专利名称：Cpt基因芯片及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因芯片，尤其涉及一种基于ZipCode序列的CPT基因芯片;此外， 本发明还涉及该基因芯片的检测方法与应用。
技术背景基因芯片是人类基因组计划带来的最具应用价值的科研成果，它融合了生命科 学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生命信息学等多种学科的最新技术。 随着微加工技术的发展，高密度寡核苷酸芯片最高密度可达上百万个探针，因此基因 芯片通量水平并不受芯片技术本身制约，而是受样本的处理和基因芯片设计方法的限 制。高通量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)芯片在临床 诊断中的应用，仍有赖于DNA处理、芯片设计等方面的发展。直接用基因组DNA进行SNP分型显然可以避开DNA扩增这一问题，并能同时对几 百万的SNPs进行分型。低等生物的基因组复杂性较低，已成功地利用芯片直接对基 因组DNA进行了多态分析，这些生物包括酵母(基因组DNA约为12Mb)和拟南芥(基因 组DNA约为120Mb)。然而，人类基因组DNA虽已成功地应用于cDNA、 BAC和寡核苷酸 芯片比较基因组杂交(comparative genomic hybridization, CGH)芯片(Ishkanian AS， Malloff CA， Watson SK， et al. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nat Genet. 2004; 36: 299-303),但由 于人类基因组DNA的高度复杂性，直接进行SNP分析的难度显然要高于低等生物，从 约30亿碱基对序列中鉴别一个SNP仍是一项艰巨的挑战工作。通过近几年的研究， 已有几种技术可以对人类基因组DNA进行SNP分型，包括胶体金检测技术、侵入切割 (invasive cleavage)、侵入切割结合滚环扩增(rolling circle amplification) 和等位基因特异性引物延伸法(allele-specific primer extension)结合信号级联 放大等技术，但这些技术普遍存在DNA用量大、信噪比低、操作复杂或低多重水平等 缺点，它们在疾病基因组学和药物基因组学等领域和临床诊断方面的应用，尚有待于 进一步的发展和完善。另一方面，人类基因组约有2-2.5万个基因，涵盖这些人类基 因组所有的基因和表达序列标签对于目前的表达谱芯片技术虽然简单，但却往往无法检测出表达水平低下的基因，即使应用RNA线性扩增技术也无法解决。提高探针长度 可在一定程度上提高检出率，然而探针长度增加的同时，探针局部序列的特异性也大 为降低，从而造成假阳性率大为增高。鉴于核酸扩增技术不足以解决基因表达谱和SNP芯片存在的问题，如何放大荧光信号将是提高芯片检测能力的关键所在。级联放大由 于放大倍数有限，显然不如侵入切割，这也反应在基于这两种技术的基因组DNA直接 进行SNP分型所用的DNA量(GundersonKL， Steemers FJ, Lee G, et al. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat Genet. 2005; 37: 549-54)。侵入切割对靶DNA序列的检测是通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)来实现。它高效的信号放大作用使得基因组DNA 不经扩增可直接进行SNP分型，但最大的缺陷是信噪比低下，并且探针设计较为复杂， 其在SNP芯片中的最终应用尚有待于进一步发展和完善。循环探针技术(cycling probe technology, CPT)是另一种对靶DNA信号进行放大 的技术(DuckP, Alvarado-Urbina G, BurdickB， et al. Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotides. Biotechniques. 1990; 9: 142-8)。 CPT探 针为一含DNA-RNA-DNA的嵌合体，长约25-30个碱基，内含4-6个连续的嘌呤核苷酸。其 原理是在等温反应中，探针与单链靶DNA序列杂交后，在核糖核酸酶H (RNase H)的作 用下，DNA-RNA-DNA探针中的RNA部分被特异性切割。RNase H是一种核糖核酸内切酶， 它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的 RNA链，该酶不能消化单链RNA、单链或双链DNA。由于酶切后的探针片段的退火温度远 低于反应温度，切割后的CPT探针的两端DNA部分也随之从靶DNA序列上脱落下来，使得 靶DNA序列又可以与完整的探针结合，从而提高了耙DNA序列的使用率。因此，每条耙DNA 序列能与许多条完整探针杂交结合，从而产生很多切割的探针片段，其量随着时间而堆 积，呈线性扩增。通过结合凝胶电泳或免疫学检测分析，CPT已被成功地应用于细菌及 耐药检测。由于CPT具有线性扩增的特性，在探针的两端DNA序列分别标记上荧光基团和 淬灭基团，就可对荧光信号进行放大，达到实时定量检测的目的。并且RNase H对 DNA-RNA-DNA探针的切割存在着序列依赖性，只有RNA部分与耙DNA序列完全匹配的探针 才能被切割，因此CPT也可用于SNP检测。