogen Life Technologies，Inc.Carlsbad，CA)，从每个胃癌肿瘤组织和对应的非肿瘤部份的样本中，分别抽取30μg的总RNAs，并将其进行逆转录并标记生物素。
前述携带双股cDNAs的微阵列先在1ml的杂交缓冲液(5×RNA提取标准柠檬酸盐(extraction standard saline citrate，SSC)、0.1％十二烷基肌氨酸(N-lauroylsarcosine)、0.1％十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、1％由Roche Molecular Biochemicals公司制造的阻断试剂(blocking reagent)混合物，以及鲑鱼精(salmon-sperm)DNA(50μg/mL))中，在63℃下，预杂交(prehybridized)1.5小时。将生物素标记的cDNA探针与含有人类COT-1DNA的杂交溶液(13μL)和一个微阵列封入于一杂交袋中，并将杂交袋置于63℃下10小时。之后，微阵列的尼龙膜以含有0.1％SDS的2×SSC于室温下清洗5分钟，接着以含有0.1％SDS的0.1×SSC于63℃下清洗3次，每次5分钟。在杂交反应后，将前述尼龙膜置于1ml含有碱性磷酸酶连接的链霉亲和素(alkaline phosphatase-conjugated streptavidin)、4％聚乙二醇(polyethylene glycol)与0.3％牛血清白蛋白(BSA)在1×磷酸盐缓冲溶液(PBS)中进行初步显色反应。用于显色的是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/氮蓝四唑(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium，BCIP/NBT)底物。最后，以含有20mMEDTA的1×磷酸盐缓冲溶液终止显色反应。
显色后，前述尼龙膜通过使用平台式扫描仪(UMAX(Fremont，CA)MagicScan at 3,000dpi)进行扫描并获得图像，并将所得结果的数据库以标记图像档案格式(tagged image file format，Tiff)储存。为定量基因的表达量，在此利用GenePix Pro软件程序(Axon Instruments，Foster City，CA)测量数字化的图像。
之后，将前述每个点上通过酶反应产生的颜色转换成灰度图像。该点的每个像素的明亮值范围，以0至256表示(从黑色经由灰影到白色)。接着，将通过Umax 6000扫描所得的图像，以GenePix Pro 2.0软件计算产生每个微阵列点的表达值，并将这些数据收集成excel文档。将微阵列上每个基因的表达值以对数比值(log ratio)(底为2)表示，其定义为肿瘤组织中每个基因的点表达值对上非肿瘤组织中每个基因的点表达值。
前述所获得的18对样本的微阵列数据(包含良好存活组与不良存活组)，接着利用三步骤的管理分类法，在其两个存活组中挑出最显著不同的表达基因。在第一步骤中，为避免在每个微阵列样本上的系统误差，在此使用非线性的局部加权回归法(locally Weighted Sactterplot Smoother，LOWESS)，据此将328个基因的对数比值标准化至经由MA做图拟合的LOWESS曲线上。第二步骤，通过折叠改变法在每个微阵列样本中定义调节基因，看谁的折叠改变(标准化的对数比值)大于1，据此从所有18个微阵列样本中挑出显著的调节基因。在全部18个微阵列样本中，看谁的折叠改变在18个样本中至少有两个大于1，将其挑出作为显著性调节基因。由此，在本发明中从328个基因中选出141个基因。第三步骤，为了在两存活组间挑出最显著不同的表达基因，在此使用多重排列检定法同时检定所有在第二步骤中过滤过的显著性调节基因，并获得每个基因的调整p值。多重检定是一种用以控制产生不正确检定结论(假阳性与假阴性)的可能性的方法。为评估18个样本的内部一致性，在此使用留一法(leave-one-out)交叉验证产生18个CV样本，并挑出不同的表达基因(调整p值小于0.05 family-wise错误率)。由此从前述141个基因中筛选出6个显著不同的表达基因。这6个基因分别为CD36抗原、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)、转录因子AP-2α(TFAP)、类胰岛素生长因子(IGF-1)、PIM-1致癌基因，以及金属蛋白酶的组织抑制剂-4(TIMP-4)。
