专利名称：：一种来源于苹果的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种植物基因工程领域的基因序列，具体是一种来源苹果的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列。
背景技术：
：转基因作物研究中使用的标记基因99%以上使用的是传统的标记基因，即GUS基因和抗性标记(抗生素和除草剂)。目前使用的GUS基因来源于大肠杆菌，虽然研究结果证明GUS报告基因是相对安全的，但毕竟来源于大肠杆菌，普通消费者容易引起心理顾忌。因此发掘和改造具有植物内源性的新型安全标记基因具有现实意义。目前应用到的相对安全的标记基因有甜菜碱醛脱氢酶基因、葡糖醛酸酶基因、木糖异构酶基因、磷酸甘露糖异构酶基因、来源于农杆菌的LM1基因和及甜椒类铁氧还蛋白基因等。这些代谢相关基因特别是一些来源于植物物种本身的基因与抗生素或除草剂抗性标记基因相比，没有毒性。利用这些安全标记基因不仅可以获得无抗性标记基因的转化植株，缓解抗性标记基因的生物安全性问题，而且可以提高难以转化的物种的转化效率，具有一定的优势。但是这些安全标记基因作为筛选标记而言，筛选效率远低于传统的除草剂抗性和抗生素抗性基因。统计至2004年，全球传基因作物研究中使用的标记基因74%使用的是抗生素抗性基因，25%使用的是除草剂抗性基因，只有不到1%使用的是其他类型的筛选标记。全球种植的转基因作物中78%以上是抗除草剂性状。因此可以推断在相当长的一段时间内，抗性标记(抗生素和除草剂)仍然是最主要的筛选标记。因此发掘和改造来源大面积生产植物本身的新型安全抗生素和除草剂抗性基因将是必要的。目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断扩大，占全球种植转基因作物的78%以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和4南非等七国的主要商品化转基因农作物。耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的62%。草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂。广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine,glyphosate)毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(简称EPSP合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成过程中的一个关键酶。该酶由wo4基因编码。
发明内容发明目的利用cDNA末端快速扩增技术从苹果幼苗中克隆编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列。目前使用的抗草甘膦基因主要来源于微生物的EPSP合成酶基因，有潜在的生物安全性问题。本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种来源于大面积种植植物本身，因此具有相对良好的安全性，由于苹果是人们平时食用的的一种大众化水果，具有味美、价廉、耐贮等优点，深受国人的喜爱，从中来源的目的基因意义更大。本发明是这样实施的1.苹果cDNARACE文库的构建取生长健壮的苹果苗采用CTAB法(购买于上海国药化学公司)抽提总RNA。使用Promega公司的磁珠分离系统进行mRNA的分离，具体步骤参看实施例1。利用SMART技术(Clontech公司)合成cDNA第一链，使用的引物是R11464和R11466(GAC,CAG,TGG,TAT,CAA，CGC,AGA，GTA,CGC,GGG和GCA,GGA,CTG,CAG,CTG，ACT,GAC，TAC,TTT,TTT,TTT，TTT,TTT,TTT,TTT,TTT,TTT,TTT,VN)。SMART技术的参照Clontech说明书进行操作。合成好的苹果cDNA库保存于-7(TC。2.用PCR的方法获苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的保守片段根据植物和微生物的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)保守结构域的氨基酸序列特征设计一对兼并引物MdepspsFl和MdepspsRl(ANG,ANG，GVA，GNT，GDA,GBT，NTC和ANC,TBG,CHC,TNG,ANG,CVT,NGC)，以合成的苹果cDNARACE文库为模板，进行PCR扩增(PCR反应体系10xPCRbuffer5.0|il;dNTPs(各2.5mM)4^1;苹果cDNA模板ljil(20ng);引物MdepspsFl0.5pi;引物MdepspsRl0.5Ex-Taq0.4|il(预变性后加入)；加无菌水定容至50|iL。PCR反应程序94"C预变性10分钟；94。C变性30秒；52。C退火30秒；72。C延伸50秒；共35个循环；72。C延伸IO分钟)。获得一条约250bp的片段(图3)，将该扩增产物回收后克隆入T-载体(购买于大连宝生物工程公司)，测序得到保守片段的DNA序列，经过Blast比对为5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的保守片段。序列为TTTTGTCGAAGGCGATGCTTCAAGTGCTAGTT。