专利名称：通过URLC8的tRNA－二氢尿苷合酶活性诊断非小细胞肺癌的方法
技术领域：
本发明涉及肺癌，更具体地涉及非小细胞肺癌，以及它的诊断和治疗。
背景技术：
肺癌是世界范围内因癌症而死亡的最普遍的原因之一，而非小细胞肺癌(NSCLC)占那些病例的近80％(Greenlee，R.T.，等，(2001)CA CancerJ Clin，5115-36)。已经报道了许多与肺癌的发生和进展有关的遗传改变，但是精确的分子机制尚不清楚(Sozzi，G.Eur J Cancer，(2001)37 Suppl 7S63-73)。在过去的十年里，新开发的细胞毒性试剂，包括紫杉醇、多西他奇、2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷和长春瑞滨已经出现，为患有进展型NSCLC的患者提供多种治疗选择；然而，与以顺铂为基础的疗法相比，每种新疗法仅能提供有限的延长生命的效果。(Schiller，J.H.等，(2002)N Engl J Med，34692-98.；Kelly，K.，等，(2001)J Clin Oncol，193210-3218)。因此，迫切期待例如分子靶向物质和抗体以及癌症疫苗等新治疗策略的开发。
系统分析cDNA微阵列上数千基因的表达水平是鉴定涉及癌发生途径的未知分子的有效方法，并可揭示用于开发新的治疗法和诊断法的候选靶标。本发明人曾尝试分离用于诊断、治疗和预防NSCLC的新的分子靶标，该方法通过分析在含有23,040个基因的cDNA微阵列上NSCLC细胞的基因组范围内的表达分布型而进行，并使用纯的肿瘤细胞群，这些肿瘤细胞通过激光捕获显微解剖从37个癌组织中制备(Kikuchi，T.等，Oncogene，(2003)222192-2205.；Zembutsu，H.等，(2003)Int J Oncol，2329-39.；Kakiuchi，S.等，Mol Cancer Res，(2003)1485-499.；Suzuki，C.等，(2003)Cancer Res，637038-7041)。通过这一基因组范围内的cDNA微阵列分析，642个上调基因和806个下调基因被鉴定为NSCLC的诊断标记和治疗靶标(WO 2004/31413)。
发明综述为了证实各个基因产物的生物学和临床病理学重要性，进行了临床肺癌材料的肿瘤组织微阵列分析。这一系统方法揭示了一种新的基因，暂时定名为IMS-E21(也称作URLC8在肺癌中上调8，登录号AB101210；以前为FLJ20399)，在原发性NSCLC中频繁地过量表达。
URLC8基因编码双链RNA结合基序(DSRM)结构域。这一基因在正常组织中低表达，在NSCLC中表达上升，以及通过抑制这一基因使转染细胞的生长、增殖和/或存活降低，这些都表明这一基因可用作新的诊断标记以及新药和免疫疗法的靶标(WO2004/31413)。
URLC8基因定位于染色体16q22.2，并编码与酿酒酵母(S.cerevisiae)Dus1(二氢尿苷合酶1)具有30％的同源性的493个氨基酸的蛋白，酿酒酵母Dus1是UPF0034(unclassified protein family 0034)(未分类的蛋白家族0034)中的一员，其催化tRNA中D-环上尿苷残基5，6-双键的还原(Xing，F.等，RNA，(2002)8370-381)，并包含保守的DSRM(双链RNA结合基序)。
5，6-二氢尿苷是在来自古细菌(Archaea)、细菌和真核生物(Eukarya)的tRNA的D-环中大量发现的修饰的碱基。5，6-二氢尿苷被认为是通过tRNA转录物中尿苷的还原而转录后形成的。tRNA中二氢尿苷的作用被认为是提高tRNA的构象柔性。有趣的是，以前报道过在从人恶性组织纯化的肿瘤特异性tRNAPhe中二氢尿苷水平的提高(Kuchino，Y.和Borek，E.(1978)Nature，271126-129)，然而，其精确机制和对肿瘤发生的生物学作用仍不清楚(Dalluge，J.J.等，(1996)Nucleic Acids Res，241073-1079)。
这里，本发明人报道了在人的肺部肿瘤中一种新的人tRNA-二氢尿苷合酶(DUS)蛋白，URLC8，的鉴定和功能表征。其结果表明URLC8的过量表达在肺癌的发生/进展过程中起重要作用，并且该分子代表开发新的治疗药物的潜在靶标。
本发明部分基于发现URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性，其为涉及肺癌细胞增殖的多肽。
因此，本发明提供了诊断受试者的非小细胞肺癌或者发生非小细胞肺癌倾向的方法，所述方法包括测定从受试者获得的生物学样品中t-RNA二氢尿苷合酶活性和/或t-RNA二氢尿苷的水平，其中与正常对照水平相比所述水平的提高表明所述受试者患有或处于发生非小细胞肺癌的风险中。
本发明还提供了预测肺鳞状细胞癌(squamous-cell carcinoma)(SCC)预后的方法。在一些实施方案中，该方法包括如下步骤a.检测从受试者收集的样品中URLC8的表达水平，所述受试者的SCC预后将被预测，和b.当检测到URLC8表达水平提高时表明预后不良。
在其它实施方案中，本发明描述了通过在适合于t-RNA二氢尿苷合成的条件下孵育多肽并检测t-RNA二氢尿苷合成水平来测定t-RNA二氢尿苷合酶活性的方法。该多肽是URLC8多肽或其功能等价物。例如，该多肽可包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。或者，该多肽可包含SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入，只要获得的多肽保持SEQ ID NO2多肽的生物学活性。SEQ ID NO2多肽的生物学活性包括例如促进细胞增殖和合成t-RNA二氢尿苷。此外，该多肽可包含493个氨基酸的蛋白，该蛋白由SEQ ID NO1的可读框编码，或者由在例如或低或高的严谨条件下与SEQ ID NO1的核苷酸序列杂交的多核苷酸编码，只要得到的多核苷酸编码保持SEQ ID NO2多肽的生物学活性的蛋白。适当的低严谨条件的例子包括，例如42℃、2X SSC、0.1％SDS，或优选地50℃、2X SSC、0.1％SDS。优选地使用高严谨条件。适当的高严谨条件的例子包括，例如室温下在2X SSC、0.01％SDS中洗涤3次每次20分钟，然后37℃下在1xSSC、0.1％SDS中洗涤3次每次20分钟，随后50℃下在1xSSC、0.1％SDS中洗涤2次每次20分钟。然而，一些因素如温度和盐浓度会影响杂交的严谨度，本领域技术人员可以适当地选择这些因素以获得必要的严谨度。
在本发明的上下文中，定义t-RNA二氢尿苷合酶活性为还原t-RNA上尿苷残基的5，6-双键的催化作用(
图1c)。t-RNA二氢尿苷的合成可通过常规方法检测，例如那些使用放射性tRNA底物或其衍生物的方法。该底物可以是能够还原尿苷残基的5，6-双键的任何化合物。示例性底物是具有D-环的tRNA，如tRNAPhe或其它tRNA。辅因子，例如，给氢体，可以是能够供给氢原子的任何化合物。例如，辅因子可以是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的还原形式。适当的合成条件包括，例如本领域已知的碱性缓冲条件，如Tris-HCl。
本发明进一步提供了通过在测试物质存在的情况下，在适合于t-RNA二氢尿苷合成的条件下孵育多肽并测定t-RNA二氢尿苷的合成水平来鉴定调节(例如提高或降低)t-RNA二氢尿苷合酶活性的物质的方法。与正常对照合成水平相比合成水平的下降表明测试物质是t-RNA二氢尿苷合酶活性的抑制剂。抑制(例如降低)t-RNA二氢尿苷合酶活性的化合物对于治疗、预防或减轻肺癌的症状是有用的。例如，这种化合物可抑制肺癌细胞的增殖。另外，与正常对照水平相比水平或活性的提高表明测试试剂是t-RNA二氢尿苷合酶活性的增强剂。本文中，短语“正常对照水平”是指在缺少测试化合物的情况下检测的t-RNA二氢尿苷合成的水平。
本发明还包括通过将肺癌细胞与上文所述鉴定的化合物接触而治疗或预防肺癌的组合物和方法。在其它实施方案中，本发明提供如上文所述鉴定的化合物的用途，用于生产适合于治疗或预防肺癌的药物组合物。例如，治疗肺癌的方法可包括向哺乳动物施用含有如上文所述鉴定的药学有效量的化合物和药物载体的组合物的步骤，所述哺乳动物例如已被诊断具有这种疾病状态的人类患者。
本发明还提供用来检测化合物的t-RNA二氢尿苷合酶活性的试剂盒，所述试剂盒含有t-RNA二氢尿苷合酶多肽或表达该多肽的活细胞，以及检测t-RNA二氢尿苷合酶活性的试剂。试剂优选地以试剂盒的形式包装在一起。试剂可包装在单独的容器中并可包括，例如，t-RNA二氢尿苷合酶多肽、检测t-RNA二氢尿苷合酶活性的试剂、对照试剂(阳性和/或阴性的)、和/或可检测的标记。用来实施所述测定的说明书(例如，书面的、磁带、VCR、CD-ROM等)优选地包含在所述试剂盒中。所述试剂盒的测定方式可包括本领域已知的任何t-RNA二氢尿苷合酶测定。
在其它实施方案中，本方法可包括施用给受试者小干扰RNA(siRNA)组合物的步骤。在本发明的上下文中，siRNA组合物降低URLC8的表达。
当阅读了下文的详细描述以及附图和实施例，本发明的这些和其它目的和特征将更加完全清晰。然而，应当理解本发明上述概要以及下文的详细描述都是优选的实施方案，不是对本发明或本发明其它可选择的实施方案的限制。
除另有说明外，本文使用的所有技术和科学术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管类似或等同于本申请描述的方法及材料都可用于实施或测试本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。如有抵触，将以本说明书，包括定义为准。此外，所述材料、方法和实施例仅作为说明性的，而不意图构成限制。
附图的简要描述图1描述IMS-E21(URLC8)的结构以及t-RNA二氢尿苷的结构特征。
a，IMS-E21(URLC8)蛋白的示意结构。UPF0034(未分类的蛋白家族0034)的一个成员，N-末端的Dus结构域和C-末端的DSRM(双链RNA结合基序)在其蛋白结构中是保守的，显示与酿酒酵母二氢尿苷合酶1(DUS1)具有30％的同源性，后者催化tRNA上尿苷残基5，6-双键的还原。b，IMS-E21(URLC8)的预测氨基酸序列的比对。阴影表示同源残基。c，tRNA中二氢尿苷的结构。d，具有D-环核苷酸的一般tRNA的二维描述。
图2描述在肺部肿瘤和正常组织中IMS-E21(URLC8)的表达a，通过半定量RT-PCR测定NSCLC临床样品和相应正常肺部组织中IMS-E21(URLC8)的表达。b，通过半定量RT-PCR测定肺癌细胞系中IMS-E21(URLC8)的表达。c，通过多组织Northern印迹分析检测人正常组织中IMS-E21(URLC8)的表达。
图3描述NSCLC中IMS-E21(URLC8)的表达的免疫组织化学研究结果，和通过针对IMS-E21(URLC8)的siRNA抑制NSCLC细胞生长。
a，在组织微阵列上使用抗-IMS-E21(URLC8)多克隆抗体对从外科手术切除的NSCLC组织来源的代表性样品进行免疫组织化学评估。b，根据IMS-E21(URLC8)的表达，对肺SCC患者中肿瘤特异性存活度进行Kaplan-Meier分析。c，(左图)LC319细胞中响应于si-IMS-E21(URLC8)或对照siRNA的mRNA敲减作用(knock down)，其中通过半定量RT-PCR分析(上图)、和通过蛋白质印迹测定内源IMS-E21(URLC8)蛋白敲减作用(中图)、和(下图)集落形成分析。(右图)用特异性siRNA或对照质粒(EGFP、乱序或荧光素酶)转染的LC319细胞的MTT测定。