与侵入切割一样，CPT最大的特点就是不需要这种链式的扩增反应，它们是对DNA 或者RNA的信号进行扩增。并且由于不需要链式扩增过程，整个反应过程只要控制在探针的退火温度，不需要像PCR那样反复升温、降温，因此可以节省很多时伺。并且CPT 与PCR不同，它们不是放大的靶DNA序列被检测，因此可减少由于PCR自身污染造成的假阳性。只有当特异的DNA存在时，这种方法才能使信号分析累积，并可用多种仪器检测。 相比于侵入切割，CPT仅设计一条序列特异性探针或两条等位基因特异性探针，设计较 为简单，所能检测的基因序列更多。另一方面，在侵入切割中，酶切后的探针片段中能 与靶DNA序列互补的序列长度仅比完整的探针少一个碱基，探针片段和完整的探针与耙 DNA序列的退火与分离的动力学基本一致，两者与靶DNA序列的结合存在着竞争。而CPT 探针与靶DNA序列结合后，是被RNaseH从中间部分切开，酶切后的探针片段的退火温度 远低于反应温度，脱落的探针片段不太可能再结合到靶DNA序列上，这使得CPT的信号放 大效应远高于侵入切割。因此，若将CPT应用于基因芯片中，产生的信噪比将明显优于 侵入切割，能大幅提高低表达基因的检出率，并降低基因组DNA直接进行SNP分型的难度， 更加适用于高通量、大规模的核酸检测。当前SNP芯片和表达谱芯片的技术已较为完善，但远不能满足生物医学研究和 临床检测诊断所需。在不影响准确率的情况下，如何提高表达水平低下的基因的表达 谱芯片检出率，如何将基因组DNA以最少的量直接应用于SNP芯片检测， 一直是当今 基因芯片技术的难点所在。虽然核酸扩增或级联放大能在一定程度上提高荧光信号， 但这些技术不能根本性解决这些问题，并且操作相对较为复杂。通过改变传统的每个 靶DM序列只与一条探针杂交的策略，从增加每条靶DM序列所能杂交的探针数目来 提高每条靶DNA序列的使用率，以达到放大荧光信号的目的。其高效的信号放大效应， 不仅使样本不需任何放大或扩增处理即可用于芯片杂交检测，而且能使基因组DNA更 易于直接进行芯片检测，大幅提高表达谱芯片中表达水平低下的基因的检出率。发明内容本发明要解决的技术问题之一是提供一种CPT基因芯片，该芯片可有效放大检测 信号，从而显著提高表达谱芯片中表达水平低下的基因的检出率。本发明要解决的技术问题之二是提供一种应用上述基因芯片进行检测的方法。 本发明要解决的技术问题之三是提供上述基因芯片在临床检测中的应用。 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现 在本发明的一个方面，提供了一种CPT基因芯片，包括DNA-RNA-DNA探针和固定 在固相载体上的Zip探针，所述DNA-RNA-DNA探针一端的DNA片段末端连接有与Zip探针互补的ZipCode序列。所述DNA-RNA-DNA探针可在连接有ZipCode序列的一端DNA片段上标记有荧光基 团，并在另一端DNA片段上标记有淬灭基团。所述DNA-RNA-DNA探针可在连接有ZipCode序列的一端DNA片段上不标记荧光或淬 灭基团，在另一端DNA片段上进行标记，该标记包括荧光素标记、生物素标记、放 射性元素标记、电化学发光标记和酶标记。本发明中所述固相基质可选用本领域周知的基质，只要所述基质与所述反应物相 容，不会影响检测结果就可以。所述DNA-RNA-DNA探针的序列与靶DNA序列互补，优选该探针的RNA序列与靶DNA序 列完全互补，该探针的RNA序列与探针任何序列的连续互补碱基数不超过3个。所述DNA-RNA-DNA探针的退火温度为37 75t 。所述DNA-RNA-DNA探针序列可包含1 10个错配碱基，较佳地，可包含1 5个 错配碱基，更佳地，可包含1 2个错配碱基。本发明基因芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自阴性对照探针、 阳性对照探针和固定化对照探针。在本发明的另一方面，提供了一种应用上述基因芯片进行检测的方法，包括如下 步骤(1) 获取待测样品核酸；(2) 将上述的DNA-RNA-DNA探针和待测样品核酸在含RNase H酶的溶液中进行酶 切，并使其反应足够时间；(3) 在适于与所述Zip探针进行杂交的条件下，在固定有该Zip探针的芯片上加 入含步骤(2)酶切产物的杂交液，并使其反应足够时间；(4) 洗涤后检测杂交反应的结果。本发明中的RNase H酶包括耐高温和不耐高温RNase H酶，耐高温RNase H酶在 变性前后均可加入，而不耐高温RNase H酶在变性冷却后加入。所述的杂交温度为25"C 72'C，所述杂交时间为1分钟 40小时。可以改变杂交条 件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。所述杂交结果在检测前的洗涤可使用任何适当的洗涤液，该洗涤液可含有0 3% (w/w)的表面活性剂，洗涤可持续适当的时间，如1 30分钟。可以用室温的洗涤液进行洗涤，或预热后洗涤，如42'C。可用不同的洗涤液先后进行洗涤。在本发明的另一方面，还提供了本发明的基因芯片在临床检测中的应用。本发明的CPT基因芯片，使基因芯片的检测能力达到新的高度，不仅大幅提高表 达谱芯片中表达水平低下的基因的检出率，而且由于本发明CPT探针所含的Zipcode 序列与被检测物种的基因组DNA不存在同源性，使该基因芯片的非特异性杂交大大减 少，此外，本发明RNaseH酶的酶切反应在液相进行，比原先在固相载体上反应效率更高。
