用于治疗动脉粥样硬化病症的番茄红素制剂的制作方法

专利名称：：用于治疗动脉粥样硬化病症的番茄红素制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于治疗动脉粥样硬化和心血管病症的化合物的生产，特别是抑制脂质氧化抗体酶活性的化合物。
背景技术：
：脂质氧化是导致循环脂蛋白转变成高度致动脉粥样化因子的一个主要过程[GotoY.(1982)supra,HalliwellB.,andJ.M,C.Gutteridge,(1989)supra,SchultzD.，andHarrisonD.G.(2000)supra]。脂质氧化的主要原因是在动脉粥样硬化病灶中和单独具有动脉粥样硬化病症的血清中发现的催化性抗体或抗体酶(见WO03/017992,WO03/019196和WO03/019198)。引出这些抗体酶(其被称为AtheroAbzymesTM)响应衣原体感染，并与循环脂蛋白交叉反应以生成氧化的致动脉粥样化因子。AtheroAbzymes在动脉硬化症的发展过程中是一种关键的病因，且对于心血管和动脉硬化症的相关病症的治疗学干预是一种重要的靶标。
发明内容现在令人惊讶地发现，很少或不显示抗体酶抑制活性的化合物，特别是两性分子或亲脂性的抗氧化剂化合物，可以通过增加它们在水性溶剂中的溶解度，例如通过与增溶剂混合而制备成有效的抗体酶抑制剂。本发明的一个方面提供一种鉴定和/或得到用于治疗动脉粥样硬化病症的化合物的方法，该方法包括使脂质氧化抗体酶与包含测试化合物和增溶剂的组合物接触，和测定所述组合物对抗体酶活性的抑制。抗体酶活性的抑制预示着所述化合物可能对治疗动脉粥样硬化病症例如冠心病(CHD)有用。测试化合物抑制抗体酶活性的能力由于增溶剂的存在而增加。例如，在不存在增溶剂的情况下，测试化合物可以很少或不显示抑制抗体酶活性。适当的测试化合物包括非亲水性的抗氧化剂，例如类胡萝卜素如番茄红素。适当的增溶剂包括可溶性蛋白质，例如乳蛋白质。本发明的另一方面提供一种增加测试化合物抑制脂质氧化抗体酶的能力，该方法包括使测试化合物与增溶剂混合。本发明的另一方面提供一种制备用于治疗动脉粥样硬化病症的组合物的方法，该方法包括使非亲水抗氧化剂与增溶剂混合，所述非亲水抗氧化剂例如是类胡萝卜素，如番茄红素，所述增溶剂例如是可溶性蛋白质，如乳蛋白质。本发明的另一方面提供包含增溶剂和非亲水抗氧化剂的组合物在制备用于治疗动脉粥样硬化病症的药物中的应用。本发明的另一方面提供一种用于治疗动脉粥样硬化病症的包含增溶剂和非亲水性抗氧化剂的组合物。本发明的另一方面提供一种治疗动脉粥样硬化病症的方法，该方法包括将包含增溶剂和非亲水性抗氧化剂的组合物给药于个体。本发明的另一方面提供一种制备用于治疗动脉粥样硬化病症的组合物的方法，该方法包括将增溶剂和非亲水抗氧化剂混合。治疗包括以本发明所述的具有减少个体的血管系统中抗体酶介导的脂质氧化活性作用的组合物进行给药，由此改善或缓和动脉粥样硬化病症的症状。在一些实施方式中，本发明所述的方法可以额外包括测定样品的抗体酶介导的脂质氧化活性的步骤，所述样品得自所述治疗之前、治疗期间和/或治疗之后的个体。表格描述表1显示番茄红素的不同制剂在其抗体酶抑制活性上的效果。表2显示Rose—Blackburn调査表。表3显示lactolycopene在抗体酶介导的脂质氧化活性水平和患有冠心病(CHD)患者的罹病度上的效果。表4显示不同的番茄红素制剂，Lyc-O-Mato,在抗体酶介导的脂质氧化活性水平和患有CHD患者的罹病度上的对比效果。表5显示在引入lactolycopene(INNEOV)或Lyc-0-MatoTM的面包和烤饼食品基质的脂质氧化抗体酶活性上的对比效果。发明详述与增溶剂结合对治疗动脉粥样硬化病症有用的化合物可以通过使脂质氧化抗体酶与包含测试化合物和增溶剂的接触，和测定所述组合物对于抗体酶活性的抑制来确定。脂质氧化抗体酶(或AtheroAbzymeTM)是催化性抗体，特别是IgG分子，其结合至脂质并催化其氧化。脂质氧化抗体酶可以在响应于衣原体感染的个体中生成，并可以与衣原体细胞结合或反应，即抗体酶可以催化衣原体细胞的氧化。脂质氧化抗体酶结合并氧化衣原体细胞，例如来自于属于鹦鹉热衣原体族类的人类肺炎衣原体细胞或绵羊衣原体细胞，其包括鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体。结合并氧化衣原体细胞的抗体酶可以与宿主脂蛋白交叉反应，因此是有效的致动脉粥样化剂。适当的脂质氧化抗体酶可以从动脉粥样硬化病灶或从患有动脉粥样硬化病症的个体的血清中得到。或者，脂质氧化抗体酶可以使用普通的免疫技术得到。在一些实施方式中，所述抗体酶可以是分离型或部分分离型。用于分离和/或得到目前适于应用的脂质氧化抗衣原体抗体酶的适当方法是本领域己知的，且描述在WO03/017992、WO03/019196和WO03/019198中。