图4描述对NSCLC细胞中IMS-E21(URLC8)功能的表征。
a，LC319细胞中内源IMS-E21(URLC8)的亚细胞定位；染色主要在细胞质中可见(罗丹明)。观察到myc标签的IMS-E21(URLC8)(罗丹明)和内源PDI(蛋白质二硫键异构酶)(FITC)的共定位，内源PDI是内质网(ER)的高丰度蛋白。b，EPRS作为IMS-E21(URLC8)相互作用蛋白的鉴定。IMS-E21(URLC8)和EPRS的交互共免疫沉淀，二者都被转染到LC319细胞提取物。用抗-FLAG M2单克隆抗体免疫沉淀的细胞提取物的Western印迹分析，检测出免疫沉淀物中的myc标签的IMS-E21(URLC8)蛋白。用抗-myc抗体免疫沉淀的提取物的Western印迹分析，检测出免疫沉淀物中的FLAG标签的EPRS蛋白。c，LC319细胞中myc标签的IMS-E21(URLC8)和FLAG标签的EPRS的共定位。d，用针对IMS-E21(URLC8)的siRNA处理的A549和LC319细胞中tRNA二氢尿苷含量的减少。
发明详述综述虽然用于癌症治疗的分子靶向药物的开发取得了一些进展，但是对这些药物作出反应的肿瘤类型的范围以及治疗的有效性仍非常有限(Ranson，M.，等(2002)J Clin Oncol，202240-2250.；Blackledge，G.和Averbuch，S.(2004)Br J Cancer，90566-572.)。因此，急需开发对恶性肿瘤细胞具有高度特异性且具有很少或无不良反应的新的抗癌试剂。针对这些目标的强有力策略将组合下列三者根据cDNA微阵列上获得的遗传信息筛选癌细胞中上调的基因，通过用RNAi系统诱导功能丧失表型而高通量筛选这些基因对细胞生长的作用，以及通过分析组织微阵列上数百个临床样品证实潜在的药物靶标(Sauter，G.，等，(2003)Nat Rev Drug Discov，2962-972.；Kononen，J.，等.(1998)Nat Med，4844-847)。通过遵循这一策略，在此本发明人证实IMS-E21(URLC8)不仅在临床NSCLC样品和细胞系中频繁地共过量表达，而且基因产物的高水平表达对疾病的进展以及NSCLC细胞的增殖是不可缺少的。
IMS-E21(URLC8)定位于染色体16q22.2，并编码与酿酒酵母二氢尿苷合酶1(Dus1)具有30％同源性、并具有保守的双链RNA结合基序，DSRM的493个氨基酸的蛋白，酿酒酵母二氢尿苷合酶1是UPF0034(未分类的蛋白家族0034)中的一员，其催化tRNA上尿苷残基5，6-双键的还原(Xing，F.等，RNA，(2002)8370-381)。几项研究显示tRNA修饰增强了结构的稳定性(Bjork，G.R.，等，(1987)Annu Rev Biochem，56263-287)。相反，潜在地降低局部稳定性并促进单个核苷酸残基构象柔性的修饰则较少受到重视。二氢尿苷是来自细菌和真核细胞的tRNA转录后修饰的唯一的最普遍形式(Sprinzl，M.，等，(1998)Nucleic Acids Res，26148-153)。几十年来人们已知5，6-二氢尿苷普遍存在于tRNA的D-环中，并且在酿酒酵母和大肠杆菌中鉴定出一些DUS酶，但是在哺乳动物细胞中先前尚未鉴定出具有双链RNA结合基序的DUS酶(Xing，F.，等，(2002)RNA，8370-381.；Kuchino，Y.和Borek，E.(1978)Nature，271126-129)。
有趣的是，关于肿瘤细胞tRNA中的二氢尿苷，以前报道过在从人恶性组织纯化的肿瘤特异性tRNAPhe中二氢尿苷水平的提高。tRNA中二氢尿苷的作用可能是提高tRNA的构象灵活性，但其准确功能仍不清楚。为了阐明IMS-E21(URLC8)的生物学功能及其对肺癌发生的作用，测定IMS-E21(URLC8)蛋白在LC319细胞中的亚细胞定位，并发现定位于ER。为了阐明在人NSCLC细胞中天然IMS-E21(URLC8)蛋白对于tRNA-DUS活性是否是必需的，将IMS-E21(URLC8)-siRNA载体转染到IMS-E21(URLC8)基因被高度表达的A549和LC319细胞系中。在那些肺癌细胞中，内源IMS-E21(URLC8)的表达被siRNA显著抑制，tRNA-DUC活性被降低，导致癌细胞增殖的抑制。在此的结果提示，IMS-E21(URLC8)可能在NSCLC细胞的tRNA-二氢尿苷的合成中起重要作用，对于翻译过程以及当过量表达时，对于NSCLC细胞的增殖和存活可能是必需的。本文的数据有力地暗示了设计专一性抑制IMS-E21(URLC8)的新抗癌药物的可能性。靶向IMS-E21(URLC8)酶活性和/或IMS-E21(URLC8)-tRNA合成酶复合物可能是治疗肺癌患者的有希望的治疗和诊断策略。
URLC8及其功能等价物以及它们的用途本文中，本文中使用的词语“a”、“an”和“the”除另有说明外是指“至少一个”。
如上文所述，本发明部分基于对新t-RNA二氢尿苷合酶，URLC8的发现，它涉及肺癌细胞的增殖。本发明还基于发现URLC8的高表达水平与肺鳞状细胞癌(SCC)患者不良预后有关。由于本文提供了URLC8表达与癌症患者的不良预后有关的证据，因此本发明提供了测定癌症患者预后的方法。这种方法的例子包括如下步骤a.检测从受试者收集的样品中URLC8的表达水平，该受试者的SCC预后将被预测，和b.当检测到URLC8的表达水平提高时则指示预后不良。
在本发明的上下文中，当在测试样品中检测到URLC8的表达水平高于对照水平时，即认为测试样品具有提高水平的URLC8表达。本发明上下文中有用的对照水平的例子可包括取自与良好预后相关的组的URLC8表达水平的标准值。该标准值可通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2S.D.或平均值±3S.D.间的范围可用作标准值。另外，当通过样品组织的免疫组织化学分析观察到强烈染色时可测定不良预后。
在本发明的上下文中，URLC8的表达水平可通过选自下组方法的任何一种方法检测(a)检测编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的mRNA，(b)检测包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质，和(c)检测包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质的生物学活性。
在本发明的上下文中，mRNA、蛋白质或该蛋白质的生物学活性可通过任何方法检测。检测给定的蛋白质、mRNA或它们的生物学活性的方法是本领域的技术人员熟知的。例如，mRNA可使用已知的基于PCR或杂交的技术检测。另外，任何一种免疫测定方式都可用于检测蛋白质。此外，URLC8，例如t-RNA二氢尿苷合酶的生物学活性，或者与EPRS之间的相互作用也同样可使用任何适当的测定方法检测，例如本文描述的方法。
在本发明的上下文中，不良预后的测定可用于确定进一步的治疗，例如，停止降低生活质量的进一步的治疗，以与先前使用的方式不同的方式治疗癌症，或者更积极地治疗癌症。换句话说，即使没有该疾病的常规临床分级信息，仅使用常规组织取样方法，通过URLC8预测预后也能使临床医生预先选择对个体SCC患者最恰当的治疗。
此外，本发明的方法可用于评估疗程的效能。例如，在患有癌症的哺乳动物中，正是从所述哺乳动物中获得了URLC8表达水平被发现提高的生物学样品，抗癌治疗的效能可通过监测URLC8随时间的表达水平而评估。例如，与取自治疗开始前或更早的哺乳动物的样品中观察到的水平相比，取自治疗过程后的哺乳动物的生物学样品中URLC8的表达水平下降，该治疗可表明为有效的治疗。
如上所述，本发明还提供预测肺鳞状细胞癌(SCC)预后的试剂盒，包括选自下组的任何一种成分(a)用于检测编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的mRNA的试剂，(b)用于检测包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质的试剂，和(c)用于检测包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质的生物学活性的试剂。
URLC8具有t-RNA二氢尿苷合酶活性，其表达水平在肺癌细胞中与非肺癌组织相比明显提高。因此，URLC8介导的t-RNA二氢尿苷活性被用作例如非小细胞肺癌等肺癌的诊断参数。因此，本发明提供了诊断受试者中非小细胞肺癌或发生非小细胞肺癌素因的方法，所述方法包括测定源自受试者的生物学样品中t-RNA二氢尿苷合酶活性和/或t-RNA二氢尿苷水平的步骤，其中与正常对照水平相比所述水平提高表明所述受试者患有或处于发生非小细胞肺癌的风险中。细胞中t-RNA二氢尿苷的累积反映了t-RNA二氢尿苷合酶活性的存在。因此，细胞t-RNA二氢尿苷合酶活性可通过测定细胞中t-RNA二氢尿苷评估。t-RNA二氢尿苷可通过本领域已知的任何方法测定。例如，t-RNA二氢尿苷可通过使用N-苯基-对-苯二胺和2，3-丁二酮单肟(2，3-butadione monoxime)的比色测定(Jacobson，M.和Hedgcoth，C.(1970)Anal Biochem，34459-469)确定。本发明中可使用取自要被诊断的患者的任何样品。用于本发明上下文的优选样品的例子是通过活检或外科切除获得的肺部组织。
本发明还提供了检测URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶的试剂盒。这种试剂盒的成分的例子包括，具有D-环的t-RNA作为底物，例如t-RNAPhe或其它t-RNA(t-RNATyr和t-RNAGlu除外)，与URLC8结合的抗体，和用于检测细胞中抗体的可检测的标记物。
URLC8 cDNA由2,020个核苷酸组成，它包含SEQ.ID.NO.1中显示的1,479个核苷酸的可读框。该可读框编码493个氨基酸的蛋白质，该蛋白质具有SEQ.ID.NO.2显示的氨基酸序列。该氨基酸序列显示与酿酒酵母Dus1(二氢尿苷合酶1)具有30％的同源性，是UPF0034(未分类的蛋白质家族)中的成员，该氨基酸序列还包含保守DSRM(双链RNA结合基序)。酿酒酵母Dus1催化tRNA中D-环上尿苷残基5，6-双键的还原(Xing，F.等，RNA，(2002)RNA，8370-381)。URLC8主要定位于细胞质，并与富含ER的蛋白PDI共定位。
本发明还基于发现URLC8具有t-RNA二氢尿苷合酶活性。为此目的，本发明的一个方面涉及鉴定调节URLC8介导的t-RNA二氢尿苷合酶活性的测试化合物。相应地，本发明提供通过抑制URLC8介导的t-RNA二氢尿苷合酶活性，鉴定延缓或阻止例如非小细胞肺癌进展的化合物的新方法。
因此，本发明提供筛选调节URLC8 t-RNA二氢尿苷合酶活性的化合物的方法。该方法通过将URLC8或具有t-RNA二氢尿苷合酶活性的其功能等价物与一种或多种候选化合物接触，并测定接触的URLC8或功能等价物的t-RNA二氢尿苷合酶活性来实施。这样鉴定出调节URLC8或功能等价物的t-RNA二氢尿苷合酶活性的化合物。
在本发明的上下文中，术语“功能等价物”是指具有t-RNA二氢尿苷合酶活性的对象蛋白。对象蛋白是否具有目标活性可依据本发明测定。例如，t-RNA二氢尿苷合酶活性可通过在适合于t-RNA二氢尿苷合成的条件下孵育多肽，并检测t-RNA二氢尿苷合成水平确定。