图1是本发明的芯片杂交与信号放大的原理图； 图2是本发明的芯片杂交与信号降低的原理图；图3是本发明实施例2的芯片杂交结果图； 图4是本发明实施例3的芯片杂交结果图；图5是本发明实施例5的芯片杂交结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1 CPT探针和Zip探针设计和芯片制备1. CPT探针设计探针的设计标准如下1)所选择的基因或SNP位点侧翼的序列经Blast,排除 序列特异性差的基因序列或SNPs，以免造成非特异性杂交；2) SNP位点处于RNA序 列中，并位于探针的中间部分；3)探针退火温度48-6(TC之间，两端DNA部分的退火 温度比整条探针至少低15t:，使酶切后的探针片段与靶DNA序列分离；4)探针自身 互补序列不超过3个碱基对，并且探针之间不得形成二聚体，特别是RNA序列，以免 产生高荧光背景；5)进行SNPBlast，确保探针序列在目的SNP位点外，无其他多态 位点，以免影响杂交效率。2. ZipCode设计ZipCode的设计标准如下1 ) Zipcode序列与被检测物种的基因组DNA不存在同 源性，特别是目的基因或SNP,因此Zipcode序列能有效减少非特异性杂交；2)探针 长度25个碱基对；3)退火温度不低于6(TC: 4)自身互补序列不超过8个碱基对。3. ZipCode芯片的制备(1) 与ZipCode序列互补的Zip探针溶解ZipCode序列互补的Zip探针合成，先在Zip探针的5'端加上一段连接臂，再 将每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10 mM。将浓度为10 mM的探针与浓度为200 mM 的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟， 离心，-2(TC保存，以备点样使用。(2) 点样将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材 质的固相载体片基上，同时设立阳性和阴性对照。片基采用Cell Associates CSS-100 醛基片基，GeneMachine公司的OrainigridlOO型号的点样仪，在湿度65—75% (以 FullMoon片基为准)，温度为25t:的条件下点样，点样的格式为1X3，每个矩阵为8 X18，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。实施例2应用具有荧光基团和淬灭基团的CPT探针对基因组DNA进行检测1.目的基因扩增(1) 引物序列弓l物1F5， -gtcgcaacctggtgcctataa-3， (SEQ ID N0:1); 引物1R5， -tgctataagccagctgagagattt-3， (SEQIDN0:2); 弓I物2F5， -3agccaaggctatgacattct-3， (SEQIDN0:3); 弓I物2R5， -aattcccggagaacttgtgct-3， (SEQIDN0:4)。(2) 探针序列CY3是荧光基团，ECLIPSE是淬灭基团，中间括号内大写碱基序 列为RNA序列。rsl3431727-A5' -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3， (SEQ ID NO:5);rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQ ID N0:6);rsl3431727-C5' -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQID N0:7);rsl146808-A5， -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ggaaatgt(Cy3)(TATC)a(ECLIPSE)aattatctg-3，( SEQ ID NO:8); rsl146808-C5， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-ggaaatgt(Cy3)(TCTC)a(ECLIPSE)aattatct-3， (SEQ ID NO:9); rsl146808-C5 ， —TGGTGGGGGAGTGGAGGAGGAATAG-ggaaatgt(Gy3)(TGTG)a(EGLIPSE)aattatct—3 ， (SEQ ID NO:10)。用SEQ ID NO:l 4所示序列的引物进行PCR扩增，在60 W反应体系进行，反 应体系是0.3 mM dNTP、 10 mM Tris-HCl、 50 mM KCl、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、上游和下游引物的浓度0. 16 MM、基因组DNA 60ng, Taq酶1. 2 U(Takara)。 应用Touch-down PCR反应程序[Don RH, Cox PT， Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS- 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991， 19: 4008]: 94。C变性5 mins; 94。C变性40 s, 64。C退 火lmin，每个循环降低0.5。C， 72。C延伸30 s，共10个循环；然后94"C变性40 s， 59。C退火40 s， 72。C延伸30 s，共30个循环；最后72°C延伸5 mins。