一种酒红土褐链霉菌、筛选方法及应用的制作方法

专利名称：：一种酒红土褐链霉菌、筛选方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物菌种的筛选方法及应用，特别是指一种链霉菌属酒红土褐链霉菌、筛选方法及应用。
背景技术：
：设施栽培是现代农业最重要的生产方式之一，在丰富人们菜篮子的同吋，还提高了农民收入。目前，设施蔬菜生产已经成为我国种植业的第二大支柱产业，设施蔬菜产值占蔬菜总产值的50%以上。由于设施栽培具有设施固定，倒茬困难，设施土壤缺乏雨水溶淋等特点，再加上栽培技术的滞后，随着种植年限的延长，会普遍发生病虫害加剧、产量和品质下降等连作障碍现象。一般连茬种植5年后，减产损失在20%以上，严重地块达到经济阈值以下，甚至会绝收。连作障碍已经成为制约设施栽培可持续发展的瓶颈。研究表明，土壤次生盐渍化、土壤病原物和自毒物质积累是发生连作障碍的主要成因，由于连作障碍的构成多样，防治非常困难，是一国际性难题。以有益微生物为核心的生物防治是国内外研究的热点，设施栽培是现代农业最重要的生产方式之一，在丰富人们菜篮子的同吋，还提高了农民收入。目前，设施蔬菜生产已经成为我国种植业的第二大支柱产业，设施蔬菜产值占蔬菜总产值的50%以上。由于设施栽培具有设施固定，倒茬困难，设施土壤缺乏雨水溶淋等特点，再加上栽培技术的滞后，随着种植年限的延长，会普遍发生病虫害加剧、产量和品质下降等连作障碍现象。一般连茬种植5年后，7减产损失在20%以上，严重地块达到经济阈值以下，甚至会绝收，连作障碍已经成为制约设施栽培可持续发展的瓶颈。研究表明，土壤次生盐渍化、土壤病原物和自毒物质积累是发生连作障碍的主要成因，由于连作障碍的构成多样，防治非常困难，是一国际性难题。以有益微生物为核心的生物防治是国内外研究的热点，链霉菌是目前研究和应用最广泛的生防因子之一，开发应用的产品涉及杀菌、杀虫、除草、生长调节、抗病毒等多种制剂。但目前应用的菌株及其产品功能单一，且防效低，效果不稳定，缺乏针对连作障碍成因的优势菌株和高效应用技术。
发明内容本发明的目的在于针对上述问题，以北方设施蔬菜生产现状为背景，在进一步探明连作障碍的现状、构成和成因的基础上，提出了通过对根际微生态和根系的综合调控，实现高效稳定防治的研究思路，采用独创的分离筛选技术，提供一种具有防病、促生和解毒等多种功能的根际益生菌菌株一酒红土褐链霉菌，并给出其应用方向。本发明提供的菌种是链霉菌属酒红土褐链霉菌(5Xr6^:o/7y/C6\s1//，C6^^^ms)，暂定名为S506，已于2008年9月11日提交中国普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.2664。该菌种是从河北省栾城县番茄根际土壤分离获得的。所述的酒红土褐链霉菌DNA序列测定结果为TCAGCTAGTTGGTGAGGTAACG选用河北省栾城县境内栽培的番茄植株，去掉植株根部土壤，随机剪取新生主根和毛细根，置于含玻璃珠的无菌水中，充分摇动，将根取出，得土壤悬浮液；取出的根系先用无菌水冲洗，然后作表面消毒处理，用无菌水冲)争残余乙醇，于无菌研钵中研成糊状，制作根系悬液；将上述悬液摇匀后，进行稀释，取0.05-0.15ml涂布于高氏一号培养基上，24-26。C培养71-73小时，分离长势良好的链霉菌菌株，纯化后，进行平板纯培养；制取链霉菌菌块，分别以立枯丝核菌(/力7》<%7^7&sp.)、镰刀菌(^/wr/^7sp.)或腐霉菌(。《力^/77S。.)