制备与给定蛋白功能相当的蛋白的方法是本领域技术人员已知的，包括向蛋白导入突变的常规方法。例如，本领域技术人员可通过经定点诱变在人URLC8蛋白的氨基酸序列中引入适当的突变制备功能等同于人URLC8蛋白的蛋白(Hashimoto-Gotoh，T.等，(1995)，Gene 152，271-275；Zoller，MJ，和Smith，M.(1983)，Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)，Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W和Fritz HJ.(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1991)，Methods Enzymol.204，125-139)。氨基酸突变也可自然发生。适用于本发明上下文中的蛋白包括那些具有人URLC8蛋白的氨基酸序列的蛋白，其中一个或多个氨基酸发生突变，条件是获得的突变蛋白功能上等同于人URLC8蛋白。在这样的突变体中要被突变的氨基酸的数量通常为25个氨基酸或更少，优选地10-15个氨基酸或更少，更优选地5-6个氨基酸或更少，甚至更优选地2-3个氨基酸或更少。为保持t-RNA二氢尿苷合酶活性，优选地在突变蛋白的氨基酸序列中保留DSRM(双链RNA结合基序)。
突变或修饰蛋白，即具有通过缺失、添加和/或取代某个氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基而被修饰的氨基酸序列的蛋白，已知保留了原来的生物学活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666，Zoller，M.J.& Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500，Wang，A.等，Science(1984)224，1431-1433，Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
要被突变的氨基酸残基优选地突变成不同的氨基酸，其中氨基酸侧链的性质被保留(本领域称之为“保守氨基酸取代”的过程)。氨基酸侧链性质的例子是疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，和具有下列功能团或共同特征的侧链脂族侧链(G，A，V，L，I，P)；包含羟基的侧链(S，T，Y)；包含硫原子的侧链(C，M)；包含羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；包含碱的侧链(R，K，H)；包含芳香族基的侧链(H，F，Y，W)。注意，括号中的字母表示氨基酸的单字母代码。
一个或多个氨基酸残基添加到人URLC8蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白的例子是包含人URLC8蛋白的融合蛋白。适用于本发明上下文的融合蛋白包括，例如人URLC8蛋白与其它肽或蛋白的融合体。融合蛋白可使用本领域技术人员已知的技术制备，例如通过将编码本发明的人URLC8蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白的DNA共同读框连接，将融合DNA插入表达载体，并在宿主中进行表达。对于将要融合到本发明蛋白的肽或蛋白没有限制。
可用作与URLC8蛋白融合的肽的已知肽包括，例如FLAG(Hopp，T.P.等，(1988)Biotechnology 6，1204-1210)、包含6个His(组氨酸)残基的6xHis、10xHis、流感凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B-标签、蛋白C片段等。可与本发明蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等等。
融合蛋白可通过如下过程制备将商业购得的编码上述融合肽或蛋白的DNA与编码本发明蛋白的DNA融合，并表达制备的融合DNA。
本领域已知的另一种分离功能等价蛋白的方法例如，使用杂交技术的方法(Sambrook，J.等，(1989)Molecular Cloning第二版，9.47-9.58，ColdSpring Harbor Lab.Press)。本领域技术人员能够容易地分离与编码人URLC8蛋白的全部或部分URLC8DNA序列(例如SEQ ID NO1)具有高度的同源性的DNA，以及分离从分离的DNA获得的人URLC8蛋白的功能等价蛋白。用于本发明的蛋白包括由与编码人URLC8蛋白的全部或部分DNA序列杂交的DNA编码的蛋白质和与人URLC8蛋白功能相当的蛋白质。这些蛋白包括对应于衍生自人或大鼠的蛋白的哺乳动物同源物(例如由猴、小鼠、兔或牛基因编码的蛋白质)。在从动物中分离与编码人URLC8蛋白的DNA具有高度同源性的cDNA时，特别优选地使用来自睾丸或肺癌的组织。
用于分离编码功能等价于人URLC8蛋白的蛋白的DNA的杂交条件可由本领域的技术人员常规选择。例如，杂交可通过使用“快速杂交缓冲液(Rapid-hyb buffer)”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃预杂交30分钟或更长，添加标记探针，并在68℃加热1小时或更长进行。例如，对于低严谨条件可进行如下的洗涤步骤。示例性的低严谨条件包括，例如，42℃、2X SSC、0.1％SDS或优选地50℃、2X SSC、0.1％SDS。更优选地选择高严谨条件。示例的高严谨条件包括，例如，室温下在2X SSC、0.01％SDS中洗涤3次，每次20分钟，然后在37℃、1X SSC、0.1％SDS中洗涤3次，每次20分钟，并在50℃、1X SSC、0.1％SDS中洗涤2次，每次20分钟。然而，一些因素，如温度和盐浓度，会影响杂交的严谨度。选择获得必需的严谨水平所需的因子属于常规的最优化过程，该过程是在本领域技术人员的能力范围内的。
除杂交外，可利用基因扩增方法，例如聚合酶链反应(PCR)方法，使用基于编码人URLC8蛋白(SEQ ID NO2)的DNA(SEQ ID NO1)的序列信息合成的引物，分离编码功能等价于人URLC8蛋白的蛋白的DNA。
由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的、功能等价于人URLC8蛋白的蛋白，通常与人URLC8蛋白的氨基酸序列具有高度的同源性。在本发明的上下文中，术语“高度同源性”是指40％或更高的同源性，优选地60％或更高，更优选地80％或更高，甚至更优选地95％或更高。蛋白质同源性可依据“Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，726-730”中的算法测定。
本发明上下文中的蛋白可在氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的存在或缺失，或形态上存在差异，这取决于用于产生该蛋白的细胞或宿主或采用的纯化方法。然而，只要它具有等价于人URLC8蛋白(SEQ ID NO2)的功能，它就可用于本发明的上下文中。
用于本发明上下文中的蛋白可通过本领域技术人员已知的方法制备成重组蛋白或天然蛋白。可制备重组蛋白，例如通过将编码本发明的蛋白质的DNA(例如包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA)插入适当的表达载体，将载体导入适当的宿主细胞，获得提取物，通过将提取物进行层析纯化蛋白，所述层析例如离子交换层析、反相层析、凝胶过滤、或利用其上固定了本发明蛋白抗体的层析柱的亲和层析，或通过组合上述层析柱中的不止一个而进行。
此外，当用于本发明上下文中的蛋白在宿主细胞(例如动物细胞或大肠杆菌)中被表达为与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白融合的融合蛋白或者附加了多个组氨酸的重组蛋白时，该表达的重组蛋白可使用谷胱甘肽柱或镍柱纯化。
融合蛋白纯化后，还可能通过按所要求的用凝血酶或因子Xa切除来除去目的蛋白之外的区域。
可采用本领域技术人员已知的方法分离天然蛋白，例如通过将表达本发明蛋白的组织或细胞提取物与亲和柱接触，在所述亲和柱中结合有下述与URLC8蛋白结合的抗体。该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明中，URLC8或其功能等价物的t-RNA二氢尿苷合酶活性可通过本领域已知的方法测定。例如，URLC8和底物，例如含有D-环的tRNA可在适合于t-RNA二氢尿苷合成的测定条件下与给氢体孵育。本发明中，用于t-RNA二氢尿苷合成的示例性条件包括将底物、给氢体与t-RNA二氢尿苷合酶或样品接触，并孵育它们。tRNAPhe以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的还原形式分别为适当的底物和给氢体的例子。优选地，将底物或供体的氢原子进行标记，以追踪t-RNA二氢尿苷。特别地，在本发明上下文中，放射性标记的tRNA是优选的底物。还原的放射性标记的tRNA(t-RNA二氢尿苷)可使用任何适当的方法检测。增加氢原子导致的tRNA分子量的提高可通过例如适当的层析法检测，例如薄层层析。例如，用于t-RNA二氢尿苷合成的适当条件如下反应混合物100mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM醋酸铵，5mM MgCl2，2mM DTT，0.1mM EDTA，1mM NADPH，1mM NADH，和50,000cpm的标记的tRNA转录物(6fmol)反应混合物与含有将被测定的t-RNA二氢尿苷合酶的样品混合，并在30℃孵育30分钟。在滴定试验中，提取物和纯化蛋白优选地用含有50mMTris-HCl、pH8.0、250μg/mL牛血清清蛋白和2mM DTT的缓冲液稀释。在一些试验中，还包含250μM的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。孵育后，从混合物中提取RNA，并用P1核酸酶处理。然后，核苷酸通过薄层层析分离，所述层析或者使用纤维素板用含有硫酸铵(74g/100mL H2O，pH3.5)∶H2O∶异丙醇(80∶18∶2，v/v/v)的溶剂一维展开，或者使用PEI-纤维素板进行二维展开，其中1M醋酸、pH3.5用于第一维，含有74g硫酸铵/100mLH2O(用H2SO4调整到pH3.5)的缓冲液用于第二维(Bochner & Ames，(1982)J Biol Chem 2579759-9769)。滴定试验中，1单位活性被定义为转变一半tRNA所需的蛋白质的量。
另外，URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性可根据t-RNA二氢尿苷的累积评估。t-RNA二氢尿苷可通过比色方法检测。此外，URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性可通过在反应过程中消耗的NADH和/或NADPH测定。测定NADH和/或NADPH的适当的方法是本领域技术人员已知的。另外，反应后，tRNA和还原的tRNA中的任何一个或二者都可用质谱分析检测，例如MALDI-TOF-MS。
各种低通量和高通量酶测定方式是本领域已知的，并容易地适用于检测和测定URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性。对于高通量测定，tRNA底物优选地固定在固相支持物上，例如多孔平板、载玻片或芯片。反应后，还原产物(t-RNA二氢尿苷)可在固相支持物上检测。另外，t-RNA二氢尿苷合酶反应可在溶液中发生，其后t-RNA二氢尿苷可固定于固相支持物上并检测。为了检测tRNA的还原，例如，H3标记的NADH和/或HADPH可用作给氢体。还原产物(t-RNA二氢尿苷)可用放射性H3追踪。为了便于进行这一分析，固相支持物可用链霉抗生物素蛋白包被，tRNA用生物素标记。技术人员可依据筛选所需的通量能力确定适当的分析方式。