2. PCR产物单链化处理取上述PCR产物5 W，进行扩增，反应体系含O. 3 mM dNTP、 10 mM Tris-HC1、 50 mM KC1、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、下游引物的浓度0. 16 MM和Taq 酶0.6U (Takara)。 PCR循环参数94。C变性5 min;然后94。C变性40s， 56。C退火 40 s， 72。C延伸50 s，共35个循环。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Cat. No. 28106)纯化，操作按照试剂盒说明书。3. 酶切反应将上述的PCR产物95。C变性10分钟，立即置于冰上，加入RNase H混匀，用于 酶切反应。反应体系275 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8. 3 @ 25°C)， 3 mM MgCl" 10 mM DTT， 0.05% SDS, 15 U RNase H， 200 ng纯化PCR产物，1 nM CPT探针。60 'C温浴15分钟，随后加入1 pi的0. 1 M EDTA终止反应。4.杂交和洗漆酶切产物与等量的杂交液混合，用ZipCode芯片进行杂交，55°C 1小时。然后用 含0. 5X SSC和0. 1% SDS洗液洗涤5分钟，最后用ddH20洗涤15秒。 5.检测杂交结果芯片杂交与信号放大的原理如图1所示，当RNase H从中间RNA部分切开探针， 标记有淬灭基团的游离端DNA片段和连接有ZipCode序列并标记有荧光基团的DNA片 段分开，当ZipCode序列再与ZipCode芯片上的Zip探针杂交，并通过洗涤去除淬灭 基团后，使芯片的荧光信号放大。洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的 杂交结果如图3所示，再用GenePixPro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进 行分析就可以判断目的序列。实施例3应用仅有荧光基团的CPT探针对基因组DNA进行检测 1.目的基因扩增(1) 引物序列弓l物1F5， -gtcgcaacctggtgcctataa-3， (SEQ ID N0:1); 弓l物1R5， -tgctataagccagctgag卿ttt-3， (SEQID歐2); 弓i物2F5， -aagccaaggctatgacattct-3，(SEQ ID N0:3); 弓I物2R5， -aattcccggagaacttgtgct-3，(SEQ ID N0:4)。(2) 探针序列CY3是荧光基团，中间括号内大写碱基序列为RNA序列。 rsl3431727-A5， -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(ATAG)gggaattta(Cy3)-3， (SEQID N0:11); rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(TTGG)ggaattta(Cy3)-3， (SEQID N0:12); rsl3431727-C5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(TCGG)ggaattta(Cy3)-3, (SEQID N0:13); rsl146808-A5' -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ggaaatgt(TATC)aaattatctg(Cy3)-3' (SEQ ID NO:14);rsl146808-C5， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-ggaaatgt(TCTC)aaattatct(Cy3)-3， (SEQ ID NO:15); rsl146808-C5' -TCGTGCCGGACTCGAGCACCAATAC-ggaaatgt(TGTC)aaattatct(Cy3)-3 ， (SEQ ID NO: 16)。用SEQ ID N0:1 4所示序列的引物进行PCR扩增，在60 W反应体系进行，反 应体系是0.3 mM dNTP、 10 mM Tris-HC1、 50 mM KC1、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、上游和下游引物的浓度0. 16幽、基因组DNA 60ng， Taq酶1. 2 U(Takara)。 应用Touch-down PCR反应程序(同实施例2): 94。C变性5 mins; 94t变性40 s， 64 t:退火l min，每个循环降低0.5'C， 72。C延伸30 s，共10个循环；然后94'C变性 40 s， 59。C退火40 s， 72。C延伸30 s，共30个循环；最后72°C延伸5 mins。2.接着依次进行PCR产物单链化处理、酶切反应、杂交和洗涤，具体操作步骤 和反应条件同实施例2。 3.检测杂交结果芯片杂交与信号降低的原理如图2所示，当RNase H从中间RNA部分切开探针， 标记有荧光基团的游离端DNA片段和连接有ZipCode序列的DNA片段分开，当ZipCode 序列再与ZipCode芯片上的Zip探针杂交，并通过洗涤去除荧光基团后，使芯片的荧 光信号降低。洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图4所示，再用GenePixPro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以判断目的序列。实施例4应用具有荧光基团和淬灭基团的CPT探针对RNA进行检测 1.总RNA抽提(TRIzol法)(1) 100mg甲状腺组织可以加入l ml Trizol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分 打碎组织块。(2) 加入约l/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀l分钟左右，室温下静置5分钟。 (3M。C, 12,000 rpm离心15分钟后小心将上清液转入新的1. 5 ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5分钟。(4) 4°C， 12000 rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70%乙醇， 4°C， 12000 rpm离心洗涤沉淀15分钟。(5) 去上清，沉淀室温晾千后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定A26。和A28。值c2. cDNA探针的制备(1)从-70冰箱中取出RNA，在室温下解冻，然后在0.2mlPCR管中配制反应溶液。总RNA随机引物6聚体(5pg/Vl) 10 mM dNTP mix 无核酸酶的水51 pi 1 nlX pl (补充水至12^1)总体积12 pi(2) 7CTC预变性10 min，立即置于冰上冷却2 min，随后在PCR管中配制cDNA第 一链合成反应体系5X first-strand buffer 4 jxl0. 1 M DTT 2 piRNA抑制剂 1 pi总体积19 )al42。C保温2 min后加入l pi Superscript II (200U/ pi) (Invitrogen， USA)。(3) 42。C保温2小时，70。C变性10 min。 3.酶切反应探针序列CY3是荧光基团，ECLIPSE是淬灭基团，中间括号内大写碱基序列为 RNA序列。rsl3431727-A5， -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3' (SEQ ID NO:5);rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQ ID NO:6);rsl3431727-C5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3' (SEQ ID NO:7)。cDNA于95"变性10分钟，立即置于冰上，加入RNaseH混匀，用于酶切反应。 反应体系275 mM KCl， 50 mM Tris-HCl (pH 8. 3 @ 25°C), 3 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.05% SDS， 20 U RNase H， 1 nM CPT探针，15 cDNA。 60。C温浴60分钟。4.杂交和洗涤酶切产物与等量的杂交液混合，用ZipCode芯片进行杂交，55°C l小时。然后用 含0. 5X SSC和0.1% SDS洗液洗漆5分钟，最后用ddH20洗涤15秒。洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的 杂交结果图，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以判断基因表达情况。实施例5应用具有荧光基团和淬灭基团的CPT探针进行DNA直接杂交的检测 探针序列CY3是荧光基团，ECLIPSE是淬灭基团，中间括号内大写碱基序列为RNA序列。Wa2 5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-cttgtcga(Cy3)(TTCTT)C(ECLIPSE)ttgggat (SEQ ID NO:17);WaZ 5， - CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-gccaagag (Cy3) (GTAAT)G(ECLIPSE)aaggaa (SEQ ID NO:18);EH10 5' - GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ccatctcg(Cy3) (AAAAA)A(ECLIPSE)cggtgaa (SEQ ID NO:19);EH15， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-tcagtaccta(Cy3) (AAAGA)T(ECLIPSE)attcagct (SEQ ID NO:20)。抽提的DNA用DNase I进行片段化，反应体系包括<formula>formula see original document page 13</formula>37。C温浴5 min，然后95°C 15 min。片段化产物95。C变性IO分钟，立即置于冰上，加入RNaseH混匀，用于酶切。 反应体系275幽KC1, 50 mM Tris-HC1 (pH 8. 