下面更详细地描述脂质氧化抗体酶活性的测量。存在包含测试化合物和增溶剂的组合物时的抗体酶活性可以与不存在该组合物和任选地单独存在测试化合物时的相当的反应介质和条件中的抗体酶活性相比较。存在该组合物时相对于不存在该组合物和/或单独存在测试化合物时的活性减少，表现出测试化合物是存在增溶剂时的抗体酶活性的抑制剂。本发明描述的适用的增溶剂是亲水性化合物，即可溶于水性溶液。在一些实施方式中，该增溶剂可以不溶于有机溶剂中。适当的亲水性增溶剂包括可溶性蛋白质特别是乳蛋白质，例如干酪素、(3-乳球蛋白、a-乳清蛋白和血清白蛋白。适宜地，乳清蛋白可以用作增溶剂。乳清蛋白是通常在牛乳中发现的球状蛋白质的集合。它从乳清中分离，后者是干酪制造的副产品。它是P-乳球蛋白(65%)、a-乳清蛋白(25。/。)和血清白蛋白(8。/。)的混合物，其天然形态是可溶解的，与pH无关。乳清蛋白可从许多供应商(例如Euros6mm，法国)处买到。适当的测试化合物可以是任何非亲水性的(即两性分子或亲脂性的)小化学个体或其他分子。适当的测试化合物可以选自化合物集合和设计的化合物，例如使用组合化学。适当的测试化合物包括两亲分子或两性分子化合物，其包括一亲水部分和一疏水或亲脂部分并在水性溶液中形成自组装的胶束结构。在该胶束结构内，所述疏水性部分位于内部，所述亲水性或极性部分朝外，与极性水分子相互作用。特别适当的测试化合物包括抗氧化剂。抗氧化剂例如通过净化和清除氧化性分子种类，例如自由基，而抑制生物体内的氧化反应，从而限制这些分子种类所引起的细胞损害。胞损害。在一些实施方式中，方法可包括测定测试化合物的抗氧化剂活性并鉴定该化合物为抗氧化剂。抗氧化剂活性可以在任何适当的生物化学或生物物理学测试系统中测定。适当的测试化合物可包括非亲水抗氧化剂例如番茄红素及其类似物、盐和衍生物、除番茄红素外的类胡萝卜素、多酚、类黄酮、异黄酮、类姜黄素、神经酰胺、原花色素、萜类、甾醇、植物固醇、甾醇脂、生育三烯酚类、角鲨烯、和视黄醇类，或它们的具有抗氧化剂活性的盐、类似物或衍生物。化合物盐可以是酸式加成盐，其中所述碱保持生物有效性和所述化合物的特性，且该盐是生理学上可接受的。这种盐包括与无机酸和有机酸形成的那些盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等，所述有机酸例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、拧檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等等。在一些优选的实施方式中，该测试化合物是番茄红素化合物，例如番茄红素或具有类似于番茄红素的生物学性质的番茄红素衍生物。番茄红素是一种开链不饱和的结构为I(ChemicalAbstractsServiceRegistryNumber502-65-8)的C40类胡萝卜素，其通常存在于植物例如番茄、石榴、玫瑰果、西瓜和粉红柚中。I.番茄红素本发明描述的番茄红素可包括一种或多种不同的异构体。例如，番茄红素可包括至少10°/。、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95。/。(Z)-异构体，(所有的E)-异构体、或顺式异构体，例如5-顺式-或者9-顺式-或者13-顺式-异构体，其相对于反式异构体具有改善的生物利用度。反式异构体可在体内、或在贮藏和处理过程中异构化成顺式。例如，具有类似于番茄红素的生物学性质的番茄红素衍生物可包括类胡萝卜素例如维甲酸、合成的无环维甲酸；或l-HO-3'，4'-双脱氢番茄红素、3，1'-(HO)2个胡萝卜素、l,l'-(HO)2-3,4，3',4'-四脱氢番茄红素，和U'-(HO)2-3,4-双脱氢番茄红素。本发明描述的番茄红素化合物可以是天然的，即得自天然来源的，例如，从例如番茄或甜瓜的植物中提取。一系列从植物中提取、浓縮和/或提纯番茄红素化合物的方法是本领域已知的。例如，可以使用利用乙醇、DMSO、乙酸乙酯、己烷、丙酮、大豆或其他植物油或非植物油的溶剂提取法。本发明描述的番茄红素化合物可以是合成的，即通过人工手段例如通过化学合成生成。方法化学合成番茄红素及其他类胡萝卜素的方法是本领域己知的。例如，可以使用用于类胡萝卜素合成的基于标准Wittig烯化作用反应流程的三步骤化学合成法，其中生成二氯甲垸(DCM)的C,5甲垸磺酸辚的有机溶液及甲苯的C,o二醛的有机溶液，且该两种有机溶液是逐渐与甲醇钠溶液结合并经历縮合反应以形成番茄红素粗品。然后，使用常规技术纯化所述粗的番茄红素，例如通过添加冰醋酸和去离子水至所述混合物中，剧烈搅拌，使水相和有机相分离，并提取出含有DCM和水中的番茄红素粗品的有机相。将甲醇添加至有机相中，且DCM在减压下经过蒸馏法去除。然后加热所述粗品甲醇番茄红素溶液，并冷却至结晶浆液，用甲醇滤过和洗涤该浆液。