抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶及其在药中的应用的制作方法

专利名称：抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶及其在药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶及其在药中的应用。
背景技术：
脱氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme，缩写为DZ)是一种崭新的能够抑制细胞内RNA(核糖核酸)表达的有效手段。它是通过对体外合成的随机序列库进行筛选得到具有RNA切割功能的DNA(脱氧核糖核酸)分子，理论上能够对任意序列的RNA分子进行特异性切割。其中功能最强研究最多的是10-23型脱氧核酶简称10-23DZ。10-23DZ由15个核苷酸的催化核心和两侧各7-11个核苷酸组成的侧翼序列构成(见

图1)。RNA底物在未配对的嘌呤(A，G)和配对的嘧啶残基(C，U)之间被切割。这种切割具有高度的序列特异性，理论上可切断任何靶RNA。自从第一例DZ报道以来，生物学家已将其广泛应用于抑制各种有害基因的表达，在动物模型中亦有成功的报道。
人类呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，简称hRSV或RSV)是世界范围内婴幼儿及成人呼吸道感染的首要病原。血清学资料显示，大约95％的儿童在2岁前曾感染过RSV，达成年时，感染率达100％。RSV感染每年造成全球超过1百万儿童死亡。由于RSV感染引起的免疫应答不能起到有效的保护作用，因此在整个成年阶段都可再发感染。另外，在老年病人及免疫缺陷病人，尤其在接受骨髓移植的病人中，RSV感染的爆发正受到越来越多的重视。尽管经过多年的努力，但是到目前为止，尚没有针对RSV的可靠疫苗或特异性的抗RSV制剂问世。

发明内容
本发明的目的是抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶及其在药中的应用，在无细胞体系及细胞体系中对动物和人类RSV的RNA具有剪切活性，能够能特异性地抑制呼吸道合胞病毒的复制，对正常组织无毒副作用。
本发明所述的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，具有可在RSV RNA核苷酸序列中嘌呤嘧啶位点特定裂解RNA的催化活性域；催化域5′末端邻接的第一结合域可与RSV RNA内切位点一侧碱基序列特异性互补结合；催化域3′末端邻接的第二结合域可与RSV RNA内切位点另一侧碱基序列特异性互补结合；其特征是能裂解呼吸道合胞病毒的基因组RNA、或/和反基因组RNA、或/和mRNA；其催化活性域选自RSV基因组RNA的以下序列SEQ ID NO15’-caucuuuguauuugcccca-3’SEQ ID NO25’-ucaaauucuuauuugccccauuuuuugg-3’SEQ ID NO35’-caucuuuguauuugccccaucuucuaucu-3’
SEQ ID NO45’-ugaugauuuauuugccccauuuuuuauua-3’SEQ ID NO55’-auguuuccatauuugccccacccuuuccuu-3’SEQ ID NO65’-uccaaugauuauuugccccauguguauau-3’SEQ ID NO75’-gacauguuucauuugccccaauguuauug-3’SEQ ID NO85’-acuccauuguuauuugccccagaguuuauuuug-3’SEQ ID NO95’-uucgugacauauuugccccaguuuucauu-3’。
所述的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，有多种核苷酸序列，优选的核苷酸序列为5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTA CAA CGA AC AAA GAT G-3’。