在用以描述存活特性的基因被筛选出后，为确认此微阵列结果及进一步明晰前述所选基因表达上的区别，在此使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析所选基因，用前述18个样本中具有足够RNA的10个样本的微阵列数据进行确认。本发明中，使用莫洛尼氏白血病病毒逆转录酶(Moloney MurineLeukemia Virus Reverse Transcriptase)、随机引物，及其它配套试剂(Promega)，通过公知聚合酶链反应(PCR)逆转录出2μg的总RNAs。PCR产物通过公知电泳在1.5％琼脂胶(agarose gel)上进行分离，并用溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)染色后，于紫外光下使其显现。接着，使用NIH Image 1.62软件确定平均染色带密度，并计算所选基因相对于β肌动蛋白(β-actin)基因的值，由此确定6个所选基因的微阵列表达比与RT-PCR结果之间的关系。
为建立供胃癌患者用的存活预测模式，在此从这些不同的基因中挑选出微阵列与RT-PCR结果之间的一致率大于60％或斯皮尔曼等级相关系数具有显著性，且p＜0.05者，将其用于预测模式的训练(参阅图1)。并从其中挑选出4个基因，分别为CD36、SLAM、TFAP与PIM-1。
将每个所选基因在肿瘤组织与非肿瘤组织中的RT-PCR表达量的状态分成四类，分别为(1)肿瘤的表达量高于非肿瘤的表达量，以“肿瘤正常”表示；(2)非肿瘤的表达量高于肿瘤的表达量，以“正常肿瘤”表示；(3)肿瘤与非肿瘤均为阳性；以及(4)肿瘤与非肿瘤均为阴性(图2)。接着，选用20个样本作为预测模式训练组，此20个样本包含前述18个样本中的10个，及从另外新登记的40个样本中随机选出的10个，其中10个为良好存活，另10个为不良存活。在训练组中，将每个样本经RT-PCR分析所得的结果分别分配至前述四种RT-PCR状态类别中。最后，依据训练组所得的四类RT-PCT结果的频率，建立预测模式。接着，依据Akaike’s法则使用罗吉斯回归模式与逐步模式选择有效的预测模式。可从前述4个基因中，获得由其中3个基因(CD36、SLAM与PIM-1)所组成的最有效的罗吉斯预测模式，其预测方程式可推算如下式一所示λ＝0.833CD36-0.762SLAM-0.317PIM-1π＝exp(λ)/(1+exp(λ))(式一)其中，“CD36”、“SLAM”与“PIM-1”分别为前述样本的CD36、SLAM与PIM1在四种RT-PCR状态分类中的出现频率；“π”为“不良存活状况”的可能性。当“π”小于或等于0.5时，会被预测为良好存活(定义为存活时间＞30个月)。当“π”大于0.5时，则会被预测为不良存活(定义为存活时间＜12个月)。CD36、SLAM与PIM-1的罗吉斯回归系数的标准偏差分别为0.411、0.436与0.173。
熟知本技术领域的技术人员，根据阅读本发明说明书所载的内容可了解到，前述(式一)中系数会因所使用的预测模式训练组的患者样本的不同或数量不同而会有些许差异，但其并不影响本发明的实施。可以理解的是，当预测模式训练组中所包含的样本数量越多，根据本发明方法所得的预测公式将会越准确。
实施例2
对于30位患者的独立测试组，应用本发明所指出的由CD36、SLAM与PIM-1所组成的预测模式进行存活预测。将这30位患者的肿瘤与非肿瘤组织样本，分别进行逆转录聚合酶链式反应，据此来获得每位患者组织样本中CD36、SLAM与PIM-1的RT-PCR表达状态。将每个基因的表达状态对照实施例1中RT-PCR状态分类表，由表中获得前述由训练组20个基因所计算出的出现频率，并将每位患者的每种基因所对应的出现频率数值带入(式一)中，由此即可计算出，该名胃癌患者可能的术后存活状况。