然后，所述番茄红素晶体重结晶并在热氮下干燥。合成的番茄红素也可以从供应商(例如BASFCorp，NJUSA)获得。相对于天然的番茄红素，合成的番茄红素可以包括比例增加的顺式异构体的。例如，合成的番茄红素可达25%的5-顺式、1°/。的9-顺式、1%的13-顺式和3%的其他顺式异构体，而通过番茄生成的番茄红素可能是3-5%的5-顺式、0-1°/。的9-顺式、1%的13-顺式和<1%的其他顺式异构体。由于相对于反式的番茄红素，顺式的番茄红素的生物利用度增加了，因此在一些实施方式中，优选合成的番茄红素。上述的番茄红素衍生物可以通过类似于上述的合成法的化学合成法生成，或通过化学修饰从植物物质提取的天然的番茄红素生成。在优选的实施方式中，所述非亲水的抗氧化剂番茄红素与乳清蛋白一起配制。具有乳清蛋白(称为'lactolycopene，)的番茄红素制剂在本领域是已知的(例如见RicheUe等J.Nutr.l32:404-408，2002禾QPCT/EP01/06145)和市场上可买到的(INNEOV，L，0r6al(UK)Ltd,London)。lactolycopene可以通过这些文献所述的方法或本发明描述的方法得到。在一些优选的实施方式中，测试化合物由于当不存在增溶剂时，对抗体酶活性无效或基本无效而被确定。可加入用于本发明方法的组合物的测试化合物的量通常通过依赖于所使用的化合物类型的试错法而确定。典型地，可以使用浓度为约0.01至100nM的假定抑制剂化合物，例如从0.1至10nM。所述组合物可包括0.05至50wt。/。的测试化合物和5至90wt。/。的增溶剂。所述增溶剂和测试化合物可以1:1至1000:1，优选2:1至250:1，更优选约3:1至20:1的重量比存在。可以使用的测试化合物可以是用于药物筛选程序的天然的或合成的化合物。可以使用包含若干表征的或非表征的成分的植物提取物。所述增溶剂和抗氧化剂可以彼此混合到组合物中或可以直接或间接连接于该组合物内(例如以缀合物形式)。例如，所述增溶剂和抗氧化剂可以通过共价键例如使用标准化学技术通过一个或多个共价键连接或非共价键例如通过抗原/抗体结合连接。例如，可以通过将测试化合物溶解在溶剂中，并使该溶液与可溶蛋白质(例如乳蛋白质)混合而制备组合物，所述可溶蛋白质可以是固态或溶于水性溶液中。所述测试化合物可以溶解在任何药学上相容的溶剂中。所述溶剂优选丙酮、乙醇或异丙醇。当水性的蛋白质溶液与所述溶剂混合时，选择溶剂/水的体积比约为60/40。混合后，所述混合物可在比室温略高的温度下放置30至60分钟。然后，蒸发所述溶剂，生成乳剂或分散体形式的组合物。可以使用减压(例如200至300mbar)方便地完成蒸发。然后可以进一步处理所述组合物，例如通过干燥以生成粉末或通过热处理以生成凝胶。所述脂质氧化抗体酶的活性，包括脂质过氧化活性，可以通过测定脂质的氧化来测定，所述脂质可以是来源于外部抗原例如衣原体细胞的脂质，或是来源于另外来源的脂质，例如，其可作为测定法的部分附加。可以测定氧化产物或副产物例如共氧化偶联报道分子的聚集，或底物例如非修饰的脂质或共底物例如氧的消失或消耗。用于确定脂质过氧化的许多方法是本领域己知的，例如，在CRCHandbookofMethodsforOxygenRadicalResearch,CRCPress,BocaRaton,Florida(1985),OxygenRadicalsinBiologicalSystems.MethodsinEnzymology，v.186，AcademicPress,London(1990);OxygenRadicalsinBiologicalSystems.MethodsinEnzymology,v.234,AcademicPress,SanDiego,NewYork,Boston,London(1994);以及FreeRadicals.Apracticalapproach.IRLPress,Oxford,NewYork,Tokyo(1996)中有描述。在优选的实施方式中，可以通过测定脂质氧化产物的生成(即存在或量)来测定抗体酶脂质氧化活性，所述脂质氧化产物包括乙醛例如丙二醛(MDA)、(脂质)过氧化物、共轭双烯或气态烃。脂质氧化产物可以通过任何适当的方法测定。例如，脂质过氧化产物可以使用HPLC(Brown,R.K.，andKelly,F.JIn:FreeRadicals.Apracticalapproach.IRLPress,Oxford,NewYork,Tokyo(1996)，119-131)、紫外光谱法(Kinter，M.Quantitativeanalysisof4-hydroxy-2-nonenal.Ibid.l33-145)，或气相色谱法-质量光谱法(Morrow,J.D.