所述的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，其5’端或/和3’端的2-3个核苷酸进行了硫代修饰、或者全硫代修饰。
所述的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，其特征是5’端或/和3’端进行胆固醇共扼修饰。
合成本发明所述的脱氧核酶的原料为A.T.C.G.(Adenine腺嘌呤，Thymine胸腺嘧啶，Cytosine胞嘧啶，Guanine鸟嘌呤)。制备包括以下步骤1、在核酸合成仪自动合成脱氧核酶，它能作用于呼吸道合胞病毒(RSV)的第1133位核苷酸，其核苷酸序列为5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTA CAA CGAAC AAA GAT G-3’；2、对上述脱氧核酶的5’端和3’端的2-3个核苷酸进行了硫代修饰；以提高其稳定性。
3、对上述脱氧核酶的3’端连接胆固醇进行了硫代修饰；以提高细胞和组织的摄取并增加稳定性。
所述的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶在药中的应用，其特征是含有0.01mg-20mg/50μl的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶的溶液。
使用前，加生理盐水或磷酸缓冲液配制成需浓度为0.01mg-20mg/50ul的混合液，采用滴鼻的方式给药。
上述脱氧核酶加pH7.0的磷酸缓冲液配制成0.01mg/50ul的药液，采用滴鼻的方式给药，可多次给药。
或上述脱氧核酶加生理盐水配置成0.4mg/50ul的药液，采用滴鼻的方式给药，可多次给药。
或上述脱氧核酶加pH7.2的磷酸缓冲液配置成20mg/50ul的药液，采用滴鼻的方式给药，可多次给药。
在本发明的第一方面的优选的实施方案中，结合域与紧密侧接裂解位点的区完全互补。但是，本领域技术人员认识到，脱氧核酶结合并裂解RSV的RNA可以不要求严格互补。
本发明的脱氧核酶的催化域可以是任何适当的催化域。适当的催化域的例子如Santoro和Joyce和美国专利5,807,718所述。在优选的方案中，催化域具有核苷酸序列GGCTAGCTACAACGA。
在本发明的参数中，结合域长度(即“臂长度”)可以是任何排列，且可以相同或不同。在优选的实施方案中，结合域长度为至少6个核苷酸，优选两个结合域的总长度为至少14个核昔酸。各种排列如7+7，8+8和9+9是可以设想的。人们已经认识到，结合域越长，其越紧密地结合其互补mRNA序列。因此，在另一个优选的实施方案中，各域的长度是9-11个或更多个核苷酸。
本发明可以以RSV病毒标准株CH18537株为例证，但本发明可以由其它任何有已知基因组序列或未知基因组序列的RSV株实施。
本发明的裂解位点为RSV RNA的任意位点。RSV基因组RNA序列可由常规技术获得，其反基因组RNA序列、mRNA序列可由基因组序列推知。RSV是具有多个基因的负链RNA病毒，进入宿主细胞后基因组转录产生各种编码病毒蛋白的mRNA，并且产生与基因组完全互补的反基因组，后代病毒的基因组由此转录获得。本文所述的RSV的RNA包括其基因组RNA、反基因组RNA和mRNA。
在优选的实施方案中，本领域的研究人员可以知道，第一，该位点的选择应对病毒复制至关重要。即切割该位点，病毒复制将受到明显的抑制，从而减轻RSV感染引起的病变，达到治疗或预防RSV感染的目的。第二，靶序列在不同的RSV株间是高度保守的序列。第三，通过对RNA二级结构的计算机辅助分析，靶位点是容易接近，且在一个不稳定的位置以利于DZ的切割作用。