3 @ 25°C), 3 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.05% SDS， 20 U RNase H， 1 nM CPT探针。5(TC温浴120分钟。然后酶切产物与等 量的杂交液混合，用ZipCode芯片进行杂交，55°C 1小时。然后用含0.5X SSC和 0. 1% SDS洗液洗條5分钟，最后用ddH20洗涤15秒。洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的 杂交结果如图5所示，再用GenePixPro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进 行分析就可以判断目的序列。实施例6应用仅有荧光基团的CPT探针进行DNA直接杂交的检测探针序列CY3.是荧光基团，ECLIPSE是淬灭基团，中间括号内大写碱基序列为 RNA序列。Wa2 5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTMGCACA-cttgtcga (TTCTT)Cttgggat (Cy3) (SEQ ID NO:21);/WaZ 5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-gccaagag(GTAAT)Gaaggaa(Cy3) (SEQ ID NO:22);EH10 5， -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ccatctcg(AAAAA)Acggtgaa(Cy3) (SEQ ID NO:23);EH1 5, -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-tcagtaccta(AAAGA)Tattcagct(Cy3) (SEQ ID NO:24)。抽提的DNA用DNase I进行片段化，反应体系包括<formula>formula see original document page 14</formula>37。C温浴5 min，然后95°C 15 min。片段化产物95。C变性IO分钟，立即置于冰上，加入RNase H混匀，用于酶切。 反应体系275 raM KCl， 50 raM Tris-HC1 (pH 8. 3 @ 25°C)， 3 mM Mgcl2， 10mM DTT, 0.05%SDS, 20U RNase H, 1 nM CPT探针。50。C 温浴120分钟。然后酶切产物与等量的杂交液混合，用ZipCode芯片进行杂交，55°C 1小时。然后用含0.5X SSC和 0. 1% SDS洗液洗涤5分钟，最后用ddH20洗涤15秒。洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到杂 交结果图，再用GenePixPro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可 以判断目的序列。序 列 表〈110〉上海生物芯片有限公司〈120> CPT基因芯片及其检测方法和应用<130> NP-07-11228〈160〉 24〈170〉 Patentln version 3.3〈210> 1<211〉 21〈212> DNA <213>人工序列<220〉〈221> misc一feature〈223> 引物<400〉 1gtcgcaacct ggtgcctata a 21<210> 〈211〉 〈212> <213〉〈220> <221> 〈223〉224 腿人工序列misc—feature 引物—〈400> 2tgctataagc cagctgagag attt 24<210> 〈211〉 <212> <213〉〈220〉 <221〉 <223〉321 腿人工序列misc—feature 引物<400> 3aagccaaggc tatgacattc t 21〈210〉 4〈211〉 21<212> DNA〈213> 人工序列〈220〉〈221> misc—feature<223> 引物〈400〉 4aattcccgga gaacttgtgc t 21〈210> 5〈211〉 44〈212〉 腿 <213>人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222〉 (1)..(25)〈220>〈221〉 modified—base〈222〉 (31).. (31)〈220〉〈221> modified—base〈222〉 (36)..(36)<400> 5gatgatcgac g卿cactct cgccaggcct tataggggaa ttta 44〈210> 6〈211> 44<212> DNA 〈213〉人工序列〈220>〈221> misc—feature〈222> (l)..咖〈220>〈221> modified—base<222〉 (32). .(32) <220〉〈221〉 modified—base<222> (37)..(37)<400> 6acgactgcga ggtgcggtaa gcacaggcct tattggggaa ttta 44〈210〉 7<211> 44〈212〉 DNA 〈213〉人工序列<220>〈221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)<220〉<221〉 modified—base〈222〉 (32).. (32)<220><221> modified—base<222> (37)..