专利名称：利用幼胚离体挽救培养获得百合远缘杂种的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用受精后的幼胚离体培养获得百合属远缘杂种的方法，属于生物技术育种领域。
背景技术：
百合(Lilium L.)花型优美，高贵典雅，且香气宜人，是世界上重要的切花材料之一。百合属植物原种有90多种，因其花色丰富，杂交工作十分活跃。20世纪20-30年代一些国家即开始了对百合属种间杂交的研究，并利用远缘杂交获得百合种间杂种。
中国是世界百合资源的自然分布中心，全球百合属植物约有96个种，分布于中国的就有47个(其中36种为中国特有)，此外还有18个变种。云南有野生百合20余种，占世界百合资源的四分之一。而且大多数百合种类具有较好的香味，生境分布地域较广，抗病力及适应性较强，在改良香味、抗性，增加现有百合品种遗传多样性等方面有一定优势，亟待进一步的开发利用。同时随着云南省10余年花卉产业的发展，已有上百个现代栽培品种引入云南，这些品种具有丰富的花色、花型、不同的生长势及抗病性、抗逆性等，有的较适宜云南的气候及土壤条件，各种优良性状得到较好表现，有的则表现出某方面的优点，但缺点也突出。充分利用云南的百合种质资源优势，选育具有云南特色，适于云南生产条件的优质、高效、抗病百合新品种是云南球根花卉产业发展亟待解决的关键问题，也是改进云南百合商品质量和提高花农经济效益的重要途径。
百合新品种的培育多数是通过种间或种系间远缘杂交实现的，要使杂交组合获得成功，不仅要有足够数量的杂交种子，而且必须保证杂种后代植株有足够的生活力与生育力。杂种胚的挽救培养技术作为组织培养的一个重要领域已有近百年的历史，杂交子房、胚珠和杂交幼胚的离体培养，是目前克服受精后发育障碍的有效方法，在植物育种工作中发挥着极为重要的作用，已广泛运用于水稻、小麦、玉米等粮食作物的育种工作中。当前世界各国培育的亚洲百合和东方百合杂种系，多数是属于不同的种群和杂种间杂交育成的，由于是远缘杂交，杂交胚的胚乳发育不正常或是胚与胚乳之间生理上的不协调而使杂种胚早期败育。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用受精后的幼胚离体挽救培养获得百合属远缘杂种的方法。
本发明通过下列技术方案实现一种利用幼胚离体挽救培养获得百合远缘杂种的方法，其特征在于经过以下步骤A、将授粉后8-23天的受精子房切割下来，在2～6℃温度条件下存放8～15小时，用浓度为75％的酒精对其表面擦拭2-3次，再用浓度为75％的酒精浸泡消毒1～2分钟，然后在浓度为0.05～0.1％的升汞溶液中浸泡12～18分钟，用无菌水洗2～3次，选取膨大的部位，将子房横切为0.2cm的切片；B、在无菌条件下，将灭菌后的子房切片接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中MS基本培养液萘乙酸(NAA)0.5～1.0mg/L蔗糖 60000mg/L琼脂 6000mg/LpH 5.0～5.5在光照8～10h/d，光强800～1200Lx，培养室温度22～26℃条件下，培养20～30d后，在解剖镜下剥离膨大的胚珠；C、在与步骤B相同的培养条件下，对剥离的胚珠进行单胚培养，培养40～50天后幼胚萌发；D、将萌发的幼胚接种到单位为mg/L的下列增殖培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5～1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0～0.1mg/L
蔗糖30000mg/L琼脂6000mg/LpH 5.5～5.8在光照10～12h/d，光强1000～1500Lx，培养室温度22～26℃条件下继代培养，每15～20d继代一次；E、继代3次后，待每个单胚增殖到15～25株后，将其分离成单株，切除叶片后接种到单位为mg/L的下列培养基中MS基本培养液萘乙酸(NAA) 0～0.1mg/L蔗糖60000～90000mg/L琼脂6000mg/LpH 5.5～5.8在无光照，培养室温度为22～26℃条件下，培养80～100d出瓶，包装后于2～4℃条件下放置60～90天，即可下地种植。
本发明所述溶液浓度单位为质量比浓度。