在特别优选的实施方案中，脱氧核酶具有序列5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTACAA CGA AC AAA GAT G-3’，以裂解RSV基因组RNA 5’-C AUCUUU GUA UUU GCC CCA-3’碱基序列(SEQ ID NO1)，特异性裂解RSV N基因上述RNA序列中5’-AU-3’之间的碱基位点。
在应用基于脱氧核酶的治疗中，优选脱氧核酶在细胞内环境中应尽可能地稳定。实现其手段包括引入含有修饰的核苷酸或核苷酸键。修饰的核苷酸包括例如，硫代磷酸化(硫代)、N3’-P5’氨基磷酸酯键、2’-O-甲基取代、在脱氧核酶的一个或多个末端掺入3’-3’倒置和肽核酸键修饰或以上方法的组合。这些都是本领域公知的。
在优选的实施方案中，使用硫代修饰，包括全部及部分核苷酸使用硫代修饰。
在特别优选的实施方案中，本发明对脱氧核酶的5’端和3’端的2-3个核苷酸进行了硫代修饰。
在第二方面，本发明提供包含第一方面的脱氧核酶和药学可接受的载体的药物组合物。
在本发明的上下文中，给予第二方面的药物组合物可以使用本领域技术人员公知的各种方法和递送系统进行。给药方法包括但不局限于以下方法之一或以下方法的组合局部呼吸道气雾剂吸入、鼻内点滴或鼻腔喷雾、静脉内、口服、通过植入、经粘膜、经皮、局部、肌肉内、皮下或体外进行。在一个优选的方案中，采用鼻内点滴或鼻腔喷雾的方式递送。在特别优选的方案中，本发明采用呼吸道气雾剂吸入给药的方法。
局部呼吸道气雾剂吸入递送系统包括但不局限于凝胶和溶液，并且可以含有赋形剂如稳定剂.渗透促进剂笼例如，脂肪酸、脂肪酸醋、脂肪醇和氨基酸)，和亲水聚合物(例如，polycarbophil和聚乙烯吡咯烷酮)。在优选的实施方案中。药学可接受的载体是脂质体或可生物降解的聚合物。可以用于本发明的脂质体的例子可以包括但不局限于以下类型(1)CellFectin，阳离子脂质四甲基四棕搁基精胺和二油酰基磷脂酸乙醇胺(DOPE)(GIHCO BEL)的1∶1.5(M/M)脂质体配方；(2)Cytofectin GSV，阳离子脂质和DOPE(Glen Research)的2∶1(M/M)脂质体配方；(3)DOTAP(N-(1-(2，3-二油酰氧基)-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵)(Eoehringer Manheim)；和(4)Lipofectamine，聚阳离子脂质DOSPA和中性脂质DOPE(GIBCO BEL)的3∶1(M/M)脂质体配方。
核酸剂的递送也可以通过一种或多种以下载体实现
(a)脂质体和脂质体-蛋白质缀合物和混合物；(b)聚合物配方如聚氮丙啶(PEI)；(c)病毒脂质体复合物，如仙台病毒(d)肽-核酸缀合物；或(e)胆固醇-核酸缀合物(其中胆固醇优选缀合于寡核苷酸的5’-末端)。
在优选的方案中，本发明采用胆固醇-核酸缀合物的方法投递脱氧核酶。
在第三方面，本发明提供抑制RSV感染细胞中病毒滴度的方法，所述方法包括向细胞中引入第一方面的脱氧核酶和第二方面的药物组合。
在第四方面，本发明提供抑制RSV感染细胞中细胞病变的方法，所述方法包括向细胞中引入第一方面的脱氧核酶和第二方面的药物组合。
在第五方面，本发明提供抑制RSV感染细胞中病毒蛋白表达的方法，所述方法包括向细胞中引入第一方面的脱氧核酶和第二方面的药物组合。
在第六方面，本发明提供抑制RSV感染细胞中病毒RNA表达的方法，所述方法包括向细胞中引入第一方面的脱氧核酶和第二方面的药物组合。
在第七方面，本发明提供抑制受试动物RSV感染的方法，包括预防和治疗的目的，所述方法包括将第二方面的药物组合给予受试动物。
在第八方面，本发明提供抑制受试者RSV感染的方法，包括预防和治疗的目的，所述方法包括将第二方面的药物组合给予受试者。此处受试者指人类。
根据常规计算方法可以确定本发明的药物组合物的治疗有效剂量。在一个实施方案中，有效剂量含有约0.1毫克至约1克本发明的脱氧核酶。在另一个实施方案中，有效剂量含有约1毫克至约100毫克本发明的脱氧核酶。在另一个实施方案中，有效剂量含有约10毫克至约50毫克本发明的脱氧核酶。在另一个实施方案中，有效剂量含有约25毫克本发明的脱氧核酶。单一治疗有效剂量可以以更小剂量在一定时间内给药。