(37)<400〉 7cggtcgacga gctgccgcgc aagatggcct tatcggggaa ttta 44〈210〉 8〈211> 47〈212> DNA 〈213>人工序列〈220>〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)<220><221> modified—base〈222> (33). .(33)<220><221> modified—base〈222〉 (38).. (38)〈400〉 8gcgatcgccg ggagatatac ccaacggaaa tgttatcaaa ttatctg 47<210> 9〈211> 46<212> DNA 〈213>人工序列〈220><221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)〈220>〈221> modified—base〈222> (33).. (33)〈220〉<221> modified—base<222〉 (38).. (38)<400> 9gacattcgcg atcgccgccc gctttggaaa tgttctcaaa ttatct 46〈210〉 10〈211> 46<212> DNA 〈213>人工序列〈220〉〈221> misc一feature <222> (1)..(25)<220>〈221> modified—base 〈222〉 (33).. (33)〈220〉〈221> modified—base 〈222〉 (38).. (38)〈400> 10tcgtgccgga ctcgagcacc aatacggaaa tgttgtcaaa ttatct 46〈210〉 11〈211> 44<212> DNA〈213> 人工序列〈220〉〈221> misc一feature〈222> (1)..(25)<220>〈221〉 modified—base〈222〉 (44).. (44)〈400〉 11gatgatcgac gagacactct cgccaggcct tataggggaa ttta 44<210〉 12<211> 44<212> DNA 〈213>人工序列〈220〉<221> misc一feature〈222> (1)..(25)〈220>〈221〉 modified—base〈222〉 (44).. (44)〈400〉 12acgactgcga ggtgcggtaa gcacaggcct tattggggaa ttta 44〈210〉 13〈211> 44〈212〉 DNA〈213> 人工序列<220><221> misc一feature〈222> (1)..(25)<220>〈221〉 modified—base〈222〉 (44)..(44)〈400〉 13cggtcgacga gctgccgcgc aagatggcct tatcggggaa ttta 44〈210〉 14<211> 47 〈212〉腿 <213>人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉<221> modified—base〈222> (47).. (47)〈400〉 14gcgatcgccg ggagatatac ccaacggaaa tgttatcaaa ttatctg 47<210> 15〈211〉 46<212> 腿 <213>人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉<221> modified—base〈222> (46).. (46)<400> 15gacattcgcg atcgccgccc gctttggaaa tgttctcaaa ttatct 46〈210〉 16〈211〉 46〈212> 腿 <213〉人工序列〈220〉<221> misc feature〈222> (1)..(25) 〈220〉<221> modified—base〈222> (46) . (46)<400〉 16tcgtgccgga ctcgagcacc aatacggaaa tgttgtcaaa ttatct 46〈210〉 17〈211> 46〈212〉 腿 〈213〉人工序列〈220><221> misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉<221> modified—base〈222〉 (33).. (33)〈220>〈221> modified—base <222> (39).. (39)〈400〉 17acgactgcga ggtgcggtaa gcacacttgt cgattcttct tgggat 46〈210〉 18〈211> 45〈212> 腿〈213〉 人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature 〈222〉 (1)..(25)<220>〈221> modified—base <222〉 (33).. (33)<220><221〉 modified—base〈222〉 (39)..