，andRoberts,L.J.F2-Isoprostanes:prostaglandin-likeproductsoflipidperoxidation.Ibid.147-157)测定。例如，与2-硫代巴比妥酸(方便地在lmM)反应后，丙二醛(MDA)的制备可以通过在适当的波长例如525nm处测量吸光率来测定。WO03/017992,WO03/019196和WO03/019198中更详细地描述了抗体酶活性的测定。抗体酶活性也可以使用如GB0503940.9所描写的免疫技术来测定。抗体酶活性的抑制可以使用所述抗体酶在不存在阳性测试剂的情况下氧化脂质的条件来鉴别。这种化合物可以例如在治疗动脉粥样硬化病症中用作抑制脂质氧化抗体酶功能的试剂。具有抑制抗体酶活性的能力的组合物可以进一步使用一种或多种次级筛选来评估。次级筛选可包括在血管系统中测试抗体酶活性，或例如在动物模型中测试抗体酶的生物学功能。可以在次级筛中评估的适当的生物学功能包括动脉粥样硬化病灶尺寸或数量的减小，或其他症状的减少或对动脉粥样硬化紊乱例如血压的影响。本发明方法可包括确定包含测试化合物和增溶剂的组合物作为抑制抗体酶活性的组合物。所述确定的组合物可以是合成的或制造的。任选地，本发明所述的作为抗体酶抑制剂确定的组合物可以被修饰至优化活性或提供其他有利的特性，例如给药至个体时增加半衰期或降低副作用。用于修饰先导化合物的技术和策略在本领域为大家所熟知。本发明描述的包含番茄红素化合物例如番茄红素和增溶剂例如乳清蛋白的组合物可以用于治疗人体或动物体，特别是用于治疗动脉粥样硬化病症。这种组合物可用于制备用于治疗动脉粥样硬化病症的药物。治疗动脉粥样硬化病症的方法可包括将包含番茄红素化合物例如番茄红素和增溶剂例如乳清蛋白的组合物给药至需要它的个体。动脉粥样硬化病症包括动脉硬化症和/或一种或多种其临床并发症或相关的心血管病症，例如高血脂症；缺血性(冠状)心脏病；心肌局部缺血(心绞痛)；心肌梗死；动脉瘤疾病；动脉粥样化的外部血管疾病；aortoiliacdisease;慢性和严重的下肢局部缺血；内脏局部缺血；肾动脉疾病；脑血管疾病；中风；动脉粥样硬化视网膜病变；凝血状态紊乱；血栓和异常凝血；和高血压。这种病症可以是医学或兽医学病症。可以是本发明方法的受试者的个体包括人类和非人类动物，包括家畜例如狗、猫、马和鹦鹉，农畜例如绵羊和牛和罕有或稀有动物例如象和虎。除非另有特殊规定，本文所述的'人类'应该理解为包括'非人类动物，。治疗或疗法指本发明化合物的任何给药，其意欲减轻受试者的动脉粥样硬化病症的严重程度，且包括意欲治愈该疾病、减轻该疾病症状和阻止或中止处于发展该疾病的危险中的个体或显示该疾病的发展的症状的个体中该疾病的发展或开始。本发明所述的确定的组合物可以与如下所述的药学上可接受的赋形剂一起配制。这种组合物可以给药至个体。组合物可以任何适当的途径和给药手段配制。药学可接受的载体或稀释剂包括适合用于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌注、静脉、皮内、鞘内和硬膜外)给药制剂的那些。所述制剂可以方便地以单位剂型存在，且可以通过任何制药领域中众所周知的方法制备。这种方法包括使所述活性成分与构成一种或多种辅剂的载体结合。一般而言所述制剂通过使所述活性成分均匀地且紧密地与液体载体或精细粉碎的固体载体或这两者结合，然后，必要时，形成所述产品。对于固体组合物，例如，可以使用常规的非毒性固体载体包括药用等级的甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。如上定义的所述活性物质可以用例如聚二醇、乙酰化甘油三酸酯等作为栓剂配制。例如，液体的药学上可处理的组合物可以通过将如上定义的活性物质和任选的药用辅剂溶解、分散(等等)在载体中，因而形成溶液或悬浮液来制备，所述载体例如为水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等。如果需要，要给药的所述药用组合物也可包括微量的非毒性辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如，乙酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺酯等。制备这种剂型的现行方法是已知的，或对本领域的技术人员来说是显而易见的；例如，见"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy",20thEdition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins。无论如何，要给药的所述组合物或制剂将包含一些有效量的活性物质以减轻正在治疗的受试者的症状。可以制备包含0.25至50°/。的活性成分的剂型或组合物，余量由增溶剂和非毒性载体组成。