在第三到第六方面的一个实施方案中，所述方法在体外进行。
在第七、第八方面的一个实施方案中，所述方法在体内进行。
本发明具有以下优点能裂解呼吸道合胞病毒的基因组RNA、或反基因组RNA、或mRNA，并能特异性地抑制呼吸道合胞病毒的复制，提高药物敏感性，对正常组织无毒副作用。
图2脱氧核酶3’端胆固醇连接的方式示意图。
图3脱氧核酶体外无细胞系统对底物RNA的剪切作用示意图。
图4脱氧核酶对RSV mRNA表达的影响示意图。
具体实施例方式实施例1脱氧核酶构建体的设计。靶RNA中DZ切割位点的选择主要考虑三个因素第一，该位点对病毒复制至关重要。RSV的基因组是非阶段性的负链RNA，含有大约15000个核苷酸，其结构为3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2(M2-1-M2-2)-L-5’，编码相应的11个病毒蛋白核衣壳蛋白N、磷蛋白P、多聚酶亚单位L、转录延长因子M2-1、融合蛋白F、粘附蛋白G和小疏水蛋白SH、非结构蛋白NS1和NS2、基质蛋白M和M2-2。在病毒复制过程中，核衣壳蛋白N发挥了重要功能。它是病毒多聚酶复合体(N、P、L蛋白)的重要组成部分，病毒mRNA在多聚酶复合体的作用下以负链基因组RNA为模板转录而来，此多聚酶复合体还以正链中间体RNA为模板复制出新的负链基因组RNA，进入子代病毒。N蛋白与基因组RNA紧密结合以抵抗核酸酶对RNA的降解；在转录、复制过程中与P-L多聚酶相互协同作用；与基质蛋白M相互作用完成病毒组装(Grosfeld et al.，1995)。RSV的M2基因包含两个重叠的开放阅读框，产生194个氨基酸的M2-1和90个氨基酸的M2-2两种蛋白。M2-1蛋白为病毒复制所必需的转录延长因子，发挥促进病毒RNA转录的功能。缺乏M2-1的病毒颗粒只能转录出NS1、NS2基因而不能转录其他基因(Collins et al.，1996，2001)。M2-1还促进多聚酶复合体在各基因的连接处对基因组RNA的通读能力，抑制转录衰减，从而促进转录(Hardy et al.，1999；Tang et al.，2001)。由于N和M2-1基因在病毒复制中的重要作用，在实验中本发明选择RSV N和M2-1基因组RNA作为Dz作用的靶位点。
第二，靶序列在不同的RSV株间应高度保守。RSV基因组RNA中，除L基因外，每个基因开始都有一个保守的9nt基因起始序列3’-CCCCGUUUA-5’(L基因的起始序列为3’-CCCUGUUUUA-5’)(Collins et al.，1987)。转录均从此序列的第一个核苷酸开始(Kuo et al.，1997，1996)。RSV的这一特征对利用Dz催化降解RSV基因组RNA非常有利，因为其既是病毒复制所必需，也是高度保守的。在对2-5-A抑制RSV的研究中发现，阻断此基因起始序列可有效抑制RSV复制(Player et al.，1998；Leaman et al.，2002)。
第三，通过对RNA二级结构的计算机辅助分析，靶位点应容易接近，且在一个不稳定的位点以利于Dz的切割作用。
根据上述靶位点选择的三个基本规则，在我们的研究中，以Santoro和Joce的报道为基础(1997；1998)，设计了特异性DZ，即DZ1133，以RSV基因组N基因的转录起始序列为切割靶位点。DZ两边侧翼为9nt(DZ1133)与靶RNA严格配对的核苷酸序列。作为对照，设计了针对相同底物的19n的反义寡聚核苷酸(AS1133)和一个在15nt催化域有一个点突变的突变体DZ(mutDZ1133)。DZ、对照寡聚核苷酸及它们相应的互补RNA底物。
脱氧核酶构建体的合成本发明应用的所有DZ在中国军事医学科学院放射医学研究所合成，所用合成仪为ABI 392DNA/RNA合成仪，合成产物用高效液相色谱纯化，0.22um滤器过滤消毒，紫外分光光度计进行定量。