(39)<400〉 18cggtcgacga gctgccgcgc aagatgccaa gaggtaatga aggaa 45<210> 19<211> 46〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220>〈221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)<220>〈221〉 modified—base〈222〉 (33).. (33)<220>〈221> modified_base〈222〉 (39).. (39)〈400> 19gcgatcgccg ggagatatac ccaacccatc tcgaaaaaac ggtgaa 46〈210〉 20〈211〉 49 〈212>腿 〈213>人工序列<220>〈221> misc_feature〈222> (1)..(25)<220〉〈221> modified—base〈222〉 (35).. (35)〈220>〈221> modified—base〈222〉 (41).. (41)<400> 20gacattcgcg atcgccgccc gcttttcagt acctaaaaga tattcagct 49〈210〉 21<211〉 46〈212〉 DNA <213>人工序列〈220〉<221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)<220><221> modified—base〈222〉 (46).. (46)〈400〉 21acgactgcga ggtgcggtaa gcacacttgt cgattcttct tgggat 46〈210〉 22〈211〉 45<212> DNA 〈213〉人工序列〈220〉<221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)<220〉〈221> modified—base<222> (45) . (45)〈400> 22cggtcgacga gctgccgcgc a卿tgccaa gaggtaatga aggaa 45<210> 23<211> 46〈212〉 DNA 〈213〉人工序列<220><221> misc一feature〈222〉 (1)..(25)〈220〉〈221> modified—base<222> (46)..(46)〈400> 23gcgatcgccg ggagatatac ccaacccatc tcgaaaeiaac ggtgaa 46〈210> 24<211〉 49 〈212〉腿 <213>人工序列〈220〉<221> misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉〈221> modified—base〈222> (49).. (49)〈400> 24gacattcgcg atcgccgccc gcttttcagt acctaaaaga tattcagct 49
权利要求
1. 一种CPT基因芯片，包括DNA-RNA-DNA探针和固定在固相载体上的Zip探针，其特征在于，所述DNA-RNA-DNA探针一端的DNA片段末端连接有与Zip探针互补的ZipCode序列。
2. 如权利要求1所述的CPT基因芯片，其特征在于，所述DNA-RNA-DNA探针可在连 接有ZipCode序列的一端DNA片段上标记有荧光基团，并在另一端DNA片段上标记有淬 灭基团。
3. 如权利要求1所述的CPT基因芯片，其特征在于，所述DNA-RNA-DNA探针可在连 接有ZipCode序列的一端DNA片段上不标记荧光或淬灭基团，在另一端DNA片段上进行 标记。
4. 如权利要求3所述的CPT基因芯片，其特征在于，所述另一端DNA片段上的标记 包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、电化学发光标记和酶标记。
5. 如权利要求1所述的CPT基因芯片，其特征在于，所述DNA-RNA-DNA探针的退火 温度为37 75t:。
6. —种应用权利要求1所述的CPT基因芯片进行检测的方法，其特征在于，包括 如下步骤(1) 获取待测样品核酸；(2) 将权利要求1所述的DNA-RNA-DNA探针和待测样品核酸在含RNase H酶的溶 液中进行酶切，并使其反应足够时间；(3) 在适于与所述Zip探针进行杂交的条件下，在固定有该Zip探针的芯片上加 入含步骤(2)酶切产物的杂交液，并使其反应足够时间；(4) 洗涤后检测杂交反应的结果。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的RNaseH酶包括耐高 温和不耐高温RNase H酶。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中杂交温度为25'C 72°C，杂交时间为1分钟 40小时。
9. 权利擎求1所述的CPT基因芯片在临床检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种CPT基因芯片，包括DNA-RNA-DNA探针和固定在固相载体上的Zip探针，所述DNA-RNA-DNA探针一端的DNA片段末端连接有与Zip探针互补的Zip Code序列。本发明还公开了应用上述基因芯片进行检测的方法以及该芯片在临床检测中的应用。本发明的CPT基因芯片不仅大幅提高低表达基因的检出率，而且使芯片的非特异性杂交明显降低。
文档编号C12Q1/68GK101225434SQ20071003660
公开日2008年7月23日 申请日期2007年1月18日 优先权日2007年1月18日
发明者盛海辉, 肖华胜 申请人:上海生物芯片有限公司