对于口服，药用可接受的非毒性组合物由加入任何通常使用的赋形剂而形成，所述赋形剂例如为药用等级的甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、交联羧甲纤维素钠、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。这种组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放制剂等的形式。这种组合物可包括1%-50%的活性成分，更优选2-50%，最优选5-8%。肠胃外给药通常以注射为特征，所述注射为皮下注射、肌注或静脉注射。血管注射剂可以常规剂型制备，所述常规剂型为液体溶液或悬浮液、在注射之前适于溶液或悬浮液的固体剂型、或乳剂。例如，适当的赋形剂是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等。另外，如果需要，所述要给药的药物组合物也可以包括微量的非毒性辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如，乙酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺酯、三乙醇胺乙酸钠等。最近设计的用于肠胃外给药的方法使用缓慢释放或持续释放系统的植入物，这样可保持恒定水平的剂量。例如，见美国专利No.3，710,795。包含在这种亲本组合物中的活性物质的百分比高度取决于其特殊性质，以及所述化合物的活性和受试者的需要。然而，溶液中0.1%至10%的活性成分的百分比是有益的，且如果该组合物是固体，随后将稀释至上述百分比，则该百分比将稍高。将用于给药的所述化合物或其盐的有效量最终由医生判断，考虑特殊受试者(例如人类患者或动物模型)的疾病的严重程度和该受试者的总体条件。典型地，适当的剂量范围为0.01至20mg/kg/天，优选0.1至10mg/kg/天。重复剂量可以适当的间隔给药，例如每日、每半周、每周或每月一次或两次。用于治疗动脉粥样硬化病症的非亲水抗氧化剂例如番茄红素和增溶剂例如乳清蛋白的制剂可以包含在食物产品中。例如，它可以包含在面包、谷物、饼干、奶油、涂抹食品(例如人造黄油)、奶酪、酸乳、饮料或宠物食品例如罐装或干燥的猫或狗的食品中。其他适当的食品对本领域技术人员而言将是显而易见的。所述制剂可以在烹制(例如烘焙)前与食物产品组分混合和/或在蒸煮后被加到食物产品中。本发明所列结果表明，制剂加入食物产品不会引起食物产品质量的损失，且被蒸煮入食物产品后保持活性。优选地，包含在所述食物产品中的番茄红素化合物是外源番茄红素化合物。例如，所述番茄红素化合物可以是通常不存在于所述食物产品中的如上所述的合成的番茄红素化合物，或天然的番茄红素化合物。例如，源自水果蔬菜的番茄红素化合物可以加入面包或谷物中。因此，本发明的另一方面是一种食物产品，其包含用于治疗动脉粥样硬化病症的番茄红素化合物，其中所述番茄红素化合物通常不存在于该食物产品中。还提供一种制造用于治疗或延迟或预防动脉粥样硬化病症的开始的食物产品的方法，所述方法包括(i)提供食物产品组分，(ii)将番茄红素化合物与所述组分混合，(iii)将所述组分和所述番茄红素化合物配制入食物产品中。食物产品的组分是常用食料，例如用来生成食物产品的面粉、肉类、蛋、胶质、奶、盐、防腐剂和水。用于本方法的适当的食品组分是本领域已知的。鉴于本发明的公开，本发明的各种方面和实施方式对本领域技术人员而言将是显而易见的。本说明书提及的所有文献在此以引用方式全部合并。现在以实施例方式并参考如下所述的表格说明本发明的某些方面和实施方式。具体实施方式临床资料在俄罗斯联邦的Rostov-na-Donu医科大学的Cardio血管手术中心的腹主动脉狭窄的旁路手术期间，从53和64岁的两名男性患者中得到的人类主动脉的晚期动脉粥样硬化病灶中提取出抗体。这些样品回收后，立即放入30%w/v的NaCl溶液中，试验之前在0-4'C下贮藏1个月。对照实验表明，在这期间，这种酶的活性，如胰蛋白酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、肌酸激酶和乳酸脱氢酶的活性，连同免疫球蛋白(IgG)片断的水平和脂质过氧化的程度没有明显改变。将主动脉块(湿重约200-400mg)切成每片约10mg，放入5.0ml的带有1%非离子型去垢剂lgepalCA-630的PBS中，并由机械匀浆器(Ultra-Turrax)在全功率下用15mm探针匀化三次，每次3秒，两次之间有着20秒的冷却间隔。混匀之后，在5000g下离心10分钟，分离不可溶组分，上清液用于分析。富含动脉粥样化IgG的抗体酶的提取从4名不同患者得到的腹主动脉的二片病灶中单独地提取并分析所述抗体。第一步是将A蛋白附着于交联的4%珠状琼脂糖的上清液在37。C下处理30分钟。然后，附着于所述小珠的免疫球蛋白片段在5000g下旋转10分钟。