本发明的创新点是本发明与常规育种技术相结合，选择包括云南野生百合的国内外各类优异亲本，配制不同基因型的远缘杂交组合，对受精子房和幼胚进行离体培养挽救，获得了一批杂交幼胚种质，在胚挽救技术应用于百合种间杂交育种上取得了进展，是百合种间杂交育种技术的创新，将有效推进百合育种工作的进程。同时胚挽救技术与百合瓶内结球技术的结合，有效缩短了百合杂交后代的培育周期和杂种成活率。
本发明的优越性在于(1)通过杂交授粉子房及幼胚的离体培养可在胚败育之前将其取出培养，避免远缘杂种胚早衰，使大量远缘杂交胚继续发育成正常种子，尽快进入选育程序，缩短了育种周期。(2)选择包括云南野生百合的国内外各类优异亲本，配制不同基因型的远缘杂交组合，对授精子房和幼胚进行离体培养挽救，在胚抢救技术应用于百合种间杂交育种上取得了进展，同时获得了大量的远缘杂交后代，为培育具有特色的百合商业新品种打下了较好的基础。(3)建立的胚挽救技术体系是百合种间杂交育种技术的创新，将有效推进百合育种工作的进程。(4)胚挽救技术与百合瓶内结球技术的结合，有效缩短了百合杂交后代的培育周期和杂种成活率。
为了更好地说明本发明的实质内容，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于这些。
实施例11、自百合属种间人工授粉第5天起，对授粉子房胚的形态发育进行观察，根据子房膨大及萎缩现象的观察，将授粉后10天的远缘杂交受精子房整个切割下来，经4℃低温存放12小时，用浓度为75％的酒精棉球对其表面擦拭2次，再用浓度为75％的酒精浸泡消毒1分钟，然后在0.1％升汞溶液中处浸泡15分钟，其间经多次摇动，最后用无菌水洗2次，污染率可有效控制在3％以内，选取灭菌子房顶端至中部且靠上的膨大部位，将其横切为0.2cm的切片，每个子房可切片8-15片，此时子房切片的胎座中，可肉眼看见略为透明的膨大胚珠；2、在无菌条件下，将灭菌后的子房切片接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中MS基本培养液萘乙酸(NAA) 1.0mg/L蔗糖60000mg/L琼脂6000mg/LpH 5.0在光照8h/d，光强1200Lx，培养室温度22℃条件下，培养20d后，在解剖镜下剥离膨大的胚珠；3、在下列培养条件MS基本培养液萘乙酸(NAA) 1.0mg/L蔗糖60000mg/L琼脂6000mg/LDH 5.0
光照8h/d，光强1200Lx，培养室温度22℃下，对剥离的胚珠进行单胚培养，培养40天后幼胚萌发4、将萌发的幼胚接种到单位为mg/L的下列增殖培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖30000mg/L琼脂6000mg/LpH 5.8在光照10h/d，光强1500Lx，培养室温度26℃条件下继代培养，每15d继代一次；5、继代3次后，待每个单胚增殖到20株后，将其分离成单株，切除叶片后接种到单位为mg/L的下列培养基中MS基本培养液萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖90000mg/L琼脂6000mg/LpH 5.8在无光照，培养室温度为26℃条件下，培养20d后，瓶内可生成白色或粉红色、无叶片、鳞片紧实、根系发达的小籽球，继续培养60天后出瓶，经包装并在2℃条件下放置90天，即可下地种植，定植后成活率达100％。
实施例21、自百合属种间人工授粉第5天起，对授粉子房胚的形态发育进行观察，根据子房膨大及萎缩现象的观察，将授粉后20天的远缘杂交受精子房整个切割下来，经2℃低温存放15小时，用浓度为75％的酒精棉球对其表面擦拭3次，再用浓度为75％的酒精浸泡消毒2分钟，然后在0.05％升汞溶液中处浸泡18分钟，其间经多次摇动，最后用无菌水洗2次，污染率可有效控制在3％以内，选取灭菌子房顶端至中部且靠上的膨大部位，将其横切为0.2cm的切片，每个子房可切片8-15片，此时子房切片的胎座中，可肉眼看见略为透明的膨大胚珠；2、在无菌条件下，将灭菌后的子房切片接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中MS基本培养液萘乙酸(NAA) 0.5mg/L蔗糖60000mg/L琼脂6000mg/LpH 5.5在光照10h/d，光强800Lx，培养室温度26℃条件下，培养30d后，在解剖镜下剥离膨大的胚珠；3、在下列培养条件MS基本培养液萘乙酸(NAA)0.5mg/L蔗糖 