专利名称：用基因工程菌合成6－甲基嘌呤－2′－脱氧核苷的方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种以DNA重组技术构建基因工程菌，并利用该基因工程菌合成6-甲基嘌呤-2′-脱氧核苷(6-Methylpurine-2′-Deoxyriboside，MePdR)的方法。
背景技术：
MePdR是大肠杆菌PNP/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核苷(ePNP/MePdR)抗肿瘤治疗系统的前体药物，MePdR本身无毒，可被大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1，purinenucleoside phosphorylase，PNP)分解成6-甲基嘌呤(6-Methylpurine，MeP)，MeP会抑制RNA和蛋白质合成，导致细胞死亡；哺乳动物来源的PNPase则不能分解MePdR。向肿瘤细胞转入E.coli PNP基因使之表达E.coli PNP，当药物前体MePdR存在时，E.coli PNP会把它分解成有毒的MeP从而高效杀伤肿瘤细胞。
ePNP/MePdR抗肿瘤治疗系统相对其它自杀基因/前体药物抗肿瘤治疗系统而言具有以下优点1.高效的旁观者效应。人细胞膜上含有核苷和碱基载体，这使MePdR经E.coliPNP转化生成的MeP的双向跨膜扩散十分容易，因此，在细胞内部形成的MeP会顺浓度梯度跨膜扩散直到达平衡为止，对于MeP的跨膜运输而言，细胞间的间隙连接或者细胞-细胞接触并非必须。而HSV-TK/甘昔洛韦和CD/5-氟尿苷自杀基因系统产生的甘昔洛韦磷酸盐和5-氟尿嘧啶则不能透过脂质膜，其旁观者效应的发挥必须依赖细胞连接。体外实验中已经证实，只需要0.1％-1％的培养细胞表达E.coli PNP基因，在药物前体存在的情况下，全部培养细胞都可以被杀死。2.新的细胞杀伤机制。HSV-TK/甘昔洛韦和CD/5-氟尿苷自杀基因系统只是抑制DNA合成，而MeP是细胞毒性的ATP类似物，可以掺入到细胞RNA中，抑制RNA和/或蛋白质的合成。3.靶向非增殖细胞。无论细胞是否处于增殖期，RNA和蛋白质的合成对细胞代谢都很重要，由于MeP独特的细胞杀伤机制以及高水平的旁观者效应，使得PNP/MePdR治疗系统可以杀灭分裂期和静止期的肿瘤细胞，在实体瘤治疗中，由于瘤体中只有很少一部分细胞处于分裂期，这种对抗非增殖细胞的活性就显得格外重要。4.长时药效。向小鼠腹腔内注射一次药物前体MePdR(134mg/kg)，可以使转染了E.coliPNP的D54(人神经胶质瘤)肿瘤持续消退超过70天。5.药效高。与传统自杀基因治疗系统产生的毒素5-氟尿嘧啶相比，MeP的疗效高出10倍。6.药物起效快。药物前体MePdR在很短的治疗期内就表现出对抗表达E.coli PNP的细胞的效果。甚至，体内抗肿瘤实验已经证实，仅一剂MePdR就有突出的疗效。7.对大型肿瘤有效。体内实验中，证实MePdR对表达E.coli PNP的大型肿瘤(700mg以上)也有效，从而通过了这一严峻的考验。
E.coli PNP/MePdR这一肿瘤治疗方案，因其高效的旁观者效应、新的细胞杀伤机制、靶向非增殖细胞等特性，在实体瘤治疗上具有极大的应用前景。目前国际上对ePNP/MePdR抗肿瘤治疗系统的研究方兴未艾，国内也部分研究机构正开展此方面的研究，如复旦大学遗传学研究所，同济大学医学院，南京铁道医学院等，鉴于此，急需一种高效廉价合成MePdR的方法。
MePdR主要通过化学法和酶法来制备。
化学法1996年，Janet E等报道了一种通过化学方法由MeP合成MePdR的方法，经两步反应后产率为13％，此法的缺点是合成过程中产生大量异构体，难以分离，且化学催化剂对人员和环境毒害大，所以至今仍不能形成规模化生产，满足科研和临床需要。
酶法2007年，本实验室高彤等(付印中)以过表达外源PNP基因工程菌为酶源，以15mmol/L MeP和60mmol/L 2′-脱氧尿苷(2′-Deoxyurdine，dU)为底物成功合成了MePdR，使用2％菌体55℃反应2h，转化率达到83.78％。