轻轻倒出上清液。为了除去附着于沉积的免疫球蛋白上的任何脂蛋白，用10。/。的IgepalCA-630再悬浮所述样品。然后，它们在5000g下离心10分钟并轻轻倒出上清液。为除去去污剂，随后在经相同方式离心的过量的磷酸缓冲液中进行三次洗涤。该免疫球蛋白片段上不存在胆固醇，证实了脂蛋白从免疫球蛋白片段上的去除。抗-抗体酶活性的测试在动脉粥样化提取的IgG的存在下，人类血清样品与不同浓度的番茄红素、番茄红素/乳蛋白质共轭或单独(对照样品)在37°C、pH5.6下培养16小时。脂质过氧化水平被评估为MDA浓度水平，所述浓度通过分光光度法[Draper,H.H.etalFreeRadic.Biol.Med.(1993)15,353]测定。该方法基于丙二醛与硫代巴比妥酸反应时显色产品的形成。简要而言，样品中抗体酶水平如下测定乳清样品用pH4.0的0.05M的乙酸酯1:1稀释，使得这些样品的最终pH为5.6-5.8。990^1的稀释血清与1(^1的商业活绵羊衣原体疫苗(Intervet)混合。将样品在37'C下培养过夜(12-16小时)。将250pl的40%三氯乙酸和250|id的lmM的2-硫代巴比妥酸加入每份样品中。将所有样品置于水浴中并沸腾30分钟。冷却样品，在3，000g下离心IO分钟。收集上清液，在入525nm处测量其吸收，以测定丙二醛(MDA)的浓度，其为脂质过氧化的产物。基于ELISA的抗体酶试验使用Medac材料和反应物进行ELISA试验，所述材料和反应物根据制造商说明使用。简要而言，对来自患者的血清样品进行如上所述的处理。将50)Lil的样品稀释剂用移液管移入微量测试孔A1作为空白，以及将50W的阴性对照、阳性对照和稀释的患者样品用移液管移入其他的微量测试孔。在潮湿的腔室中，所述微盘孔在37。C(土rC)下培养60分钟(土5分钟)，然后用200pl洗涤缓冲液洗涤每个孔三次。然后将50pl的共轭物加入每个孔中，在潮湿的腔室中，所述微盘孔再次在37。C(士rC)下培养60分钟(士5分钟)。将5(^1的TMB-底物加入每个孔中，在潮湿的腔室中，所述微盘孔在37。C(士rC)下培养30分钟(士2分钟)。通过往每个孔中添加lOO)il的停止溶液终止该反应。添加所述停止溶液后的15分钟之内，在450nm(参考620-650nm)处进行光度读数。为计算结果，从所有其他的OD值中减去空白OD值(LAl)。优选地，空白OD值<0.150，阴性对照的平均OD值<0.100，阳性对照的OD值>0.800。切断-阴性对照的平均OD值+0.380。灰区=切断±10%。番茄红素制剂。番茄红素-乳蛋白质组合物的制备如US20020107292所述。简要而言，将13.3kg的乳清蛋白分离物溶解在3301的软化水中，所述混合物在25-3(TC下搅拌6小时。分别地，将包含6%的番茄红素的550g的LycorecTM油性树脂(LycoRedCorpNJUSA)混合于4381的丙酮中并搅拌该混合物。随后将该两种溶液在30'C混合60分钟。适度加热最终混合物，在中等压力下去除丙酮。最后，在40-50mbar的压力下部分去除水。得到200kg乳清蛋白分离物和油性树脂的水性溶液，随后使其喷雾干燥。Rose-Blackburn调查表。Rose-Blackburn调查表是用于评估心绞痛的严重程度的工具。与疾病的严重程度有关的一系列七个重要的主体和客体标准被评估并转变为数字得分。如果患者具有相关症状，则给予每个标准l-4分，或如果他们不具有相关症状，则为0。所有七种症状的得分总和提供该患者的Rose-Blackburn得分。最高得分是28。结果体外试验分析番茄红素制剂的如上所述的抗体酶抑制活性，结果列于表1。发现番茄红素(L9879:Sigma)作为抗体酶抑制剂在ELISA和脂质氧化试验两者中均无效。发现包含番茄红素和乳蛋白质两者(乳番茄红素制备INNEOV)的组合物是抗体酶活性的高度有效的抑制剂。还发现番茄红素提取物Lyc-O-Mato(LycoRedCorpNJUSA)抑制抗体酶活性，但是其IDso比乳番茄红素高3.5倍。临床试验在治疗冠心病(CHD)的初步临床试验中评估两种番茄红素制剂，乳番茄红素和Lyc-O-MatoTM。总共十七名45-60岁的患有CHD的AtheroAbzymeTM阳性患者应征用于该试验。包括7位女性和7位男性患者的第一组中，每日以2-3颗糖衣丸的番茄红素给药，并提供4-6mg的番茄红素的食品。包括1位女性和2位男性患者的第二组中，每日以Lyc-O-Mato的1个胶囊剂给药，并提供15mg番茄红素的食品。每组的治疗持续2个月。在治疗开始之前，要求患者完成Rose-Blackburn调査表(表2)以提供该疾病严重程度的测量。2个月后重复所述调查表，也测定AtheroAbzyme活性。用乳番茄红素/INNEOV治疗2个月后，所有十四位患者中AtheroAbzymeTM活性减少到不可检测的水平(表3)。