任何测试化合物，包括但不限于，细胞提取物，细胞培养上清液，发酵微生物的产物，海洋生物提取物，植物提取物，纯化的或粗制的蛋白，肽，非肽化合物，合成的小分子化合物以及天然化合物，都可用于本发明的筛选方法。本发明受试化合物可使用本领域已知的组合文库方法中的多种方法之一获得，所述文库包括(1)生物文库，(2)可空间定位(spatiallyaddressable)的平行固相或液相文库(3)需要重叠合法(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠，一化合物(one bead，one compound)”文库法，和(5)使用亲和层析选择的合成文库法。使用亲和层析选择的生物学文库法仅限于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145)。合成分子文库的方法的举例见于下述文献(DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science 2611303；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233)。化合物文库可存在于溶液中(参见Houghten(1992)Bio/Techniques 13412)、或珠(Lam(1991)Nature 35482)，芯片(Fodor(1993)Nature 364555)，细菌(美国专利5,223,409)，孢子(美国专利5,571,698；5,403,484,和5,223,409)，质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865)或噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249386；Delvin(1990)Science 249404；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301；美国专利申请2002103360)。
使用本发明筛选方法分离的化合物是抑制URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性的药物的候选物，可用于治疗或预防USCLC。
此外，其中抑制URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代而加以转化的化合物也包含在可通过本发明筛选方法获得的化合物中。
治疗和预防肺癌本发明提供治疗或预防NSCLC的组合物，所述组合物包含通过本发明筛选方法选择的任何化合物。
当将通过本发明方法分离的化合物作为人和其它哺乳动物的施用时，所述哺乳动物例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、羊、猪、牛、猴、狒狒、和猩猩，该分离的化合物可直接施用，或选择性地使用常规药物制备方法配制成剂量形式施用。例如，根据需要，所述药物可作为糖衣片剂、胶囊、酏剂和微胶囊口服，或者以与水或任何其它药学可接受的液体形成的灭菌溶液或悬浮液的注射液的形式非口服。例如，化合物可以通常接受的药物给予所需的单位剂型与药学可接受的载体或介质混合，特别是，无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等。这些制剂中活性成分的量制成在可获得的指定范围内的适当剂量。
可被混合形成片剂和胶囊的添加剂的例子包括，例如粘合剂，例如白明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂例如结晶纤维素；胀润剂例如玉米淀粉、白明胶和褐藻酸；润滑剂例如酒石酸镁；增甜剂例如蔗糖、乳糖或糖精；和调味剂例如薄荷、冬绿油(Gaultheria adenothrix oil)和樱桃。当单位剂型是胶囊时、液体载体例如油也可进一步包含于上述成分中。可使用例如用于注射的蒸馏水作为载体，依据正常药物实现方式配制注射用无菌复合物。
生理盐水、葡萄糖、和其它等渗溶液，包括佐剂例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，可用作注射用水溶液。这些可与适当的增溶剂结合使用，例如醇，特别是乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯80TM和HCO-50。
芝麻油和大豆油是适当的油性液体的例子，并可与苯甲酸苄酯或苯甲醇结合用作增溶剂。它们可进一步用缓冲液，例如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液；镇痛剂例如盐酸普鲁卡因；稳定剂例如苯甲醇或苯酚；和抗氧化剂配制。制成的注射液可装入适当的安瓿中。
可使用本领域技术人员已知的方法施用给患者本发明的药物组合物，例如，作为动脉内、静脉内或皮下注射液，并也可作为鼻内、经支气管的、肌内的或口服施用。剂量和施用方法可根据患者的体重和年龄以及选择的施用方法而变化；然而，本领域技术人员可以常规选择适当的施用方法和剂量。如果所述化合物可由DNA编码，那么该DNA可插入用于基因疗法的载体，且该载体可施用给患者以进行治疗。剂量和施用方法同样可根据患者的体重、年龄和症状进行改变；然而，本领域技术人员可适当地选择它们。
例如，尽管与URLC8结合并调节其活性的化合物的剂量取决于症状，当口服施用给一般的成年人时(体重60kg)，适当的剂量通常为每天约0.1mg-约100mg，优选地每天约1.0mg-约50mg，更优选地每天约1.0mg-约20mg。
当以注射液的形式肠胃外施用给一般成年人(体重60kg)时，尽管依据患者、靶器官、症状和施用方法存在一些差异，每天静脉内注射约0.01mg-约30mg的剂量是便利的，优选地每天约0.1-约20mg，更优选地每天约0.1-约10mg。同样，对于其它动物也是一样，可以换算为60kg体重的量施用。
本发明进一步提供了治疗受试者NSCLC的方法。对于处于患有病症的风险(或易感)、或患有病症的受试者，所述病症与异常的URLC8 t-RNA二氢尿苷合酶活性有关，所述施用可以是预防性或治疗性的。所述方法包括降低非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中URLC8的功能。所述功能可通过施用使用本发明筛选方法获得的化合物得到抑制。
同样，针对URLC8基因的siRNA可用于降低表达水平。本文中，术语“siRNA”是指防止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括以DNA为模板转录siRNA的技术。在本发明的上下文中，siRNA包含有义核酸序列和针对URLC8的反义核酸序列。本发明的siRNA方法可用于改变NSCLC基因上调的细胞中的表达，例如由于细胞的恶性转化产生的上调。靶细胞中siRNA与对应于URLC8的转录物结合导致细胞中蛋白质生产的减少。寡核苷酸的长度优选地至少10个核苷酸，并可与天然发生的转录物一样长。优选地，寡核苷酸的长度约19-25个核苷酸。更优选地，寡核苷酸长度少于75个，少于50个，或少于25个核苷酸。在A549和LC319细胞中抑制表达的URLC8 siRNA寡核苷酸的例子包括包含SEQ ID NO11的靶序列。
可构建本发明的siRNA，使得单个转录物具有靶基因的有义和互补反义序列，例如，作为发夹结构。
URLC8的siRNA与靶mRNA杂交，从而通过与正常单链mRNA转录物结合从而干扰翻译以及蛋白质的表达，来降低或抑制URLC8多肽的生产。为了增强siRNA的抑制活性，核苷酸“u”可添加到靶序列反义链的3’端。添加的“u”的数量至少2个，通常2-10个，优选地2-5个。添加的“u”在siRNA反义链的3’端形成单链。
URLC8的siRNA可以能够与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞。或者，也可在载体中携带编码siRNA的DNA。
例如可通过克隆URLC8基因靶序列进入表达载体生产载体，该表达载体具有可操作性连接的调节序列，该调节序列以允许双链表达(通过DNA分子的转录)的形式位于序列侧翼(Lee，N.S.，等，(2002)NatureBiotechnology 20500-505.)。与URLC8 mRNA反义的RNA分子通过第一启动子(例如位于克隆的DNA的3’的启动子序列)转录，对于URLC8基因mRNA而言是有义链的RNA分子通过第二启动子转录(例如克隆的DNA的5’的启动子序列)。有义和反义链体内杂交，以产生siRNA构建物，用来沉默URLC8基因。可选择地，这两个构建物可用于产生siRNA构建物的有义和反义链。克隆的URLC8基因可编码具有二级结构，例如发夹结构的构建物，所述发夹结构中单个转录物具有来自靶基因的有义和互补反义序列。
为了形成发夹环结构，由任意核苷酸序列组成的环序列可定位于有义和反义序列之间。因此，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]为核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列对应于选自由SEQ IDNO11的核苷酸组成的组的序列；[B]为由3至23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；和[A’]为核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列由[A]的互补序列组成。区域[A]与[A’]杂交，然后形成由区域[B]组成的环。环序列的长度优选地可为3-23个核苷酸。所述环序列，例如可选自由下列序列组成的组(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb 506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque，J.M.，等，(2002)Nature 418435-438.)。
CCC，CCACC或CCACACCJacque，J.M，等，(2002)Nature 418435-438。
UUCGLee，N.S.，等，(2002)Nature Biotechnology 20500-505.Fruscoloni，P.，等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1001639-1644。
UUCAAGAGADykxhoorn，D.M.，(2003)Nature Reviews MolecularCell Biology 4457-467。
下文显示了具有本发明发夹环结构的优选siRNA的例子。在下面的结构中，环序列可选自由CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA组成的组。优选的环序列是UUCAAGAGA(DNA中为“ttcaagaga”)。适用于本发明上下文的示例性发夹结构siRNA包括ugaggugcucagcacagug-[b]-cacugugcugagcaccuca(对于SEQ ID NO10的靶序列)guuggcacagccuguguau-[b]-auacacaggcugugccaac(对于SEQ ID NO11的靶序列)位于URLC8基因侧翼的调节序列可以是相同的或不同的，从而它们的表达可以时间或空间方式独立调节。siRNA通过克隆URLC8基因模板进入载体而胞内转录，所述载体包含例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单元或人H1 RNA启动子。为了将载体导入细胞，可使用转染增强剂。FuGENE(Roche诊断)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(Wako pure Chemical)作为转染增强剂是有用的。