嘧啶核苷磷酸化酶包括尿嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.3，uridine phosphorylase UP)和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.4，Thymidine phosphorylase，TP)。此两者都能可逆地催化嘧啶(脱氧)核苷与磷酸离子生成游离的嘧啶碱基和(脱氧)核糖-1-磷酸。联合利用嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶共同催化转核苷反应，前者催化嘧啶脱氧核苷转化为嘧啶碱基和脱氧核糖-1-磷酸，后者催化脱氧核糖-1-磷酸与MeP反应生成MePdR。单独使用二者之一催化的转核苷反应，生成的碱基会竞争性抑制碱基受体与酶的结合而使得反应的转化率不高，而使用双酶共同催化转核苷反应，生成的嘧啶碱基不会对PNP产生抑制作用而使得反应更有利于向嘌呤核苷合成的方向进行。联合利用两种酶的作用，理论上可以高效的由一种嘧啶(脱氧)核糖与嘌呤碱基作用生成嘌呤(脱氧)核糖与嘧啶碱基。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单，高效，周期短，低成本，符合环保要求的合成MePdR的方法。
本发明所采用的技术方案如下(A)利用重组DNA技术，构建嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶表达载体，并转化大肠杆菌(Escherichia coli)，得到高效表达嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌。
用于本发明中的嘧啶核苷磷酸化酶可以是尿嘧啶核苷磷酸化酶也可以是胸腺嘧啶核苷磷酸化酶。
嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的来源不做限制，只要能可逆的催化相应的核苷在磷酸缓冲液中生成相应碱基与脱氧核糖一磷酸即可，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)等，在特别推荐的方案中，本发明使用得自大肠杆菌中的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶。
构建重组质粒的载体也不做限制，只要能高效表达外源的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶即可，在特别推荐的方案中，本发明使用温度诱导型的表达载体pBV220，此载体不需使用化学诱导剂，只须提高温度到42℃诱导4h即可诱导外源蛋白的大量表达，相对于通常所用的由化学诱导剂诱导表达的表达质粒(如携带由IPTG诱导的lac启动子的质粒)而言，可以节约大量成本。
培养微生物的培养基不受特别限制，为可以获得含有一般碳源，氮源，无机离子和可选的有机营养物质的普通培养基，在特别推荐的方案中，本发明使用的是LB培养基，配方如下蛋白胨10g、酵母抽提物5g和NaCl10g，使用10mol/LNaOH调节pH为7.2，定容至1L。固体培养基只需在液体培养基内加入2％琼脂即可。
培养微生物的条件也不特别限制，例如可以在需氧条件下培养12-48小时，同时将pH和温度适当的控制在pH5-8和25-40℃的范围。对于需要诱导表达外源蛋白质的微生物的培养，可以在上述的培养之后再根据相应表达载体选择相应的诱导表达条件，例如使用pBV220表达载体时，可在30℃培养16小时后，将温度提高到42℃的方法诱导表达外源蛋白质。
(B)以嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶催化嘧啶脱氧核苷和6-甲基嘌呤合成6-甲基嘌呤2′-脱氧核苷。
使用的嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的来源不做限制，只要能催化嘧啶脱氧核苷和6-甲基嘌呤合成6-甲基嘌呤2′-脱氧核苷即可。比如可以是经过初步抽提的粗酶，也可以是源自细菌的非增殖的完整细胞作为酶源。在特别推荐的方案中，本发明使用表达外源嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌作为酶源。