脱氧核酶的修饰。
所用3’-胆固醇-TEG CPG购自Glen Research公司(Sterling，美国)。脱氧核酶体内应用的主要问题是在保证高效的催化活性的同时，是否能被细胞有效摄取、是否能抵抗体内核酸酶的降解即稳定程度。这些问题可通过对脱氧核酶进行修饰加以解决。为了提高DZ的稳定性，本发明对5’端和3’端的2-3个碱基进行了硫代修饰。此外，在细胞培养模型中，我们应用了3’端胆固醇连接的方法以提高细胞的摄取(图2)。
实施例2脱氧核酶对RNA靶的体外裂解Hep-2人喉上皮癌细胞常规培养在含10％灭活胎牛血清(FBS，Hyclon，Logan，UT)、2mM L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的极限必需培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium Dulbecco，DMEM)中培养，培养条件37℃，5％CO2。
人类呼吸道合胞病毒B亚型标准株RSV CH18537，在含2％的胎牛血清和抗生素的DMEM(病毒维持液)中培养的Hep-2细胞中传代。在细胞病变(CytopathicEffect，CPE)达到75％-100％，即CPE+++-++++(感染细胞病变程度评价方法0％-25％细胞发生病变，记做CPE+；25％-50％细胞发生病变，记做CPE++；50％-75％细胞发生病变，记做CPE+++；75％-100％细胞发生病变，记做CPE++++)时收集并分装上清，检测病毒滴度后储存在-80℃备用。
DZ细胞外剪切反应体系5pmol RNA模板、5pmol DZ1133或DZ7601、10mMMgCl2、50mM Tris-HCl(pH＝7.4)，补DEPC水至总体积10ul，37℃反应。在不同的时间点(30分钟，60分钟，90分钟，120分钟和240分钟)终止反应(每个反应管加入0.5M EDTA 1μl)。将反应产物70℃变性15分钟后置冰上，以含7M尿素的8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，常规方法银染显色(Palfner et al.，1995)，用Totallab程序包(Nonlinear Dynamics公司，英国)分析电泳条带密度。DZ的剪切效率以产物RNA/总底物RNA密度之比显示。
对于有RNA切割活性的DZ，进一步检测在不同浓度Mg离子体系中的切割效率。反应体系中Mg离子浓度分别为2mM、10mM、25mM，体系中其他条件同前，37℃反应240分钟，以含7M尿素的8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，常规方法银染显色，分析方法同前。
针对RSV基因组RNA N基因和M2基因的转录启始序列所设计的脱氧核酶(即DZ1133)，对其剪切相应的底物RNA的活性进行了检测。结果DZ1133在既定的位点将453nt的底物RNA切割，产生了两个片段5’端297nt和3’端156nt的切割产物。随着反应时间的延长，可见底物RNA逐渐减少，切割产物逐渐增加。在30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和240分钟，剪切产物RNA/总RNA底物的百分比分别为15.09％、26.45％、42.13％、53.20％和67.90％。继续延长反应时间，切割效率不再增加。反应体系中不加DZ，则底物RNA没有降解。这些数据表明了DZ1133切割RSV N基因RNA的序列特异性和时间依赖性(图3)。
实施例3脱氧核酶对对感染细胞中病毒复制的抑制作用Hep-2细胞常规培养在含有抗生素和10％FBS的DMEM培养基中进行。RSV A2标准株、CH 18537株、六株重庆地区野生株于住院病人的鼻烟分泌物中分离；另外四株RSV野生株于北京地区2001-2002年流行季节分离，这四株临床分离株未做分型。以上病毒均在Hep-2细胞中于37℃传代培养，培养基为含抗生素和2％FBS的DMEM(病毒维持液)。在细胞病变达到75％-100％(CPE+++-++++)时收集上清，分装后于-80℃保存。病毒滴度用空斑形成实验在Hep-2培养细胞上测定。所用病毒的滴度为1.7×105至6.5×107/ml。