本发明的siRNA抑制本发明多肽的表达，因此对于抑制本发明多肽的生物学活性是有用的。同样，包含本发明siRNA的表达抑制剂是有用的，因为它们能抑制本发明多肽的生物学活性。从而，包含本发明反义寡核苷酸例如siRNA的组合物，在治疗NSCLC中是有用的。
因此，本发明提供治疗或预防非小细胞肺癌(NSCLC)的组合物，所述组合物包含针对URLC8基因的药学有效量的小干扰RNA(siRNA)，其中所述小干扰RNA包含核苷酸序列5’-TGAGGTGCTCAGCACAGTG-3’(SEQ ID NO.10)和5’-GTTGGCACAGCCTGTGTAT-3’(SEQ ID NO.11)作为靶序列。可选择地，本发明进一步提供治疗或预防NSCLC的方法，所述方法包括施用药学有效量的小干扰RNA的步骤。
患有特征为URLC8过量表达的肿瘤的患者可通过施用URLC8-siRNA进行治疗。使用siRNA疗法以抑制患者中URLC8的表达，所述患者患有非小细胞肺癌或有发生非小细胞肺癌(NSCLC)风险。这种患者通过该具体肿瘤类型的标准方法鉴定；例如，非小细胞肺癌(NSCLC)典型地通过X射线断层术、超声波或活组织检查诊断。
如果治疗产生临床效益那么治疗是有效的，所述临床效益例如受试者中URLC8的表达减少，或者肿瘤的大小、患病率或转移潜能下降。当预防性地应用治疗时，“有效的”是指治疗阻碍或防止肿瘤的形成，或者预防或减轻了肿瘤的临床症状。效能可结合诊断或治疗具体肿瘤类型的任何已知方法确定。通过使用标准载体和/或基因递送系统向患者施用siRNA进行siRNA疗法。适当的基因递送系统可包括脂质体、受体介导的递送系统和病毒载体，例如疱疹病毒、反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒等等。URLC8生产的减少导致URLC8蛋白表达的降低。治疗性核酸组合物优选地与药用载体共同配制。治疗性组合物还可包含上文描述的基因递送系统。药用载体是适合于施用给动物的生物学上相容的载体，例如生理盐水。化合物的治疗有效量是指能够产生医学上所想要的结果的量，所述结果例如URLC8基因产物的生产减少，细胞生长例如增殖降低，或在受治疗的动物中肿瘤生长降低。
肠胃外施用，例如静脉内、皮下、肌内和腹膜内递送途径，可用于递送URLC8-siRNA组合物。
用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者身材、体表面积、年龄、要施用的具体核酸、性别、施用的时间和途径、总体健康状况、以及同时施用的其它药物。静脉内施用核酸的适当剂量的范围为大致106-1022拷贝的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可通过标准方法施用，例如通过注入例如肌肉或皮肤等组织的胞间隙，导入循环或体腔，或通过吸入或吹入。多核苷酸优选地与药用液体载体组合以注射或以其它方式递送给动物，这种液体载体例如水性或部分水性的液体载体。本发明的多核苷酸还可与脂质体结合(例如阳离子或阴离子脂质体)。本发明的多核苷酸优选地包括靶细胞表达所需的遗传信息，例如启动子。
另一方面，本发明包括药学或治疗性组合物，所述组合物包含本文描述的一种或多种治疗学化合物。药学制剂可包括那些适合于口腔、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道或肠胃外(包括肌内、皮下和静脉内)施用的制剂，或适合于通过吸入或吹入施用的制剂。适当时，所述制剂可以分散的剂量单位方便地存在，并可通过药学领域中任何常规的方法制备。所有这种药学方法包括如下步骤根据需要将活性化合物与液体载体或精细分开的固体载体或二者结合，然后如果需要，将产物制成所需制剂的形状。
适合于口服的药物制剂可作为分散单位方便地存在，例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，每种包含预定量的活性成分；作为粉剂或粒剂；或作为溶液、悬浮液或作为乳剂。活性成分还可作为丸剂、药糖剂、或糊剂存在，并为纯净的形式，即不含载体。用于口服的片剂和胶囊剂可包含常规的赋形剂如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可通过任选地与一种或多种配制组分压缩或制模而制备。可通过将自由流动形式的活性成分如粉剂或粒剂在合适的机器中压缩，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑的、表面活性的或分散剂混合而以制备压制片。模制片可通过将用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物在合适的机器中制模而制备。片剂可依据本领域熟知的方法包衣。口服液体制剂可以是例如，水性或油性的悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂形式，或可作为干产物存在，用来在使用前用水或其它合适的载体构成。所述液体制剂可包含常规的添加剂如悬浮剂、乳化剂、非水载体(它可包括食用油)或防腐剂。此外，可任选地配制片剂以提供其中活性成分缓慢或受控制的释放。
用于肠胃外给药的剂型包括水性的和非水的无菌注射溶液，它可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得该制剂与所欲受体的血液等渗的溶质；和水性的和非水的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和稠化剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以冷冻干燥(冻干)的状况保存，使用之前仅需马上添加无菌的液体载体，例如盐水、注射用水。或者，制剂可以用于连续输液的形式存在。可从之前所述的无菌粉剂、粒剂和片剂类型制备临时的注射溶液和悬浮液。
用于直肠施用的制剂可作为具有常规载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂提呈。在口中，例如在颊部或舌下局部施用的制剂包括糖锭，其包含调味基质如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的活性成分，以及包含在例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶等基质中的活性成分的锭剂。对于鼻内施用，本发明的化合物可采用液体喷雾剂或可分散性粉剂或滴剂的形式。滴剂可用还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的水性的或非水的基质配制。液体喷雾剂从加压包装中方便地递送。
对于通过吸入施用，本发明的化合物通过吹入器、喷雾器、加压包装或其它方便的喷雾剂递送手段方便地递送。加压包装可包括合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾的情况下，可通过提供阀以递送计量的量，来确定剂量单位。
或者，对于通过吸入或吹入施用，本发明的化合物可采取干粉组合物的形式，例如化合物和合适的粉剂基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以单位剂型存在，例如以胶囊剂、药筒、凝胶或薄膜包装的形式。其中粉末可借助于吸入器或吹入器施用。
当需要时，可采用被改造来提供活性成分的持续释放的上述制剂。本发明的药物组合物还可包含其它的活性成分，如抗菌剂、免疫抑制剂或防腐剂。
应当理解，除上文特别描述的成分外，考虑到制剂的类型，本发明的制剂还可包括本领域中常规的其它试剂，例如适于口服的那些制剂可包含调味剂。
优选的单位剂量制剂是那些包含下文所述的有效剂量或其适当级分的活性成分的制剂。
对于上述各种情况，可以每天约0.1至约250mg/kg的剂量范围口服或通过注射施用组合物。用于成人的剂量范围通常为约5mg至约17.5g/天，优选约5mg至约10g/天，并且最优选约100mg至约3g/天。以分散单位提供的片剂或其它单位剂型可方便地包含在这种剂量下或多个剂量时有效的量，例如包含约5mg至约500mg，通常约100mg至约500mg的单位。
药物组合物优选地口服或通过注射施用(静脉内或皮下)，施用给受试者的精确的量是主治医生的职责。然而，采用的剂量将取决于多种因素，包括受试者的年龄和性别，治疗的确切病症及其严重性。此外，给药途径可依据病症及其严重性而改变。
实施例实施例1材料和方法(a)肺癌细胞系和组织样品本研究中使用的19种人NSCLC和4种SCLC细胞系如下肺ADCA427、A549、LC319、PC3、PC9、PC14和NCI-H1373；支气管肺泡细胞癌(bronchioloalveolar cell carcinomas)(BAC)NCI-H1666和NCI-H1781；肺腺鳞癌(ASC)NCI-H226和NCI-H647；肺SCC RERF-LC-AI、SK-MES-1、EBC-1、LU61、NCI-H520、NCI-H1703和NCI-H2170；肺大细胞癌(LCC)LX1；和SCLC DMS114、DMS273、SBC-3和SBC-5。所有细胞在添加了10％的胎牛血清(FCS)的适当培养基中单层生长，并在37℃维持在具有5％CO2的潮湿空气中。人小气道上皮细胞，SAEC，在购自Cambrex BioScience Inc的优化的培养基(SAGM)中生长(Walkersville，MD)。
原发NSCLC样品最初从37名患者经书面告知同意获得以用于其它文献中所述的研究(Kikuchi，T.等，(2003)Oncogene 22，2192-2205)，样品中22个归为ADC，14个归为SCC以及1个归为ASC。具有十四个额外的原发NSCLC的独立组，包括七个ADC和七个SCC，与相邻的正常肺组织样品一起从进行手术的患者获得。
用于在组织微阵列上免疫染色以及额外的统计学分析的总共292个NSCLC和接近正常的肺组织样品也从进行手术的患者获得。
(b)半-定量RT-PCR分析根据制造商的方案利用Trizol试剂(Life Technologies，Inc.)从培养的细胞和临床组织提取总RNA。提取的RNA和正常人组织聚(A)RNA用DNase I(Nippon Gene)处理并且利用寡(dT)引物和SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)反转录。半定量RT-PCR实验用下列合成的基因特异性引物或用ACTB特异性引物作为内部对照进行
(c)IMS-E21(URLC8)使用下列引物分离IMS-E21(URLC8)5’-GACCACATCCAACAGTATTCG-3’(SEQ ID NO.3)和5’-TGCCAGGACATCTAACTTCTG-3’(SEQ ID NO.4)；ACTB，5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’(SEQ ID NO.5)和5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’(SEQ ID NO.6).