60000mg/L琼脂 6000mg/LpH 5.5光照10h/d，光强800Lx，培养室温度26℃下，对剥离的胚珠进行单胚培养，培养50天后幼胚萌发4、将萌发的幼胚接种到单位为mg/L的下列增殖培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L蔗糖30000mg/L琼脂6000mg/LpH 5.5在光照12h/d，光强1000Lx，培养室温度22℃条件下继代培养，每20d继代一次；5、继代3次后，待每个单胚增殖到18株后，将其分离成单株，切除叶片后接种到单位为mg/L的下列培养基中
MS基本培养液蔗糖90000mg/L琼脂6000mg/LpH 5.5在无光照，培养室温度为22℃条件下，培养30d后，瓶内可生成白色或粉红色、无叶片、鳞片紧实、根系发达的小籽球，继续培养70天后出瓶，经包装并在4℃条件下放置60天，即可下地种植，定植后成活率达100％。
由于百合各个杂交组合亲本来源及遗传背景的不同，在离体培养中的生长状况存在一定的差异。本发明着重对杂种幼胚培养中的关键因素进行了研究。具体对适合子房切片培养材料的选择、不同杂交组合子房切片的膨大状况及胚珠萌发情况、胚龄(授粉的发育时间)及培养条件对幼胚萌发的影响开展了试验研究，其结果报告如下1、试验材料经人工授粉的远缘杂交百合子房。共5个杂交组合类型，15个杂交组合(表1)。
2.方法与结果外植体的选择、灭菌、培养的整个环节同实施例，重点研究了远缘杂交幼胚的有效培养方法。
(1)适合子房切片培养材料的选择有报道已表明，百合幼胚的胚龄与胚培救效果有一定的关系。我们在试验中也证实了这一结论。百合进行杂交授粉后，不同杂交组合的子房发育有差异，有些不亲合的配组在发育的前期就表现出萎缩的状况。选择合适的时期进行子房的离体培养，对切片培养结果有明显的影响。根据多次试验与观察，本试验根据子房发育状况，主要是膨大及萎缩现象的观察，依照不同的杂交配组，采取了授粉后8-23天，每个组合2-3个子房。
经灭菌处理后，主要切取顶端至中部，有膨大现象的部位，由于子房的生长状况不同，每个子房可切片8-15片。此时子房切片的胎座中，可肉眼看见略为透明的膨大胚珠。由于培养材料前期的生长状况有差异，每个子房切片肉眼可见的胚珠为9-15个。
(2)不同杂交组合子房切片的膨大状况及胚珠萌发情况子房切片在培养基中培养7-10天后，子房壁开始增厚，胎座中部的胚珠开始膨大；培养25-30天以后，有的子房切片从胚珠处开始褐化，直到完全失去生命力；而有的切片中幼胚膨大明显，呈浅绿色。在此期间多数培养材料经3-4次转瓶，少数长势较好的膨大胚珠在转接时，切去周边的部分子房壁，采用胚珠结合胎座培养(ovule with placenta culture，OPC)和胚独立培养方法(young single ovule culture，YOC)进行。100天以后，陆续有胚珠开始萌发，并长成幼苗。
表1百合远缘杂交胚培救材料
(注O为东方百合杂种系；为麝香百合；A为亚洲百合杂种系；W为中国野生百合。)
我们于培养150天后，比较了各个杂交组合幼胚的出苗情况(表2)。
表2不同杂交组合子房切片的培养及胚珠萌发情况
从表2的观察结果表明由于百合各个杂交组合亲本来源及遗传背景的不同，杂交配组的类型对培养效果有明显的影响。O×O类型的子房在取材时表现出较好的长势，在培养过程中萌发率最高，H3的萌发率达到35.5％，而且胚珠的长势最好；O×W类型的杂交子房在发育过程中，因在田间发育的后期有萎缩现象，所以培养取材的胚龄较小，在培养过程中萌发率最低，H9仅为4.3％，而且长势不好。尤其是H7(Siberia×岷江百合)的3个培养子房切片均未获得萌发的幼胚植株。其它的组合类型O×A、O×LA和O×L都有再生的幼胚植株。
从亲缘关系分析，O×O类型属种系内杂交，亲和力较好，在田间也收到了一定数量的正常种子；其它的组合均属于远缘的种系外杂交，但在发育前期均有胚的生长。虽然所选取的O×W类型中的野生岷江百合和淡黄花百合均属于亚洲百合系列，但可能由于其在人工栽培条件下的驯化生长仍存在一定的不适应性，在杂交配组后子房的发育有障碍。
从整个培养结果观察，在经多次试验的改进后，本试验所采取的培养方法是有效的，采用的取材方法和培养条件对百合幼胚的生长有利。所培养的材料大部分均有萌芽现象，并获得了一定数量的杂交幼胚再生植株。