用不同株的RSV感染6孔培养板中的单层Hep-2细胞(MOI＝0.1)。病毒吸附2小时后加入等倍稀释成不同浓度的DZ1133或其对照寡核苷酸(用病毒维持液稀释，使其终浓度为0.25μM，0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM)，37℃继续培养。感染后12小时以含有同样浓度药物的培养基换液一次。逐日在显微镜下观察细胞病变。待病毒感染未处理组细胞的CPE达到+++-++++时终止实验并摄像，通常情况下为5天，不同株的RSV CPE出现时间和严重程度有所不同。
感染细胞出现融合病变是RSV一个标志性的特征，RSV因此得名。为观察DZ对细胞融合病变形成的抑制作用，在病毒感染后12小时分别加入不同浓度的DZ1133或其对照寡核苷酸。倒置显微镜下观察细胞病变，结果是DZ1133能够抑制RSV引起的Hep-2细胞特异性合胞病变，并且呈剂量依赖性。DZ1133可能参与了抑制RSV F糖蛋白介导的细胞融合病变形成的两个过程即(a)病毒膜与细胞膜的融合和(b)细胞膜与细胞膜的之间的融合。
实施例4脱氧核酶对对感染细胞中病毒RNA表达的抑制作用以编码F蛋白基因的特异性引物进行RT-PCR检测。
操作方法如下每孔5×104个细胞接种6孔板，待细胞生长24-36小时后感染RSV A2株或CH 18537株(MOI＝0.1)。于感染后2和12小时分别加入等倍稀释的DZ1133(使其终浓度为0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM)。随后将培养板在37℃孵育3天。
以TRIzol试剂(Gibco BRL)提取总RNA。逆转录合成cDNA2.5μl RNA模板，200mM dNTP(上海生工公司)，200ng/μl 6mer随机引物(PdN6，上海生工公司)→混合后于65℃反应5分钟，置冰上1分钟→加入5×逆转录酶缓冲液4μl，40u RNasn(Promega公司，美国)，200u Superscript RNase H-逆转录酶(Gibco BRL)，0.1M DTT→充分混匀后25℃反应10分钟，42℃反应50分钟→70℃15分钟灭活逆转录酶。
PCR反应应用Ex TaqTM DNA聚合酶(Takara公司，日本)和如下引物(分别为上游引物和下游引物)1)18537株F基因5’GCCTATAACAAATGACCAGAAAA 3’和5’CACATAGTCACAACCATTAGAAAA 3’；2)A2株F基因5’CCATAATAAAAGAGGAAGTC3’和5’CACGATTTTTATTGGATG 3’；3)Human β-act in5’ATGGATGATGATATCGCCGCG 3’和5’TAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC 3’CH 18537株引物设计参考Johnson报道的序列(Johnson et al.，1988)；A2株引物设计参考GeneBank中的序列(accession no.M74568)。引物设计应用软件Genestar。
PCR反应体系为50μl反应混合物包括cDNA 2μl、10×TaqTM DNA聚合酶缓冲液5μl、TaqTM DNA聚合酶2u，上游引物和下游引物各1μM，补水至50μl。
RSV CH18537株F基因PCR扩增条件为94℃预变性3min，94℃变性45s，44℃退火45s，72℃延伸1min，共24个循环，72℃再延伸10min。
RSV A2株F基因PCR扩增条件为94℃预变性3min，94℃变性45s，44℃退火45s，72℃延伸1min，共24个循环，72℃再延伸10min。