经分析后所得结果显示，其中23位患者被正确的预测(76.7％)，并产生80％的特异度(specificity)、73.3％的灵敏度(sensitivity)、75％的阳性预测值，以及78.57％的阴性预测值。频率分布如表1A所示。此结果显示，本发明预测模式在独立测试组中表现出高度的预测能力。患者的存活率被预测为具有“良好存活”显著高于被预测为具有“不良存活”者(p＝0.00531)。(图3A)7位第I期的患者中有6位通过此模式正确地被预测。其中1位患者被预测为“不良存活”，且其于第12个月时死于多重肝脏转移(metastases)。其它6位患者中有5位被正确的预测，其频率分布示于表1B。5位第II期患者中有3位被正确的预测。这3位患者中的2位被预测为具有“不良存活”，并于12个月内死于疾病，其频率分布示于表1C。2位第IV期的患者通过此模式被正确的预测，其频率分布示于表1E。
本发明预测模式应用于16位第III期患者所得的准确度的频率分布示于表1D。12位患者被正确的预测(75％)，其特异度为100％、灵敏度为63.6％、阳性预测值为100％，以及阴性预测值为55.6％。患者的存活率被预测为具有“良好存活”显著高于被预测为具有“不良存活”者(p＝0.04467)。(图3B)表1A 在全部30位测试患者中准确度的频率分布

灵敏度＝73.33％特异性＝80.00％阴性预测值＝78.57％阳性预测值＝75.00％表1B在7位第I期患者中准确度的频率分布

灵敏度＝100.00％特异性＝85.71％阴性预测值＝100.00％阳性预测值＝50.00％表1C在5位第II期患者中准确度的频率分布

灵敏度＝50.00％特异性＝66.67％阴性预测值＝66.67％阳性预测值＝50.00％
表1D在16位第III期患者中准确度的频率分布

灵敏度＝63.64％特异性＝100.00％阴性预测值＝55.56％阳性预测值＝100.00％表1E在2位第IV期患者中准确度的频率分布

灵敏度＝100.00％特异性＝100.00％阴性预测值＝100.00％阳性预测值＝100.00％
权利要求
1.一种通过基因表达图谱建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，包含如下步骤(1)以多个已知胃癌术后存活状况的成对的肿瘤与非肿瘤组织样本为媒介，用其基因表达的微阵列分类图谱，在该些组织样本中筛选出表达显著不同的特异性基因；(2)对上述特异性基因进行逆转录聚合酶链式反应，并确认其结果与该微阵列分类图谱结果的一致性；以及(3)采用一种统计模式选取法，从上述特异性基因中选出肿瘤调节基因，并通过一训练组样本用上述肿瘤调节基因建立该预测模式的公式。
2.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中步骤(1)中的所述基因包含致癌基因、肿瘤抑制基因、细胞凋亡相关的基因、基质蛋白酶基因、血管生成相关的基因，或免疫相关的基因至少其中之一。
3.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中步骤(1)中进一步包含下列步骤(i)将位于所述微阵列上的所述组织样本中与肿瘤调节相关的基因的表达量的对数比值(log ratio)进行标准化(Normalization)；(ii)利用折叠改变法(fold-change)滤除对数比值表达较不显著的基因；以及(iii)以多重排列检定法(multiple permutation test)与交叉验证(crossvalidation，CV)进一步筛选出表达显著不同的特异性基因。
4.根据权利要求3所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述基因的表达量为所述组织样本中所述基因的cDNA表达量。
5.根据权利要求3所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述标准化的步骤使用非线性的局部加权回归法进行。
6.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述步骤(2)中的一致性通过一个选定的筛选标准来执行。
7.根据权利要求6所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述筛选标准为斯皮尔曼等级相关(Spearman rank correlation)检定法p＜0.05。
8.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述统计模式选取法为逐步模式法。
9.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中步骤(3)中进一步包含结合罗吉斯回归分析(logistic regression)，进行所述肿瘤调节基因的选取。