用于本发明中的嘧啶脱氧核苷不做限制，只要能被嘧啶核苷磷酸化酶催化由相应的核苷生成相应碱基与核糖一磷酸即可，比如可以是尿嘧啶脱氧核苷(2’-Deoxyuridine，dU)、胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine，dT)，也可以包括其他非天然型的嘧啶脱氧核苷。在特别推荐的方案中，考虑到目前国内生产dT的技术比较成熟，已形成规模化生产，成本相对较低，实施例中使用dT作为提供脱氧核糖一磷酸的底物。
反应的缓冲液为终浓度为10-100mM的磷酸盐溶液，其溶液配制的pH值为6.0-8.0之间。
反应的温度为40-70℃。
反应底物浓度为10-400mM，嘧啶脱氧核苷与6-甲基嘌呤物质的量之比为1∶1～3∶1。
反应可以在静止的条件下进行，也可以在适当的摇速下进行。
反应时间在1-10小时之间。
(C)6-甲基嘌呤2′-脱氧核苷的分离与纯化。
反应完成后，可以使用合成树脂吸附的方法，使用沉淀剂沉淀的方法或者使用其他常规收集和分离方法，从混合物中收集和分离由此生成的MePdR。
利用本发明的方法催化合成MePdR，具有简单，高效，周期短，低成本，符合环保要求等特点，适合于工业化生产。
本发明的特点是1.应用两种酶共同催化转脱氧核苷反应，从而高效合成MePdR。
2.选用温度诱导型的表达载体表达外源蛋白，节约大量成本。
3.直接以基因工程菌菌体催化转核苷反应，无需破细胞提纯酶。
图1不同基因工程菌催化反应的转化率随时间变化曲线。
图2MePdR核磁共振图谱。
具体实施例方式
一.基因工程菌的构建。
根据GeneBank中提供的E.coli的PNP及TP基因序列设计引物如下PNP5′引物5’-catgccatggctaccccacacattaa-3’(NcoI)3′引物5’-atgtcgacttactctttatcgcccagcag-3(SalI)TP5′引物5’-ttttgtcgaccatgtttctcgcacaa-3’(SaI)3′引物5’-aaaactgcagttattcgctgatacgg-3’(PstI)以E.coli DH5α的染色体DNA为模板做PCR95℃ 5min，30×(95℃ 40s，62℃ 40s，72℃ 1min)，72℃ 10min。PCR产物和pBV220载体经限制性酶切并用T4DNA连接酶连接，转化E.coli DH5α感受态细胞。用pBV220载体通用引物PCR及限制性酶切鉴定转化子得到基因工程菌pBV220-PNP和pBV220-TP。DNA测序发现重组质粒中外源基因序列与GeneBank中发表的相应序列完全相同。
二.酶源的制备。
重组菌活化后接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养到OD6000.6时立即升温至42℃培养4h，离心后的菌体用10mmol/L pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤，再离心得湿菌体。
三.酶催化合成MePdR。
反应体系如下缓冲液40mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液底物100mmol/L MeP和300mmol/L dT菌体量1‰(湿重)于55℃水浴摇床上反应，摇速150r/min，反应结束后100℃煮沸5min，12000r/min离心5min得上清液HPLC定量。
HPLC各参数如下HP C-18柱，250mm×4mm，孔径5μm，流动相为7％乙腈+93％50mmol/L(NH4)H2PO4，流速1mL/min，进样量10μL，温度25℃，检测波长254nm，MePdR的保留时间为9.2min。采用外标法，即根据不同浓度的MePdR的峰面积所做的标准曲线来定量。根据以下公式计算转化率。
分别以单独的pBV220-PNP和pBV220-TP以及同时用两种菌株细胞(pBV220-PNP和pBV220-TP菌量分别为0.5‰)催化反应，随着时间的推移，测定产生的MePdR的量，结果示于图1中。
在图1中，纵坐标表示MePdR的浓度(克/升)，而横坐标表示反应时间(分钟)，对于相应的菌株细胞测定的反应进程，pBV220-PNP用实心圆表示，pBV220-TP用实心方块表示，而pBV220-PNP和pBV220-TP混合菌株用实心三角形表示。
在用不同的基因工程菌株催化的由MeP合成MePdR的反应中，单独使用过表达PNP的基因工程菌株pBV220-PNP和单独使用过表达TP的基因工程菌株pBV220-TP都不能高效的合成MePdR，而混合使用pBV220-PNP和pBV220-TP菌株共同催化反应，可以高效的合成MePdR，反应1小时即达到平衡，MePdR浓度达到23.75g/L，转化率达到95％。