优化PCR反应的循环数以确保扩增对数期内的产物强度。
(d)Northern-印迹分析人多组织印迹(BD Biosciences Clontech)与32P标记的IMS-E21(URLC8)的PCR产物杂交。IMS-E21(URLC8)的cDNA探针通过使用与上文所述相同的引物的RT-PCR制备。根据供应商的推荐进行预杂交、杂交和洗涤。印迹用增强型BAS屏(BIO-RAD)在室温下(RT)放射自显影30小时。
(e)克隆全长IMS-E21(URLC8)cDNA和DNA测序首先，使用BLAST程序针对EST数据库检索IMS-E21(URLC8)序列，发现与EST克隆(FLJ20399，NM_017803)高度同源。根据生产商的说明使用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)通过随机引发(randompriming)从衍生自12个正常器官混合样品的总RNA生产cDNA。将RT-PCR产物克隆入pcDNA3.1-myc-His载体(Invitrogen)并通过测序证实。
(f)抗-IMS-E21(URLC8)抗体的产生表达IMS-E21(URLC8)(全长)的质粒使用pET28载体(Novagen，Madison，WI)制备，所述质粒在单个蛋白的NH2末端包含His标签的表位。重组蛋白质在大肠杆菌BL21 codon-plus株(Stratagene，LaJolla，CA)中表达，并根据供应商的方案利用TALON树脂(BD Biosciences)纯化。将在SDS-PAGE凝胶中提取的蛋白质接种兔，并根据标准方法在亲和柱上纯化免疫血清。亲和纯化的抗IMS-E21(URLC8)抗体用于western印迹分析、免疫沉淀和免疫染色。
(g)IMS-E21(URLC8)相关蛋白的共免疫沉淀和MALDI-TOF-MS作图肺癌细胞系LC319用表达N末端FLAG标签的和C末端HA标签的pCAGGS-IMS-E21(URLC8)载体或模拟载体(对照)的质粒转染，对转染后的肺癌细胞系LC319的细胞提取物进行预清洗，所述预清洗通过在蛋白酶存在的情况下用终体积为2ml的IP缓冲液(0.5％NP-40，50mMTris-HCl，150mM NaCl)中含有的100μL的蛋白质G-琼脂糖珠在4℃下孵育1小时而进行。4℃时以1000rpm离心5分钟后，上清液用抗-Flag M2琼脂糖4℃孵育2小时。然后通过以5000rpm离心2分钟收集珠并用1ml的各个免疫沉淀缓冲液洗涤六次。然后，洗涤过的珠用Flag-肽洗脱(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)。洗脱液在4℃下用抗-HA琼脂糖孵育2小时。洗涤过的珠在50μL的Laemmli样品缓冲液中重悬浮，并煮沸5分钟，使用5-10％ SDS PAGE凝胶(BIO RAD)分离蛋白质。电泳后，凝胶用银染染色。将特异性发现于IMS-E21(URLC8)转染的提取物中的蛋白条带切下，并用于基质辅助的激光解吸/离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析(AXIMA-CFR和SHIMADZU BIOTECH，Kyoto，Japan)。
(h)RNA干扰测定预先建立以载体为基础的RNA干扰(RNAi)系统，psiH1BX3.0，以指导哺乳动物细胞中siRNA的合成(Suzuki，C.等(2003)Cancer Res，637038-7041.)。本文中，使用30μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen)，将10μg的siRNA表达载体转染入NSCLC细胞系A549和LC319，两细胞系均内源性过表达IMS-E21(URLC8)。超过80％的转染的细胞表达合成的siRNA，并且在那些细胞中IMS-E21(URLC8)基因的内源性表达被有效抑制。在适当浓度的遗传霉素(G418)存在的情况下将转染细胞培养七天，之后使用Giemsa染色和三重MTT分析测定细胞数量和存活力。用于RNAi的合成的寡核苷酸的靶序列如下对照1(EGFP增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因，维多利亚水母(AequoreaVictoria)GFP的突变体)，5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ.ID.NO.7)；
对照2(荧光素酶北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因)，5’-CGTACGCGGAAIACTTCGA-3’(SEQ.ID.NO.8)；对照3(乱序(Scramble)编码5S和16S rRNA的叶绿体小眼虫(Euglenagracilis)基因)，5’-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3’(SEQ.ID.NO.9)；siRNA-IMS-E21-#2(si-IMS-E21-#2)，5’-TGAGGTGCTCAGCACAGTG-3’(SEQ ID NO.10)；siRNA-IMS-E21-#3(si-IMS-E21-#3)，5’-GTTGGCACAGCCTGTGTAT-3’(SEQ ID NO.11).siRNA表达载体的插入序列如下对照1(EGFP)；5’-TCCCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO.12)；5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO.13)；对照2(荧光素酶)；5’-TCCCCGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTACG-3’(SEQ ID NO.15)；5’-AAAACGIACGCGGAATACTTCGATCTCTTGAAATCGAAGTATTCCGCGTACG-3’(SEQ ID NO.16)；对照3(乱序)；5’-TCCCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC-3’(SEQ ID NO.18)；5’-AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCGC-3’(SEQ ID NO.19)；siRNA-IMS-E21-#2(si-IMS-E21-#2)；
5’-TCCCTGAGGTGCTCAGCACAGTGTTCAAGAGACACTGTGCTGAGCACCTCA-3’(SEQ ID NO.21)；5’-AAAATGAGGTGCTCAGCACAGTGTCTCTTGAACACTGTGCTGAGCACCTCA-3’(SEQ ID NO.22)；siRNA-IMS-E21-#3(si-IMS-E21-#3)；5’-TCCCGTTGGCACAGCCTGTGTATTCAAGAGAATACACAGGCTGTGCCAAC-3’(SEQ ID NO.24)；5’-AAAAGTTGGCACAGCCTGTGTATCTCTTGAAATACACAGGCTGTGCCAAC-3’(SEQ ID NO.25)；(i)免疫组织化学和组织微阵列分析使用福尔马林固定的NSCLC如其它地方所公开的构建肿瘤组织微阵列。用于取样的组织区域基于与玻片上相应HE染色的切片的目测对齐进行挑选。使用组织微阵列仪(Beecher Instruments，Sun Prairie，WI)将取自供体肿瘤块的3个、4个或5个组织核心(直径0.6mm；高3-4mm)放入用于接受组织核心的石蜡块中。从每个病例穿孔取出正常组织核心。获得的微阵列块的5-μm切片用于免疫组织化学分析。半定量评估IMS-E21(URLC8)阳性，记录染色强度为无(记分为0)、弱(记分为1+)或强阳性(记分为2+)，评估由对以前的临床跟踪数据一无所知的三个独立研究人员进行。只有当研究人员独立地认定某个病例为阳性时，那么才接受这个病例为阳性。
为了研究IMS-E21(URLC8)蛋白在临床组织样品中的存在，切片使用ENVISION+Kit/HRP(DakoCytomation)染色。封闭内源性过氧化物酶和蛋白质后，添加亲和纯化的抗IMS-E21(URLC8)抗体，切片与HRP标记的抗兔IgG作为第二抗体共同孵育。加入底物色原，样品用苏木精复染。
实施例2IMS-E21(URLC8)基因的克隆及其在肺部肿瘤、细胞系和正常组织中的表达为了获得开发NSCLC的治疗剂和/或诊断标记物的新的靶分子，筛选了基因，该基因在通过cDNA微阵列(Kikuchi，等，(2003)Oncogene，222192-2205)分析的37例NSCLC中超过50％的病例中显示表达高5倍。在筛选的23,040个基因中，一个EST转录物(FLJ20399，NM_017803)被鉴定为在NSCLC中常常过量表达；通过半定量RT-PCR试验证实其在八个代表性病例中过量表达。为了获得该转录物的全长克隆，用最初通过cDNA微阵列试验分离的cDNA片段筛选FASTA数据库，并鉴定出几个EST。装配这些克隆的DNA序列，测定了该基因的完全编码核苷酸序列。cDNA由2,020个核苷酸组成，包括编码493个氨基酸的肽的1,479个核苷酸的可读框。使用FASTA程序的同源性搜索，揭示了该预测蛋白与属于tRNA-二氢尿苷合酶(DUS)家族的蛋白同源，特别是酿酒酵母Dus1(二氢尿苷合酶1)，它催化tRNA上尿苷残基的5，6-双键的还原(氨基酸分别有30％同一，图1，a-c)。因此，该基因暂时定名为IMS-E21(也称作URLC8up-regulatedin lung cancer 8(在肺癌8中上调)，登录号AB101210)。使用SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)(Letunic I，等，(2004)Nucleic Acids Res.；32(Database issue)D142-4；Schultz J，等，(1998)Proc Natl Acad Sci U SA.；955857-64.)在IMS-E21(URLC8)序列中鉴定两个基序；分别为N-末端Dus域和C-末端DSRM(图1，a)。人IMS-E21(URLC8)显示与鼠(小鼠(M.musculus)和大鼠(R.Norvegicus))产物的氨基酸具有90％的同一性，与果蝇(D.melanogaster)的蛋白具有48％的同一性，与C.elegans的蛋白具有40％的同一性(图1，b)。
在14个额外的NSCLC病例中的11个(7个腺癌(ADC)中的4个；7个鳞状细胞癌(SCC)中的7个)中进一步证实IMS-E21(URLC8)表达的提高(图2，a)，并且在所检测的23个NSCLC和小细胞肺癌(SCLC)细胞系中的21个中记录到IMS-E21(URLC8)的上调，但是在源自正常的支气管上皮的SAEC细胞中没有发现表达(图2，b)。
用IMS-E21(URLC8)cDNA作为探针进行Northern印迹，在检测的23种正常人组织中，主要在睾丸中，鉴定出2.4-kb的转录物条带(图2，c)。
实施例3IMS-E21(URLC8)蛋白的过量表达与SCC的较差结局有关用亲和纯化的抗-IMS-E21(URLC8)多克隆抗体在可获得的292个NSCLC的组织微阵列中进行免疫组织化学分析。研究显示细胞质中显示IMS-E21(URLC8)阳性染色的病例数量是292个NSCLC总病例中的254个(87％)；分别为158个ADC病例中的132个(84％)，99个SCC病例中的89个(90％)，21个LCC病例中的19个(90％)，10个BAC病例中的10(100％)和4个ASC病例中的4个(100％)。所有这些肿瘤是外科可切除的NSCLC，且在它们的任何相邻正常肺部组织中没有观察到染色(图3，a)。在组织阵列上将IMS-E21(URLC8)的表达模式分类，从无/弱(记分为0～1+)到强(记分为2+)。然后测定IMS-E21(URLC8)表达与临床结局的关系。统计分析揭示在检测的肺癌患者中任何水平的IMS-E21(URLC8)表达与pT或pN因子不具有显著的相关性。然而，使用Kaplan-Meier方法发现SCC中IMS-E21(URLC8)的表达与肿瘤特异性5年存活显著相关(通过Log-rank检验P＝0.0091)(Fig.3，b)。通过单变量分析，pT、pN、性别和IMS-E21(URLC8)表达(P＝0.0111)每个都与在SCC患者中的不良的肿瘤特异性存活率显著相关。此外，通过使用SCC患者Cox比例危险模型(Cox proportional hazard model)的多变量分析，确定IMS-E21(URLC8)染色是独立的预后因素(P＝0.0234)。
实施例4通过针对IMS-E21(URLC8)的特异性siRNA抑制NSCLC的生长为了评估IMS-E21(URLC8)对于肺癌细胞的生长或存活是否是必需的，设计和构建表达针对IMS-E21(URLC8)的siRNA((si-IMS-E21)的质粒和对照质粒(EGFP、乱序和荧光素酶的siRNAs)，并将它们转染到A549和LC319细胞中，以抑制内源IMS-E21(URLC8)的表达。用si-IMS-E21-#2和-#3转染的细胞中IMS-E21(URLC8)转录物的量和蛋白质水平与用对照转染的细胞相比显著下降(图3，c，左图)；si-IMS-E21-#2和-#3的转染还导致集落形成测定中的集落数量(图3，c，下图)和通过MTT细胞成活力分析中测定的集落数量(图3，c，右图)的明显下降。