3.RACE方法获得苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶片段根据已经克隆的苹果5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的保守片段序列分别合成5'和3'RACE扩增的内侧和外侧巢式PCR(Nest-PCR)(具体见实施例3)。引物分别为MdepspsW5，MdepspsN5和Mdepsps-W3，MdepspsN3(MdepspsW5:TCC，ACA，TAC,GGA，ATG,GAA,ATT，AG;MdepspsN5:ATA,AGC，AAA,GCA,GTC，AAG,TAC,TG;Mdepsps-W3:ATG,ACT，TTG，AAG，TTG，ATG,GAA，CGC;MdepspsN3:ATC，GGT，TTT,TGA,TCC,AAG，GAG,GTC)。4.PCR方法获得苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶全长序列通过对5'和3'RACE扩增片段的序列测定和分析，得到全长为1578bp的序列。根据该序列设计引物，从苹果cDNA文库中扩增得到全长的苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，进行序列测定分析。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>图1琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果；图2琼脂糖凝胶电泳鉴定分离的mRNA产物的结果；图3琼脂糖凝胶电泳检测扩增保守片段产物；图4琼脂糖凝胶电泳检测5'RACE扩增产物；图5琼脂糖凝胶电泳检测3'RACE扩增产物；图6琼脂糖凝胶电泳检测扩增全长的DNA片段。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括苹果(M3/wstfowe5"ca)实生苗，株高15cm，27"C人工气候室培养，16h光照培养两个月。大肠杆菌￡.^//01150[由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室得到。克隆载体pMD18-T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10xPCRbuffer和DNAmarker购自宝生物工程大连有限公司。含有"flcC7基因启动子和T1T2终止子的原核表达载体pYPX251由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室皿，已登陆GenBank(GenBanknumber:AY178046)。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买。ABIPRIAMBig-DyeTerminatorDNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。SMARTTMRACEcDNA扩增试剂盒购买于美国Clontech公司。下述实施例中常规的基因操作参照有关文献，其中引物PAGE纯化、蛋白质电泳，透析袋回收DNA、DNA测序、质粒碱法抽提方法参照分子克隆文南犬SambrookJ,FretsEF,MannsdesTetal.In:MolecularCloning.2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989.实施例1:苹果幼苗RNA的抽提和mRNA的分离(一)试验方法1、RNA的抽提1)加入100ml提取缓冲液(苹果RNA提取缓冲液配方CTAB3%(W/V);PVP3%(W/V)(Mw4000);EDTA25mM;NaCl2.0M;Tris-HCl100mM，pH8.0;Spermidine0.5g/L;DEPC0.1%(V/V);0.1%DEPC处理的SDS0.5%(W/V);0.1%DEPC处理的LiClIOM。)至lj50ml聚丙烯管，65°C预热；2)称取2.3g植物苹果幼苗植株材料倒入液氮使材料始终保持冻结和易碎的状态，研磨；3)研磨后细粉转移至预先加入65t:预热的提取缓冲液的50ml离心管；4)将离心管放入65r水浴45min，并偶尔摇动以混合各成分；5)加入等体积氯仿-异戊醇混合液，轻柔地上下颠倒混合约10min;6)在18。C，于12000g离心10min;7)吸取上清液，重复5，6步骤操作；8)吸取上清液，加入1/4体积的10MLiCl溶液，彻底混匀，4。C放置12h;9)在4°C，12000g离心30min;10)RNA沉淀用500W0.5%SDS轻柔溶解，用氯仿-异戊醇混合液抽提，4°C，12000g离心30min;11)上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积-2(TC冰冷的无水乙醇，充分混合，放置在-2(TC条件下2h，沉淀总RNA;12)12000g，4。C离心30min，用75%乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干；13)用200^1DEPC处理的去离子水重新溶解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其余储存于-7(TC，备用。