(3)胚龄(授粉的发育时间)及培养条件对幼胚萌发的影响所培养材料的胚龄阶段内，胚龄对幼胚的萌发无明显的影响。胚龄最小为8天，最大为23天均可培养出杂交后代。但胚龄不同，胚萌发时间有一定的差异。在同一杂交类型中，H12的胚龄8天，胚萌发时间为128天，H11的胚龄12天，胚萌发时间为108天；H14的胚龄12天，胚萌发时间为120天，H15的胚龄9天，胚萌发时间为125天。胚龄越小，胚萌发需要的时间越长。
本试验采取的不同培养方法主要针对培养材料转接时的生长状况，未观察到对培养结果有明显的影响。只是在培养过程中，子房壁、胎座等组织可能会因适宜的培养条件产生愈伤组织而分化出芽，影响培养出的再生植株的杂种真实性，所以在试验后期，我们采用ARP-PCR(anchored randomprimer-PCR)法对部分胚培后代进行了杂种鉴定。
在培养过程中，对少数胚大明显的胚珠采取了剥离培养，但培养材料均出现玻璃化和褐化现象，在培养后期未观察到胚的萌发。可能试验所采取的培养条件不适应于剥离胚的培养；培养基的pH值对培养效果有一定的影响。当pH值超过5.8时，培养物的褐化现象较明显。
在百合远缘杂交育种中，采用子房切片离体培养技术进行胚挽救是一种有效的方法。在合适的胚龄阶段，不同种间及种系间杂交组合类型对百合幼胚的萌发及植株再生有一定的影响O×O，O×A杂交类型的授粉子房幼胚萌发率最高，O×野生种的幼胚萌发率最低。
培养基中的糖浓度、激素浓度、pH值的大小以及培养条件不是各自独立地对培养有影响。胚培养后代以瓶内结球的形式出瓶后，成活率大大提高。出瓶的小籽球经过春化处理，可于次年长出地上茎，在一定程度上缩短了杂种后代种球的培育周期，可于2-3年后开花筛选。
权利要求
1.一种利用幼胚离体挽救培养获得百合远缘杂种的方法，其特征在于经过以下步骤A、将授粉后8-23天的受精子房切割下来，在2～6℃温度条件下存放8～15小时，用浓度为75％的酒精对其表面擦拭2-3次，再用浓度为75％的酒精浸泡消毒1～2分钟，然后在浓度为0.05～0.1％的升汞溶液中浸泡12～18分钟，用无菌水洗2～3次，选取膨大的部位，将子房横切为0.2cm的切片；B、在无菌条件下，将灭菌后的子房切片接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中MS基本培养液萘乙酸(NAA)0.5～1.0mg/L蔗糖 60000mg/L琼脂 6000mg/LpH 5.0～5.5在光照8～10h/d，光强800～1200Lx，培养室温度22～26℃条件下，培养20～30d后，在解剖镜下剥离膨大的胚珠；C、在与步骤B相同的培养条件下，对剥离的胚珠进行单胚培养，培养40～50天后幼胚萌发；D、将萌发的幼胚接种到单位为mg/L的下列增殖培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～1.0mg/L萘乙酸(NAA)0～0.1mg/L蔗糖 30000mg/L琼脂 6000mg/LpH 5.5～5.8在光照10～12h/d，光强1000～1500Lx，培养室温度22～26℃条件下继代培养，每15～20d继代一次；E、继代3次后，待每个单胚增殖到15～25株后，将其分离成单株，切除叶片后接种到单位为mg/L的下列培养基中MS基本培养液萘乙酸(NAA)0～0.1mg/L蔗糖 60000～90000mg/L琼脂 6000mg/LpH 5.5～5.8在无光照，培养室温度为22～26℃条件下，培养80～100d出瓶，包装后于2～4℃条件下放置60～90天，即可下地种植。
全文摘要
本发明公开了一种利用幼胚拯救获得百合属远缘杂种的方法，它选择云南野生百合及国内外各类优异亲本，以东方百合杂种系为母本，进行杂交，通过杂交授粉子房及幼胚的离体培养可在胚败育之前将其取出培养，避免远缘杂种胚早衰，使大量远缘杂交胚继续发育成正常种子，尽快进入选育程序，缩短了育种周期，同时获得了大量的远缘杂交后代，实现了百合属种间远缘杂交，创造了一批新种质，胚挽救技术与百合瓶内结球技术的结合，有效缩短了百合杂交后代的培育周期和杂种成活率。
文档编号C12N5/04GK1994067SQ20061004882
公开日2007年7月11日 申请日期2006年11月16日 优先权日2006年11月16日
发明者屈云慧, 熊丽, 蒋亚莲, 吴学尉, 张艺萍 申请人:云南省农业科学院花卉研究所