实施例5IMS-E21(URLC8)主要定位于细胞质和与ER-高丰度蛋白PDI共定位为了测定内源性IMS-E21(URLC8)在肺癌细胞中的亚细胞定位，使用亲和纯化的抗-IMS-E21(URLC8)多克隆抗体进行免疫细胞化学分析。共聚焦显微镜术揭示IMS-E21(URLC8)蛋白在A549细胞的细胞质中的分布(数据未显示)。为了进一步研究IMS-E21(URLC8)蛋白的亚细胞定位，我们用在人IMS-E21(URLC8)蛋白的C-末端包含c-myc-His表位序列(LDEESILKQE-HHHHHH)的质粒转染LC319细胞。使用抗-c-myc抗体和抗内源性蛋白质二硫键异构酶(Protein Disulfide Isomerase)(PDI)抗体共免疫染色，其中内源性蛋白质二硫键异构酶在内质网(ER)中被丰富表达，提示IMS-E21(URLC8)蛋白主要分布于ER(图4，a)。
实施例6将EPRS鉴定为与IMS-E21(URLC8)相互作用的蛋白质为了阐明IMS-E21(URLC8)在肺癌细胞中的功能，鉴定与IMS-E21(URLC8)相互作用的一种或多种蛋白质。提取用N-末端FLAG标签的和C-末端HA标签的pCAGGS-IMS-E21载体或模拟载体(对照)转染的LC319细胞的溶胞产物，并用抗-FLAG M2单克隆抗体免疫沉淀，随后用抗-HA单克隆抗体免疫沉淀。包含IMS-E21(URLC8)的蛋白复合物在SDS-PAGE凝胶上用SilverQuest(Invitrogen)染色。提取180-kDa的条带，该条带在用IMS-E21(URLC8)表达质粒转染的细胞溶胞产物的免疫沉淀物中可见，但在那些用模拟质粒转染的细胞溶胞产物中未见，并通过MALDI-TOF质谱测序确定为EPRS(谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶)(数据未显示)。内源IMS-E21(URLC8)和EPRS之间的相互作用通过共免疫沉淀和免疫细胞化学证实(图4，b和c)，表明在ER依赖性翻译中IMS-E21(URLC8)-氨酰tRNA合成酶复合物存在的可能性。
实施例7肺癌细胞中IMS-E21(URLC8)的tRNA-DUS活性为了检验IMS-E21(URLC8)编码二氢尿苷合酶家族这一假设，研究由siRNA对IMS-E21(URLC8)基因的抑制对NSCLC细胞系中DUS活性的作用。通过HPLC技术从用siRNA构建物转染的A549和LC319细胞的总RNA中纯化总tRNA，并分析样品中各个细胞系的二氢尿苷含量(Jacobson，M和Hedgcoth，C(1970)Anal Biochem，34459-469Hunninghake，D和Grisolia，S(1966)Anal Biochem，16200-205)。能够如上述抑制IMS-E21(URLC8)的转录物水平的最有效的IMS-E21(URLC8)siRNA构建物(si-IMS-E21-#2)，当与其相应的对照siRNA构建物(si-EGFP)比较时，还导致tRNA-二氢尿苷含量水平的下降(图4，d)。在这些肿瘤细胞中由si-IMS-E21-#2诱导的tRNA-二氢尿苷的缺乏与肿瘤的生长抑制密切相关(图3，c)，表明IMS-E21(URLC8)的tRNA-DUS活性对于肿瘤细胞的存活和/或进展是不可缺少的。
工业实用性本发明人显示URLC8具有t-RNA二氢尿苷合酶活性，并且该活性的抑制导致肺癌细胞的细胞增殖的抑制。因此，发现抑制URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性的物质作为治疗肺癌例如NSCLC的抗癌物质的治疗性效用。
另外，用针对URLC8的siRNA处理NSCLC细胞抑制它的表达和tRNA-DUS活性，并抑制癌细胞的生长。附加的试验揭示在NSCLC细胞中URLC8蛋白与EPRS(谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶)物理上相互作用。这些数据表明URLC8功能的上调和tRNA-DUS活性的提高是肺癌发生的共同特征。因此，URLC8酶活的选择性抑制和/或URLC8-tRNA合成酶复合物的形成可能是治疗肺癌患者的有希望的治疗策略。
另外，肺癌可使用URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性作为诊断指标进行检测。
此外，本发明人揭示了高水平的URLC8(IMS-E21)表达与患有肺鳞状细胞癌(SCC)的患者的不良预后显著相关。因此，肺癌的预后可通过测定URLC8(IMS-E21)的表达水平预测。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物都被全文引入作为参考。此外，虽然本发明结合其具体的实施方案进行了详细描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是可进行各种改变和改进而不背离本发明的精神和范围。
序列表<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)国立大学法人 东京大学(THE UNIVERSITY OF TOKYO)<120>通过URLC8的tRNA-二氢尿苷合酶活性诊断非小细胞肺癌的方法<130>ONC-A0411P<150>US 60/612,937<151>2004-09-24<160>26<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2020<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(171)..(1652)<400>1gctcagtacg gtgtgtggag ctggagcacc gtgaggaaga agcgaggttc tttttaagag60ttcagctgcg agatatcaaa caaagaatta ctctgtacaa agccagaaca catatatcaa120agtaatcctg aagtatcaga acaaaataat aggctgtaac agaggaggaa atg att 176Met Ile1ttg aat agc ctc tct ctg tgt tac cat aat aag cta atc ctg gcc cca 224Leu Asn Ser Leu Ser Leu Cys Tyr His Asn Lys Leu Ile Leu Ala Pro5 10 15atg gtt cgg gta ggg act ctt cca atg agg ctg ctg gcc ctg gat tat 272Met Val Arg Val Gly Thr Leu Pro Met Arg Leu Leu Ala Leu Asp Tyr20 25 30gga gcg gac att gtt tac tgt gag gag ctg atc gac ctc aag atg att 320Gly Ala Asp Ile Val Tyr Cys Glu Glu Leu Ile Asp Leu Lys Met Ile35 40 45 50
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Ala Pro Met Val Arg Val Gly Thr Leu Pro Met Arg Leu Leu Ala Leu20 25 30Asp Tyr Gly Ala Asp Ile Val Tyr Cys Glu Glu Leu Ile Asp Leu Lys35 40 45Met Ile Gln Cys Lys Arg Val Val Asn Glu Val Leu Ser Thr Val Asp50 55 60Phe Val Ala Pro Asp Asp Arg Val Val Phe Arg Thr Cys Glu Arg Glu65 70 75 80Gln Asn Arg Val Val Phe Gln Met Gly Thr Ser Asp Ala Glu Arg Ala85 90 95Leu Ala Val Ala Arg Leu Val Glu Asn Asp Val Ala Gly Ile Asp Val100 105 110Asn Met Gly Cys Pro Lys Gln Tyr Ser Thr Lys Gly Gly Met Gly Ala115 120 125Ala Leu Leu Ser Asp Pro Asp Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ser Thr Leu130 135 140Val Lys Gly Thr Arg Arg Pro Val Thr Cys Lys Ile Arg Ile Leu Pro145 150 155 160Ser Leu Glu Asp Thr Leu Ser Leu Val Lys Arg Ile Glu Arg Thr Gly165 170 175Ile Ala Ala Ile Ala Val His Gly Arg Lys Arg Glu Glu Arg Pro Gln180 185 190His Pro Val Ser Cys Glu Val Ile Lys Ala Ile Ala Asp Thr Leu Ser195 200 205Ile Pro Val Ile Ala Asn Gly Gly Ser His Asp His Ile Gln Gln Tyr210 215 220Ser Asp Ile Glu Asp Phe Arg Gln Ala Thr Ala Ala Ser Ser Val Met225 230 235 240Val Ala Arg Ala Ala Met Trp Asn Pro Ser Ile Phe Leu Lys Glu Gly245 250 255
Leu Arg Pro Leu Glu Glu Val Met Gln Lys Tyr Ile Arg Tyr Ala Val260 265 270Gln Tyr Asp Asn His Tyr Thr Asn Thr Lys Tyr Cys Leu Cys Gln Met275 280 285Leu Arg Glu Gln Leu Glu Ser Pro Gln Gly Arg Leu Leu His Ala Ala290 295 300Gln Ser Ser Arg Glu Ile Cys Glu Ala Phe Gly Leu Gly Ala Phe Tyr305 310 315 320Glu Glu Thr Thr Gln Glu Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Ser Ala325 330 335Lys Thr Ser Glu Gln Thr Gly Glu Pro Ala Glu Asp Thr Ser Gly Val340 345 350Ile Lys Met Ala Val Lys Phe Asp Arg Arg Ala Tyr Pro Ala Gln Ile355 360 365Thr Pro Lys Met Cys Leu Leu Glu Trp Cys Arg Arg Glu Lys Leu Ala370 375 380Gln Pro Val Tyr Glu Thr Val Gln Arg Pro Leu Asp Arg Leu Phe Ser385 390 395 400Ser Ile Val Thr Val Ala Glu Gln Lys Tyr Gln Ser Thr Leu Trp Asp405 410 415Lys Ser Lys Lys Leu Ala Glu Gln Ala Ala Ala Ile Val Cys Leu Arg420 425 430Ser Gln Gly Leu Pro Glu Gly Arg Leu Gly Glu Glu Ser Pro Ser Leu435 440 445His Lys Arg Lys Arg Glu Ala Pro Asp Gln Asp Pro Gly Gly Pro Arg450 455 460Ala Gln Glu Leu Ala Gln Pro Gly Asp Leu Cys Lys Lys Pro Phe Val465 470 475 480Ala Leu Gly Ser Gly Glu Glu Ser Pro Leu Glu Gly Trp485 490
<210>3<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的RT-PCR引物序列<400>3gaccacatcc aacagtattc g21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的RT-PCR引物序列<400>4tgccaggaca tctaacttct g21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的RT-PCR引物序列<400>5gaggtgatag cattgctttc g21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的RT-PCR引物序列<400>6caagtcagtg tacaggtaag c21
<210>7<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA靶序列<400>7gaagcagcac gacttcttc 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA靶序列<400>8cgtacgcgga atacttcga 19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA靶序列<400>9gcgcgctttg taggattcg 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA靶序列<400>10tgaggtgctc agcacagtg 19