2、基因组DNA的去除1)将20—50(igRNA溶于水中，加入10xDNasebuffer5|il，5u/|ilRNAfreeDNase2jil，40u/(ilRNaseInhibitor0.5jil，力口RNAfreeH20至50jil，37°C处理25min，去除DNA的污染。2)酚氯仿抽提一次，取上清，加入1/10V的3MNaOAc，用两倍体积无水乙醇沉淀RNA，70%乙醇洗一次，5(TC烘干后溶于20)al水中。3、mRNA的分离mRNA的分离使用的是Promega公司的polyATractmRNAIsolationSystem,具体步骤参看说明书。(一)、探针的退火1)将O.l-l.Omg的总RNA加入1.5mL的离心管中，用无RNA酶的水定容至50(VL;2)65。C水浴10min;3)在RNA中加入Biotinylated-Olig(dT)探针和26pL20xSSC,缓慢摇匀，置于常温下直到完全冷却下来(约10min)，同时准备1.2mL0.5xSSC和1.4mL0.2xSSC;(二)、链亲和素标记的磁珠(SA-PMPS)清洗用相同量的0.5xSSC溶液清洗3次且在30min内使用。1)轻轻地指弹装着SA-PMPS的0.6mL离心管底部使之重新悬浮直到完全分散，然后放在磁力架上将磁珠收集于离心管管壁上(约30s);2)小心去除上清，切忌使用离心；3)0.5xSSC溶液清洗3次。每次使用300(iL0.5xSSC，每次使用磁力架来收集磁珠并小心去除上清；4)最后用IO(VL0.5xSSC溶液重新悬浮磁珠；(三)、收集并清洗退火的Olig(diymRNA杂交分子1)将杂交好地总RNA全部加入处理过的SA-PMPS中，置于常温下10min，并每隔l-2min轻轻地颠倒混合1次；2)用磁力架收集磁珠并小心去除上清，不要触及和晃动SA-PMPS小球；3)用300pL0.2xSSC溶液清洗磁珠4次，每次轻轻地指弹离心管底部，使所有的磁珠悬浮起来，最后一次清洗尽量多地去除上清且不触及磁珠；(四)、mRNA的洗脱1)加入100pL无RNase的水，轻弹离心管底部使SA-PMPS磁珠重新悬浮；2)磁力架收集SA-PMPS，收集洗脱的mRNA于新的离心管中，不要抛弃磁珠；3)加入150pL无RNase的水，重复l)和2)，合并洗脱液共250|^L。4、mRNA质量检测1)分光光度计测定RNA含量和质量质量好的RNA其OD260/OD280比值在2.0左右，按照RNA含量调整为同一浓度进行反转录。(二)试验结果1、采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果见图1，图中可见明显的RNA条带。2、采用琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA产物的结果见图2，图中可见明显的mRNA条带。实施例2:PCR的方法获苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的保守片段(一)试验方法根据植物和微生物的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)保守结构域的氨基酸序列特征设计一对兼并引物MdepspsFl和MdepspsRl(ANG，ANG,GVA,GNT,GDA,GBT，NTC禾卩ANC，TBG,CHC,TNG,ANG,CVT,NGC)，以合成的苹果cDNA文库为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系10xPCRbuffer5.0jil;dNTPs(各2.5mM)4苹果cDNA模板l(il(20ng);引物MdepspsFl0.5)il;引物MdepspsRl0.5)^1;Ex-Taq04(il(预变性后加入)；加无菌水定容至50)iL。PCR反应程序9fC预变性10分钟；94。C变性30秒；52。C退火30秒；72。C延伸50秒；共35个循环；72'C延伸IO分钟。(二)试验结果采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约250bp的片段(图3)，将该扩增产物回收后克隆入T-载体，测序得到保守片段的DNA序列TTTTGTCGAAGGCGATGCTTCAAGTGCTAGTT。实施例3:RACE方法获得苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因全长片段(一)试验方法根据已经克隆的苹果5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的保守片段序列分别合成5，和3，RACE扩增的内侧和外侧巢式PCR弓1物MdepspsW5，MdepspsN5禾口MdepspsW3，MdepspsN3。具寸本序歹(J为MdepspsW5:TCC,ACA,TAC，GGA,ATG，GAA，ATT，AG;Mdepsps-N5:ATA,AGC,AAA,GCA,GTC，AAG,TAC,TG，Mdepsps-W3:ATG,ACT，TTG,AAG,TTG,ATG，GAA,CGC;MdepspsN3:ATC，GGT，TTT，TGA，TCC，AAG，GAG，GTC)。1)第一轮PCR(5，RACE)。PCR反应体系10xPCRbuffer5.0^1;dNTPs(各2.5mM)4(il;苹果cDNA模板l|_d(20ng);引物R16325(GGT，GGT,AGG，ATC，CGA,CCA，GTG,GTA,TCA,ACG,CAG)0.5^1;引物MdepspsW50.5|il;Ex-Taq0.4^1(预变性后加入)；加无菌水定容至50(iL。