10.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中步骤(3)中所述训练组样本为已知胃癌术后存活状况的成对的肿瘤与非肿瘤组织样本。
11.根据权利要求10所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述训练组样本的样本数目不少于所述预测模式中所述肿瘤调节基因数目的5倍。
12.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述特异性基因包含CD36抗原、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)、转录因子AP-2α(TFAP)、类胰岛素生长因子(IGF-1)、PIM-1致癌基因，或金属蛋白酶的组织抑制剂-4(TIMP-4)至少其中之一。
13.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述肿瘤调节基因基因选自CD36抗原、信号转导淋巴细胞激活分子、转录因子AP-2α与PIM-1致癌因子所组成的族群。
14.根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法，其中所述肿瘤调节基因基因选自CD36抗原、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)与PIM-1致癌因子所组成的族群。
15.一种预测胃癌患者胃癌术后存活状况的方法，其包含如下步骤(a)从胃癌患者取得肿瘤组织与非肿瘤组织的成对样本；(b)以逆转录聚合酶链式反应检测上述成对样本中肿瘤调节基因的表达；以及(c)将步骤(b)中所得的逆转录聚合酶链式反应结果，通过根据权利要求1所述的建立胃癌术后存活状况的预测模式的方法所得的预测模式的公式，计算胃癌患者的存活状况。
16.根据权利要求15所述的预测胃癌患者胃癌术后存活状况的方法，其中所述非肿瘤组织相距所述肿瘤组织不少于3cm。
17.根据权利要求15所述的预测胃癌患者胃癌术后存活状况的方法，其中所述肿瘤调节基因包含CD36抗原、信号转导淋巴细胞激活分子、转录因子AP-2α、类胰岛素生长因子、PIM-1致癌因子，或金属蛋白酶的组织抑制剂-4至少其中之一。
18.根据权利要求15所述的预测胃癌患者胃癌术后存活状况的方法，其中所述肿瘤调节基因选自CD36抗原、信号转导淋巴细胞激活分子与PIM-1致癌因子所组成的族群。
19.根据权利要求18所述的预测胃癌患者胃癌术后存活状况的方法，其中所述公式具有如下(式一)所示的方程式λ＝0.833CD36-0.762SLAM-0.317PIM-1π＝exp(λ)/(1+exp(λ)) (式一)其中，“CD36”、“SLAM”与“PIM-1”分别为待测组织样本的该基因在该状态分类中所相对应的出现频率；“π”为“不良存活状况”的可能性；当“π”小于或等于0.5时，为良好存活；当“π”大于0.5时，为不良存活。
20.根据权利要求19所述的预测胃癌患者胃癌术后存活状况的方法，其中所述良好存活是指存活时间不少于30个月。
21.根据权利要求19所述的预测胃癌患者胃癌术后存活状况的方法，其中所述不良存活是指存活时间不多于12个月。
全文摘要
一种通过基因表达图谱预测胃癌术后存活状况的方法，其依据胃癌患者(训练组样本)的肿瘤与非肿瘤组织中基因的表达，以公知统计方法建立出D2胃切除术后存活状况的表达显著不同的特异性基因微阵列分类图谱。之后，进一步将组织样本中这些表达显著不同的特异性基因，以反转录聚合酶链反应(RT－PCR)进行分析，并将其表达状况，以公知统计方法在训练组样本中，建立出本发明预测模式。之后，仅需通过将此预测模式，应用于其它的胃癌患者(独立测试组)，即可预测该胃癌患者的术后存活状况，以供后续治疗以及是否进行辅助性治疗(adjuvant chemotherapy)参考。
文档编号C12Q1/68GK1924023SQ20051009583
公开日2007年3月7日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者陈炯年, 林真真, 谢丰舟, 张金坚 申请人:陈炯年, 林真真, 谢丰舟, 张金坚