<210>11<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA靶序列<400>11gttggcacag cctgtgtat 19<210>12<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>12tcccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51<210>13<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>13aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c 51<210>14<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA发夹序列<400>14gaagcagcac gacttcttct tcaagagaga agaagtcgtg ctgcttc47<210>15
<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>15tccccgtacg cggaatactt cgattcaaga gatcgaagta ttccgcgtac g 51<210>16<211>52<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>16aaaacgtacg cggaatactt cgatctcttg aaatcgaagt attccgcgta cg 52<210>17<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA发夹序列<400>17cgtacgcgga atacttcgat tcaagagatc gaagtattcc gcgtacg47<210>18<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>18tcccgcgcgc tttgtaggat tcgttcaaga gacgaatcct acaaagcgcg c 51<210>19<211>51
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>19aaaagcgcgc tttgtaggat tcgtctcttg aacgaatcct acaaagcgcg c 51<210>20<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA发夹序列<400>20gcgcgctttg taggattcgt tcaagagacg aatcctacaa agcgcgc47<210>21<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>21tccctgaggt gctcagcaca gtgttcaaga gacactgtgc tgagcacctc a 51<210>22<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>22aaaatgaggt gctcagcaca gtgtctcttg aacactgtgc tgagcacctc a 51<210>23<211>47<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA发夹序列<400>23tgaggtgctc agcacagtgt tcaagagaca ctgtgctgag cacctca47<210>24<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>24tcccgttggc acagcctgtg tattcaagag aatacacagg ctgtgccaac 50<210>25<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA寡核苷酸序列<400>25aaaagttggc acagcctgtg tatctcttga aatacacagg ctgtgccaac 50<210>26<211>46<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA发夹序列<400>26gttggcacag cctgtgtatt caagagaata cacaggctgt gccaac 4权利要求
1.一种预测肺鳞状细胞癌(SCC)预后的方法，其中所述方法包括如下步骤a.检测从受试者收集的样品中URLC8的表达水平，所述受试者的SCC预后将被预测，和b.当与对照水平比较时，检测到URLC8表达水平提高表明预后不良。
2.权利要求1所述的方法，其中所述表达水平通过选自下组的任一方法检测(a)检测编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的mRNA，(b)检测包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质，和(c)检测包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质的生物学活性。
3.权利要求2所述的方法，其中所述(c)的生物学活性是t-RNA二氢尿苷合酶活性。
4.一种预测肺鳞状细胞癌(SCC)预后的试剂盒，其中所述试剂盒包含选自下组的任何一种成分(a)用于检测编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的mRNA的试剂，(b)用于检测包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质的试剂，和(c)用于检测包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质的生物学活性的试剂。
5.一种在受试者中诊断非小细胞肺癌或者发生非小细胞肺癌素因的方法，所述方法包括测定从受试者获得的生物学样品中t-RNA二氢尿苷合酶活性和/或t-RNA二氢尿苷合酶的水平的步骤，其中与正常对照水平相比，所述水平的提高表明所述受试者患有或处于发生非小细胞肺癌的风险中。
6.一种预测肺鳞状细胞癌(SCC)预后的试剂盒，其中所述试剂盒包含检测URLC8的t-RNA二氢尿苷合酶活性和/或t-RNA二氢尿苷的试剂。
7.一种测定多肽的t-RNA二氢尿苷合酶活性的方法，所述方法包括如下步骤a.在适合于t-RNA二氢尿苷合成的条件下孵育多肽，所述多肽选自i.包含SEQ ID NO2(URLC8)的氨基酸序列的多肽；ii.包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入，条件为所述多肽具有等同于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性；iii.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，条件为所述多肽具有等同于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性。b.检测t-RNA二氢尿苷合成水平；和c.通过将在步骤(b)中检测的t-RNA二氢尿苷合成水平与t-RNA二氢尿苷合酶活性相联系，测量t-RNA二氢尿苷合酶活性。
8.权利要求7所述的方法，其中所述条件包括培养表达所述多肽的细胞。
9.权利要求8所述的方法，其中所述细胞是携带表达载体的转化体细胞，所述表达载体含有编码所述多肽的多核苷酸。
10.一种鉴定调节t-RNA二氢尿苷合酶活性的物质的方法，所述方法包括如下步骤a.在受试化合物存在的情况下，在适合于t-RNA二氢尿苷合成的条件下孵育选自下组的多肽i.包含SEQ ID NO2(URLC8)的氨基酸序列的多肽；ii.包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入，条件为所述多肽具有等同于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性；iii.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，条件为所述多肽具有等同于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性。b.检测t-RNA二氢尿苷合成水平；和c.将t-RNA二氢尿苷合成水平与对照水平相比较，其中与所述对照水平相比t-RNA二氢尿苷合成水平的提高或降低表明所述受试化合物调节t-RNA二氢尿苷合酶活性。
11.一种筛选治疗和/或预防非小细胞肺癌(NSCLC)的化合物的方法，所述方法包括如下步骤a.通过权利要求10所述的方法鉴定调节t-RNA二氢尿苷合酶活性的化合物，和b.选择与对照水平相比降低t-RNA二氢尿苷合成水平的化合物。
12.一种检测受试化合物调节t-RNA二氢尿苷合酶活性的能力的试剂盒，所述试剂盒包含如下成分A)选自下组的多肽i.包含SEQ ID NO2(URLC8)的氨基酸序列的多肽；ii.包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入，条件为所述多肽具有等同于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性；iii.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，条件是所述多肽具有等同于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性。B)检测t-RNA二氢尿苷合酶活性的试剂。
13.一种检测受试化合物调节t-RNA二氢尿苷合酶活性的能力的试剂盒，所述试剂盒包含如下成分A)表达选自下组的多肽的细胞i.包含SEQ ID NO2(URLC8)的氨基酸序列的多肽；ii.包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入，条件为所述多肽具有等同于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性。iii.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO1的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，条件是所述多肽具有等同于由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性；和B)检测t-RNA二氢尿苷合酶活性的试剂。
14.一种治疗或预防非小细胞肺癌(NSCLC)的组合物，所述组合物包含药学有效量的化合物和药学可接受的载体，所述药学有效量的化合物降低URLC8-介导的t-RNA二氢尿苷合成。
15.一种治疗或预防非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，所述方法包括将非小细胞肺癌(NSCLC)细胞与药学有效量的化合物接触的步骤，所述化合物降低URLC8-介导的t-RNA二氢尿苷合成。
16.一种治疗或预防非小细胞肺癌(NSCLC)的组合物，所述组合物包含药学有效量的针对URLC8基因的小干扰RNA，其中所述小干扰RNA包含核苷酸序列5’-GTTGGCACAGCCTGTGTAT-3’(SEQ ID NO.11)作为靶序列。
17.权利要求16所述的组合物，所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]为对应于核苷酸序列SEQ ID NO.11的核糖核苷酸序列，[B]为由3至23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；和[A’]为由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。
18.权利要求16所述的组合物，其中所述组合物包含转染增强剂。
19.一种治疗或预防非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，所述方法包括施用药学有效量的针对URLC8基因的小干扰RNA的步骤，其中所述小干扰RNA包含核苷酸序列5’-GTTGGCACAGCCTGTGTAT-3’(SEQ ID NO.11)作为靶序列。
20.权利要求19所述的方法，所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]为对应于核苷酸序列SEQ ID NO.11的核糖核苷酸序列，[B]为由3至23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；和[A’]为由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。
全文摘要
本发明描述了测定多肽的t－RNA二氢尿苷合酶活性和筛选t－RNA二氢尿苷合酶活性的调节子的方法。本发明进一步提供了使用这种调节子预防和/或治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法或药物组合物。此外，本发明提供了使用IMS－E21(URLC8)蛋白的t－RNA二氢尿苷合酶活性作为指数诊断非小细胞肺癌(NSCLC)的方法。本发明进一步提供了预测和诊断肺鳞状细胞癌(SCC)的方法。
文档编号C12Q1/68GK101061239SQ200580039908
公开日2007年10月24日 申请日期2005年9月21日 优先权日2004年9月24日
发明者中村佑辅, 醍醐弥太郎, 中鹤修一 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司, 国立大学法人东京大学