十四位患者中的十三位显示出临床改善，通过Rose-Blackburn调查表中的分数减少了25%测定。在第二组患者中，给药Lyc-O-Mato两个月导致AtheroAbzymeTM水平降低，但是仍可检测出(表4)。患者的临床症状也略微地改善，但是程度比第一组的较少Rose-Blackburn调查表上得分的9%。初步临床试验的结果表明，乳番茄红素制剂的效力不仅是在体内抑制抗体酶而且改善CHD患者的症状。番茄红素加入食物基质中。加入面包。一种面包块的配方为酵母3/"sp、强白面粉-400g、糖-ltsp、奶油-15g、奶粉-ltsp、盐-ltsp、水280ml，其中溶解有乳番茄红素(LL)(INNEOV)糖衣丸、或Lyc-0-MatoTM胶囊剂(LM)。烘焙七个面包一个(对照)不包含番茄红素制剂，第二个包含5个LL糖衣丸，第二个包含5个LL糖衣丸，第三个-10个LL糖衣丸，第四个-20个LL糖衣丸，第五、第六和第七个包含的番茄红素的量来自相当于那些含有LL的面包的Lyc-0-MatoTM、LM、胶囊剂。测试五位测试这些盲-交叉面包的志愿者没有发现所有4个这些面包在质地或口味上有差异。此外，测试抑制面包的脂质氧化抗体酶的活性的能力。这是使用AtheroAbzymeELISAkit(CTL，UK)，按照列于制造商说明书中的方案进行的。包含乳番茄红素的面包具有明显的抗抗体酶活性，而包含Lyc-0-Mat0TM、LM的面包或对照组面包不具有抗抗体酶活性(表5)。加入烤饼。一批4个烤饼的配方是自发酵面粉175g、发酵粉-ltsp、盐撮、细晶糖-20g、不加盐的奶油-37g、奶-90ml，其中溶解有INEOV糖衣丸形式的LL。烘焙七批烤饼一批(对照)不包含番茄红素制剂，第二批每个烤饼包含0.5个LL糖衣丸，第三批-每个烤饼1个LL糖衣丸，第四批-每个烤饼2个LL糖衣丸，第五、第六和第七批包含的番茄红素的量来自相当于那些含有LL的面包的Lyc-0-Mato、LM、胶囊剂。五位测试这些盲交叉烤饼的志愿者没有发现所有这4批烤饼在质地或口味上有差异。此外，测试抑制烤饼的脂质氧化抗体酶的活性的能力。这是使用AtheroAbzymeELISAkit(CTL，UK)，按照列于制造商说明书中的方案进行的。包含乳番茄红素的烤饼具有明显的抗抗体酶活性，而包含LyC-0-Mat0TM、LM的烤饼或对照组烤饼不具有抗抗体酶活性(表5)。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*统计显著差异表3<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表4会口頁口口基质包含下述成分的lg食物基质的抗氧化剂活性<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>权利要求1.治疗动脉粥样硬化病症的方法，包括将增溶剂和非亲水抗氧化剂给药至需要它的个体。2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗氧化剂是番茄红素化合物。3.如权利要求2所述的方法，其中所述番茄红素化合物是番茄红素。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述增溶剂包括一种或多种亲水多肽。5.如权利要求5所述的方法，其中所述增溶剂包括一种或多种乳蛋白质。6.如权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种乳蛋白质包括P-乳球蛋白、a-乳清蛋白和血清白蛋白。7.如权利要求6所述的方法，其中所述增溶剂是乳清蛋白。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述增溶剂和非亲水抗氧化剂包含在食物产品内。9.如权利要求8所述的方法，其中所述食物产品是面包、谷物、饼干、奶油、涂抹食品、奶酪、酸乳、宠物食品或饮料。10.包含增溶剂和非亲水抗氧化剂的组合物用于治疗动脉粥样硬化病症。11.如权利要求10所述的组合物，其中所述抗氧化剂是番茄红素化合物。12.如权利要求11所述的组合物，其中所述番茄红素化合物是番茄红素。13.如权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中所述增溶剂包括一种或多种亲水性多肽。14.如权利要求13所述的组合物，其中所述增溶剂包括一种或多种乳蛋白质。15.如权利要求14所述的组合物，其中所述增溶剂包括P-乳球蛋白、oc-乳清蛋白和血清白蛋白。16.如权利要求15所述的方法、组合物或应用，其中所述增溶剂是乳清蛋白。17.如权利要求10至16中任一项所述的组合物，其包含在食物产品内。18.如权利要求17所述的组合物，其中所述食物产品是面包、谷物、饼干、奶油、涂抹食品、奶酪、酸乳、宠物食品或饮料。