PCR反应程序94。C预变性IO分钟；94。C变性30秒；55。C退火45秒；72°C延伸90秒；共35个循环；72。C延伸10分钟。2)第二轮巢式PCR扩增(5，RACE)。PCR反应体系10xPCRbuffer5.0^1;dNTPs4pl(各2.5mM);第一轮PCR产物(稀释10x)1^1;引物R16323(AGG，ATC,CGA,CCA，GTG，GTA,TCA,ACG，CAG，AGT,AC)0.5fil;引物Md印spsN50.5^1;Ex陽Taq0.4(al;加无菌水定容至50pL。PCR反应程序94。C变性30秒；52。C退火45秒；72。C延伸90秒；共35个循环；72。C延伸10分钟。按照下列程序进行3'RACE巢式PCR扩增1)第一轮PCR(3，RACE)。PCR反应体系10><PCRbuffer5.0)^1;dNTPs(各2.5mM)化l;苹果cDNA模板l^il(20ng);引物R16326(GGT,GGT，AGA,GCT,CGC,AGG,ACT,GCA,GCT,GAC,TG)0.5)il;引物MdepspsW30.5(il;Ex-Taq0.4|_il(预变性后加入);加无菌水定容至50|iL。PCR反应程序94。C预变性IO分钟；94。C变性30秒；55。C退火45秒；72°C延伸卯秒；共35个循环；72"延伸10分钟。2)第二轮巢式PCR扩增(3，RACE)。PCR反应体系10xPCRbuffer5.0jil;dNTPs4pi(各2,5mM);第一轮PCR产物(稀释10x)引物R16324(AGA,GCT,CGC，AGG，ACT,GCA,GCT，GAC,TGA,CTA,C)0.5|al;引物MdepspsN30.5jil;Ex-Taq0.4(^1;加无菌水定容至50)aL。PCR反应程序94。C变性30秒；52。C退火45秒；72。C延伸90秒；共35个循环；72°C延伸IO分钟。(二)试验结果采用琼脂糖凝胶电泳检测5'RACE扩增得到一个约800bp条带(图4)。采用琼脂糖凝胶电泳检测3'RACE扩增也得到一个约800bp条带(图5)c实施例4:苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因全长序列获得和分析(一)试验方法将上述扩增产物分别回收后克隆入T-载体，测序后进行拼接。根据拼接的苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因序列，设计两端引物MdepspSl禾卩MdepspS2(序歹lj分另U为AAG,GAT,CCA,TGG,CCC，AAG，TGA,GCA，AAA，TCT,G和AAG,AGC,TCT，CAA,TGC，TTG,GTA,AAC，TTC，CTG)，并进行PCR扩增得到全长的苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶DNA片段。将上述扩增产物分别回收后克隆入T-载体，进行测序分析。(二)试验结果采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增得到全长的DNA片段约1600bp(图6)。测序分析结果显示苹果编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因编码阅读框由1578bp组成，编码一个525个氨基酸。具体的基因序列和氨基酸序列如下苹果来源的的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列6006607207808409009601020108011401200126013201380144015001560AAGTTTACCAAGCATTGA1578。苹果来源的的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因编码的氨基酸序列YDD服MAMAFSLAACGDVPVTIKDPGCTRKTFPDYFEVLRKFTKH。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>AAGTTTACCAAGCATTGA1578<210>2<211>525<212>PRT<213>苹果(Ma/船do膨Wca)<400>2YDD服MAMAFSLAACGDVPVTIKDPGCTRKTFPDYFEVLRKFTKH权利要求1.一种来源于苹果幼苗中的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因具有如下序列ATGGCCCAAGTGAGCAAAATCTGCAGCAATGGTGCTCAAAGCATCAATCTTTTGCCCAAT60GTTTCCAAACCCCAAATGCCCAGATCATCAAATTTTCTCCCATTGAAGTCCCAGTTTCTG120GGTTCCTCAAATTCTTTGAGTTTGAAGCTGAAAAATGGGCTTGTGGGCAGTTGGACCGTC180GGTAAAGTCAGGGTCGATCCGCTTACAGTTGCAGCTTCAGTTGCCACAGCAGAGAAGCCG240TCCACGGTTCCGGAGATTGTGCTGCAACCCATCCAAGAAATCTCGGGCACCATAAAGTTG300CCGGGTTCCAAGTCGTTGTCGAATCGAATTCTGCTGATTGCTGCTCTCTCTGAGGGAACA360ACTGTTGTTGACAACTTGTTAGATAGTGAAGATATTCATTATATGCTTGGTGCATTGAAA420ACCCTTGGGCTGAATGTTGAAGAGGACAAGGAAAACAGGCGAGCGGTCGTGGAGGGTTGT480GGTGGTCGGTTTCCTTTGAGTAATGAATCAGTAGATGAAGTGCAACTATTCCTTGGAAAT540GCTGGAACAGCAATGCGGCCATTGACTGCTGCAGTTGTTGCTGCTGGTGGACATGCTAGG600TATGTACTTGATGGGGTGCCCCGAATGAGGGAGAGACCAATCGGAGACTTAGTTGATGGT660CTTAAGCAGCTTGGTGCGGATGCTGATTGTTTTCTTGGAACAAACTGCCCTCCTGTCCGT720GTGATTGGAAAGGGAGGCCTTCCAGGAGGGAAGGTGAAGCTCTCTGGATCAATTAGTAGT780CAGTACTTGACTGCTTTGCTTATGGCAGCTCCTTTGGCCCTTGGAGATGTTGAAATAGAG840ATTATTGATAAACTAATTTCCATTCCGTATGTGGAAATGACTTTGAAGTTGATGGAACGC900TTTGGGGTCTCAGTGGAACACAGTGATAGTTGGGATCGGTTTTTGATCCAAGGAGGTCAA960AAGTACAAGTCTCCTGGAAATGCTTTTGTCGAAGGCGATGCTTCAAGTGCTAGTTACTTT1020CTAGCTGGTGCTGCTGTCACTGGTGGGACTGTCACTGTTGAAGGCTGTGGGACAAGCAGT1080TTACAGGGAGATGTAAAGTTCGCTGAAGTTCTTGAAAAGATGGGTGCTAAAGTTACATGG1140ACAGAGAATTCTGTCACAGTTACAGGACCTCAACGACTTTCTTCTGGAGGAAAACACTTG1200AAAGCTGTTGACGTCAACATGAACAAAATGCCAGATGTTGCCATGACTCTTGCTGTAGTT1260GCTCTTTTTGCCGATGGACAAACTGCCATAAGAGATGTGGCAAGTTGGAGAGTGAAGGAG1320ACAGAAAGGATGATCGCCATATGCACTGAACTAAGAAAGCTGGGAGCAACCGTTGAAGAG1380GGACCAGATTACTGCATAATCACACCGCCAGAAAAATTAAACTTGACTGCAATAGACACG1440TATGATGACCACCGAATGGCCATGGCTTTCTCTCTTGCTGCCTGTGGAGACGTTCCAGTT1500ACTATCAAGGATCCCGGTTGTACCAGAAAAACATTCCCCGATTACTTTGAAGTCCTCAGG1560AAGTTTACCAAGCATTGA1578基因编码具有如下的氨基酸序列MAQVSKICSNGAQSINLLPNVSKPQMPRSSNFLPLKSQFLGSSNSLSLKLKNGLVGSWTVGKVRVDPLTVAASVATAEKPSTVPEIVLQPIQEISGTIKLPGSKSLSNRILLIAALSEGTTVVDNLLDSEDIHYMLGALKTLGLNVEEDKENRRAVVEGCGGRFPLSNESVDEVQLFLGNAGTAMRPLTAAVVAAGGHARYVLDGVPRMRERPIGDLVDGLKQLGADADCFLGTNCPPVRVIGKGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIIDKLISIPYVEMTLKLMERFGVSVEHSDSWDRFLIQGGQKYKSPGNAFVEGDASSASYFLAGAAVTGGTVTVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVTWTENSVTVTGPQRLSSGGKHLKAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALFADGQTAIRDVASWRVKETERMIAICTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLNLTAIDTYDDHRMAMAFSLAACGDVPVTIKDPGCTRKTFPDYFEVLRKFTKH。2.—种来源于苹果幼苗中的编码为5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶序列的用途，通过基因的转化将该酶序列转入目标植物本身，使其具有抗除草剂作用。全文摘要本发明涉及植物基因工程领域，更具体涉及5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因。本发明公开了一种利用cDNA末端快速扩增技术从苹果幼苗中克隆了一个编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列。文档编号C12N15/52GK101418305SQ20071004742公开日2009年4月29日申请日期2007年10月25日优先权日2007年10月25日发明者付晓燕,姚泉洪,彭日荷,贤李,熊爱生,田永生,永薛,伟赵,峰高申请人:上海市农业科学院