β-actin扩增条件为94℃预变性2min，60℃退火2min，94℃变性45s，60℃退火2min，72℃延伸3min，共24个循环，72℃再延伸10min。
A2株F基因、18537株F基因、Human β-actin PCR扩增产物分别为420bp、535bp和1126bp。反应结束后各取5μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察。
DZ1133能够特异性地降低人类呼吸道合胞病毒A亚型和B亚型RSV mRNA的表达。病毒感染后检测了RSV F基因特异性片段，其中A2株为420bp，18537株为535bp，当DZ1133浓度从0.5μM等倍增加至2μM时，A2株扩增片段表达量抑制率为42.51％、65.56％、83.62％，在4μM和8μM时则完全抑制目的基因的表达；当DZ1133浓度从0.5μM等倍增加至4μM时对18537株F基因表达抑制率分别为21.14％、55.1％、60.84％和82.16％，至8μM时完全抑制目的基因表达。看家基因β-actin没有出现相应表达量的降低，证明DZ1133对RSV基因的抑制是特异性的(图4)。
实施例5脱氧核酶对对感染细胞中病毒蛋白表达的抑制作用在96孔培养板中每孔加入50μl等倍稀释的DZ1133及其对照化合物(使其终浓度为0.125μM，0.25μM，0.5μM 1μM，2μM，4μM)，每种浓度设四个复孔。每孔加入5×103个Hep-2细胞悬液(25μl)和100TCID50的病毒(25μl)。将培养板于室温下700g离心5分钟后置于5％CO2，37℃培养。每种药物另设两个未感染未处理孔和四个病毒感染未处理孔作为对照。
感染后48小时进行ELISA检测(Kang et al.，1989)。具体操作如下细胞以0.05％戊二醛4℃固定20分钟，以含1％BSA的PBS室温封闭30分钟。一抗为针对RSV F蛋白的小鼠单克隆抗体(Cat.No R1595-36，USBiological，美国)或针对整个病毒抗原的山羊多克隆抗体(Cat.No R1595-35，USBiological，美国)。以含1％BSA的PBS稀释(前者稀释倍数为1∶500，后前者稀释倍数为1∶10000)。37℃孵育1小时后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(北京中山生物技术公司)，二抗以含1％BSA的PBS稀释，其中羊抗鼠IgG稀释度为1∶7000，鼠抗羊IgG为1∶20000。37℃孵育1小时后以TMB(3’3’5’5’-tetramethylbenzidine，TMB)显色。记录450nm吸光值。ELISA试验的数据根据保护百分率计算每种药物的EC50。保护百分率计算公式为[(ODC)V-(ODT)V][(ODC)V-(ODC)M]×100%]]>其中(ODT)V、(ODC)V、(ODC)M分别代表病毒感染加药组、病毒感染未加药组和未感染未加药组的吸光值。
ELISA方法检测DZ1133对RSV蛋白表达的抑制，药物平均EC50见表1和表2。

表1 DZ1133对RSV蛋白表达的抑制作用baAverage for three independent experiments.
bThe first antibody was a mouse anti-RSV monoclonal antibody directedagainst the F protein of RSV(both for subgroup A and subgroup B).

表2 DZ1133对RSV蛋白表达的抑制作用baAverage for three independent experiments.
bThe first antibody was a goat anti-RSV polyclonal antibody against thewhole viral antigens(both for subgroup A and subgroup B).