19.包含增溶剂和非亲水抗氧化剂的组合物在制备治疗动脉粥样硬化病症的药物中的应用。20.如权利要求19所述的应用，其中所述抗氧化剂是番茄红素化合物。21.如权利要求20所述的应用，其中所述番茄红素化合物是番茄红素。22.如权利要求19至21中任一项所述的应用，其中所述增溶剂包含一种或多种亲水多肽。23.如权利要求22所述的应用，其中所述增溶剂包括一种或多种乳蛋白质。24.如权利要求23所述的应用，其中所述增溶剂包括P-乳球蛋白、a-乳清蛋白和血清白蛋白。25.如权利要求24所述的应用，其中所述增溶剂是乳清蛋白。26.如权利要求19至25中任一项所述的应用，其中该组合物包含在食物产品内。27.如权利要求26所述的应用，其中所述食物产品是面包、谷物、饼干、奶油、涂抹食品、奶酪、酸乳、宠物食品或饮料。28.制备用于治疗动脉粥样硬化病症的组合物的方法，该方法包括使非亲水抗氧化剂与增溶剂混合。29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述测试化合物是非亲水抗氧化剂。30.如权利要求29所述的方法，其中所述抗氧化剂是番茄红素化合物。31.如权利要求30所述的方法，其中所述番茄红素化合物是番茄红素。32.如权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述增溶剂包含一种或多种亲水多肽。33.如权利要求32所述的方法，其中所述增溶剂包括一种或多种乳蛋白质。34.如权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种乳蛋白质包括卩-乳球蛋白、a-乳清蛋白和血清白蛋白。35.如权利要求34所述的方法，其中所述增溶剂是乳清蛋白。36.鉴别和/或得到抑制脂质氧化抗体酶的组合物的方法，该方法包括将脂质氧化抗体酶与包含测试化合物和增溶剂的组合物接触，和测定所述组合物对抗体酶活性的抑制。37.如权利要求36所述的方法，其中抗体酶活性的抑制指示所述组合物对治疗动脉粥样硬化病症有用。38.如权利要求36或37所述的方法，包括使脂质氧化抗体酶与测试化合物接触，和测定所述化合物对抗体酶活性的抑制。39.如权利要求38所述的方法，其中所述测试化合物在不存在增溶剂的情况下不抑制抗体酶活性。40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，包括配制所述测试化合物和增溶剂以生成所述组合物。41.如权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述测试化合物是非亲水性抗氧化剂。42.如权利要求41所述的方法，其中所述测试化合物选自类胡萝卜素、多酚、类黄酮、异黄酮、类姜黄素、神经酰胺、原花色素、萜类、甾醇、植物固醇、甾醇脂、生育三烯酚类、角鲨烯或视黄醇类。43.如权利要求41所述的方法，其中所述测试化合物选自番茄红素、维甲酸、合成的无环维甲酸；或l-HO-3'，4'-双脱氢番茄红素、3,1'-(HO)2-y-胡萝卜素、U'-(HO)2-3，4，3',4'-四脱氢番茄红素，或l,l'-(HO)2-3，4-双脱氢番茄红素。44.如前任一权利要求所述的方法，其中所述增溶剂包括一种或多种亲水性多肽。45.如权利要求45所述的方法，其中所述增溶剂包括一种或多种乳蛋白质。46.如权利要求45所述的方法，其中所述一种或多种乳蛋白质包括P-乳球蛋白、(x-乳清蛋白和血清白蛋白。47.如权利要求46所述的方法，其中所述增溶剂是乳清蛋白。48.如权利要求36至47中任一项所述的方法，包括鉴定该组合物为脂质氧化抗体酶抑制剂。49.增加非亲水性抗氧化剂抑制脂质氧化抗体酶的能力的方法，包括:将测试化合物与增溶剂混合，以生成组合物。50.如权利要求49所述的方法，其中所述抗氧化剂是番茄红素化合物。51.如权利要求20所述的方法，其中所述番茄红素化合物是番茄红素。52.如权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述增溶剂包含一种或多种亲水多肽。53.如权利要求52所述的方法，其中所述增溶剂包括一种或多种乳蛋白质。54.如权利要求53所述的方法，其中所述增溶剂包括(3-乳球蛋白、a-乳清蛋白和血清白蛋白。55.如权利要求54所述的方法，其中所述增溶剂是乳清蛋白。全文摘要本发明涉及制剂在治疗动脉粥样硬化病症中的应用，所述制剂包含两性分子或亲脂性的抗氧化剂，例如番茄红素，和增溶剂，例如乳清蛋白。提供使用这种制剂治疗动脉粥样硬化病症的方法和材料。文档编号A21D2/10GK101227836SQ200680026549公开日2008年7月23日申请日期2006年7月14日优先权日2005年7月21日发明者伊万·派特伊夫申请人:剑桥塞拉诺斯迪克斯有限公司