四.MePdR的分离纯化。
反应混合液离心得上清，于旋转蒸发仪上浓缩至1/10体积，使用硅胶柱层析分离MePdR。
柱层析方法如下硅胶GF254干法填柱，边填柱边敲管壁以保证硅胶填充紧密。硅胶填充至有效柱长度25cm(直径2.5cm)为止。将1ml浓缩后的样品与约0.5g的硅胶混匀，电吹风吹干，得到固体状物质，小心研细后填加到柱顶部，压紧，在其上小心放置一个滤纸片，以氯仿/乙酸乙酯/异丙醇/氨水混合溶剂洗脱，收集含有MePdR的流出液后旋转蒸发仪浓缩结晶，重结晶纯化。
结晶后的产品以HPLC鉴定其纯度，达到99.3％。核磁共振(共振频率500MHz，溶剂为氘代甲醇)确定所得产物即为MePdR，结果示于图2中1H NMR(500MHz，CD3OD)δ＝2.486(ddd，J＝3.36，6.21，13.52Hz，1H，H-2′/2″)；2.814(s，3H，CH3)；2.856(m，1H，H-2′/2″)；3.765(ABX，J＝3.88，12.12Hz，1H，H-5′/5″)；3.831(ABX，J＝3.40，12.13Hz，1H，H-5′/5″)；4.063(dd，J＝3.42，6.74Hz，1H，H-4′)；4.611(td，J＝3.19，6.15Hz，1H，H-3′)；6.556(t，J＝6.78Hz，1H，H-1′)；8.705(s，1H，H-2)；8.772(s，1H，H-8)。δ＝3.310和δ＝4.871分别是溶剂和水的峰。
权利要求
1.一种用基因工程菌合成6-甲基嘌呤2′-脱氧核苷的方法，其特征在于包括如下步骤(A)利用重组DNA技术，构建嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶表达载体，并转化大肠杆菌，得到高效表达嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌；(B)以嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶催化嘧啶脱氧核苷和6-甲基嘌呤合成6-甲基嘌呤2′-脱氧核苷；(C)6-甲基嘌呤2′-脱氧核苷的分离与纯化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的嘧啶核苷磷酸化酶为尿嘧啶核苷磷酸化酶或胸腺嘧啶核苷磷酸化酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(B)的反应温度为40-70℃，缓冲液为终浓度为10-100mM的磷酸盐溶液，其溶液配制的pH值为6.0-8.0，反应底物浓度为10-400mM，嘧啶脱氧核苷与6-甲基嘌呤物质的量之比为1∶1～3∶1，反应时间为1-10小时。
4如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(C)中的分离纯化方法为合成树脂吸附法或沉淀剂沉淀法。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种以DNA重组技术构建基因工程菌，并利用该基因工程菌合成6－甲基嘌呤－2′－脱氧核苷(6－Methylpurine－2′－Deoxyriboside，MePdR)的方法。包括如下步骤(A)利用重组DNA技术，构建嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶表达载体，并转化大肠杆菌，得到高效表达嘌呤核苷磷酸化酶和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌。(B)以嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶催化嘧啶脱氧核苷和6－甲基嘌呤合成6－甲基嘌呤2′－脱氧核苷。(C)6－甲基嘌呤2′－脱氧核苷的分离与纯化。利用本发明的方法催化合成MePdR，具有简单，高效，周期短，低成本，符合环保要求等特点，适合于工业化生产。
文档编号C12N15/31GK101067145SQ20071003863
公开日2007年11月7日 申请日期2007年3月29日 优先权日2007年3月29日
发明者梁胜华 申请人:复旦大学