实施例6脱氧核酶对RSV感染小鼠模型中对病毒滴度的抑制作用SPF级8-12周龄、体重18-22g、雌性BALB/c小鼠随机分组，鼻腔缓慢滴入50μl 2×106PFU/ml RSV A2株(A亚型)、RSV CH18537株(B亚型)、RSV BeiJing01地方分离株病毒液，各组阴性对照滴入50μl 2％FBS DMEM。感染后24h、48h给予0.4mg DZ1133两次滴鼻治疗，各组对照滴入50μl PBS。感染后72h处死各组小鼠。无菌条件下取右肺称重，按10ml/g(wt/vol)加入预冷肺组织平衡液匀浆，4℃，2500g离心10分钟收集上清，空斑形成实验分析小鼠肺组织病毒滴度和DZ1133治疗后空斑形成抑制率。
表4 DZ1133对RSV不同标准株和地方株广谱抗病毒作用

★表示与各自对照组比较差别有显著性，p＜0.05根据上面实施例1到6的结果可得出结论(1)根据呼吸道合胞病毒设计的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，能裂解呼吸道合胞病毒的基因组RNA、或反基因组RNA、或mRNA。
(2)特异性地抑制呼吸道合胞病毒的复制，提高药物敏感性，对正常组织无毒副作用。
(3)在特别优选的实施方案中，根据RSV基因特定部位设计出的特定抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，其核苷酸序列为5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTA CAACGA AC AAA GAT G-3’，5’端和3’端的2-3个核苷酸进行了硫代修饰，并应用了3’端连接胆固醇的修饰；能够在期望的位点裂解RNA靶；特异性地抑制呼吸道合胞病毒的复制，提高药物敏感性，对正常组织无毒副作用。
权利要求
1.抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，具有可在RNA核苷酸序列中嘌呤嘧啶位点特定裂解RSV RNA的催化活性域；催化域5′末端邻接的第一结合域可与RSV RNA内切位点一侧碱基序列特异性互补结合；催化域3′末端邻接的第二结合域可与RSVRNA内切位点另一侧碱基序列特异性互补结合；其特征是能裂解呼吸道合胞病毒的基因组RNA、或/和反基因组RNA、或/和mRNA；其催化活性域选自RSV基因组RNA的以下序列SEQ ID NO15’-caucuuuguauuugcccca-3’SEQ ID NO25’-ucaaauucuuauuugccccauuuuuugg-3’SEQ ID NO35’-caucuuuguauuugccccaucuucuaucu-3’SEQ ID NO45’-ugaugauuuauuugccccauuuuuuauua-3’SEQ ID NO55’-auguuuccatauuugccccacccuuuccuu-3’SEQ ID NO65’-uccaaugauuauuugccccauguguauau-3’SEQ ID NO75’-gacauguuucauuugccccaauguuauug-3’SEQ ID NO85’-acuccauuguuauuugccccagaguuuauuuug-3’SEQ ID NO95’-uucgugacauauuugccccaguuuucauu-3’。
2.根据权利要求1所述的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，其特征是核苷酸序列为5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTA CAA CGA AC AAA GAT G-3’。
3.根据权利要求1或2所述的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，其特征是5’端或/和3’端的2-3个核苷酸进行了硫代修饰、或者全硫代修饰。
4.根据权利要求1-3所述的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶，其特征是5’端/和3’端进行胆固醇共扼修饰。
5.抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶在药中的应用，其特征是含有0.01mg-20mg/50μl的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶的溶液。
全文摘要
本发明涉及抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶及其在药中的应用。所述的脱氧核酶具有可在RSV RNA核苷酸序列中嘌呤嘧啶位点特定裂解RNA的催化活性域；催化域5′末端邻接的第一结合域可与RSV RNA内切位点一侧碱基序列特异性互补结合；催化域3′末端邻接的第二结合域可与RSV RNA内切位点另一侧碱基序列特异性互补结合；其特征是能裂解呼吸道合胞病毒、抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶在药中的应用，其特征是含有0.01mg－20mg/50μl的抗呼吸道合胞病毒的脱氧核酶的溶液。本发明具有以下优点能裂解呼吸道合胞病毒的基因组RNA、或反基因组RNA、或mRNA，并能特异性地抑制呼吸道合胞病毒的复制，提高药物敏感性，对正常组织无毒副作用。
文档编号C12N9/22GK101029313SQ20061005410
公开日2007年9月5日 申请日期2006年3月1日 优先权日2006年3月1日
发明者杨锡强, 赵晓东, 蒋利萍, 解元元, 周娟, 崔玉霞, 刘崇海, 王莉佳, 赵耀 申请人:重庆医科大学附属儿童医院