病原菌为靶标，在PDA平板上进行对峙培养，病原菌与目的菌相距3cm,每处理3次重复，同吋于PDA平板上单独接种病原菌作对照；一周后检查对峙培养结果，根据病原菌在对峙方向的菌落半径、对照菌落半径廿算抑菌率；抑菌率％=(对照菌落半径对峙菌落半径)/对照菌落半径xlOOX,选择抑菌率高且对多种病原同时具有防效的菌株参与下步筛选试验；(2)防病促生菌株的筛选采用育苗钵异步生测法，分别对步骤(1)获得的菌株进行防病和促生功能比较试验，栽培基质按大田壤土农家肥蛭石=6-8:1-3:0.5-1.5比例配制，参试目的菌株和病原菌都制成固体培养物，按1%比例与上述培养基质混合；病原菌和生防菌混合接种的栽培基质用于抗病性检测，目的菌单独接种的用于促生效果检测，目的菌和病原菌均按栽培基质1%的质量比接种，基质混合均匀后，填装于育苗钵中；挑选两叶一心长势均匀一致的番茄幼苗移栽于上述培养钵中，每处理50棵，各分2组，随机排列，置于日光温室中培养；侵染率调查30天后将根挖出，调查病情指数；促生结果调查待番茄长到45片真叶时，将番茄苗整株挖出，检测整株鲜重、地上部干重、叶面积、主根长、根干重指标；综合比较抗病和促生效果，确定优势菌株；(3)防根结线虫菌株的筛选二S令幼虫的培养在黄瓜生长后期，挖取根结线虫发病重、根结多的黄瓜根，用清水洗去根部泥土，剪成长lcm的根段，放入500mL三角瓶中，倒入200mL0.5%NaC10溶液，用力摇3分钟，混合溶液过100目筛，用无菌水冲洗筛上碎片5次，溶液再过500目筛，用无菌水冲洗筛上物，液体收集到容器中，获得卵悬浮液，将收集到的卵块或卵粒置于中性滤纸上，置于200目网筛上，网筛置于盛有清水的盆中，水位高度为不低于浸湿滤纸，然后置于28T恒温箱中孵化，每24小时将盆中水过500网筛，将孵化的二齡幼虫收集于三角瓶中，置4。C冰箱中备用；防根结线虫功能菌株筛选吸取3mL线虫液于培养皿中，然后加入步骤(2)获得的目的菌株的培养液各lmL,对照加无菌水，每处理三次重复，混合液放入28。C恒温箱中培养，培养13小时后，每皿中加2滴0.05%亚甲基蓝水溶液，510分钟镜检线虫死亡率，比较不同菌株培养液对二齡幼虫的致死效果；防根结线虫功能菌株盆栽复筛分别取连茬4年、8年和11年线虫危害较重的黄瓜大棚土壤，装入高14cm,直径16cin的花盆中。设置功能菌、阿维菌素和空白对照三组处理，每处理20盆，添加物用量为功能菌麸皮培养物5g/盆，0.2%阿维菌素乳油稀释1000倍，于定植后浇灌200mL/盆，用黄瓜做试验植物，将两片真叶的津绿3号黄瓜幼苗按每盆一棵移入，定植后，除阿维菌素处理外，每盆浇清水200mL,之后用称重法浇水，三个月后调查病情指数，分级并记录结果，分析严重度；采用的分级标准为0级，无根结；1级，有少数根结，占全根系的1%25%;2级，根系根结数量中等，占全根系的26%50%;3级，根系根结数量很多，占全根系的51%75%;4级，根系根结数量很多，占全根系的76%100%,病情指数(%)=2(级数x同级株数)/(总株数x4)X100,严重度是指有根瘤根的长度之和占总根系长度的百分比；比较上述结果，确定更优菌株；(4)降解根系自毒物质菌株筛选取大田壤土，风干后粉碎，过筛，215。C干热灭菌8小吋。以苯甲酸或/和香豆素为酚酸类自毒物质试验材料，按酚酸自毒物质的最终浓度50、100、150、200、250ug/kg移取已配置好的浓度为1000mg/L的苯甲酸或香豆素的母液于灭菌土中，加入步骤(3)所确定菌株的麸皮培养物，混合均匀，分装入花盆中，每盆装土1.5kg。将育好的有两片复叶的番茄苗按3棵/盆移栽到上述花盆中，定植后，浇水至饱和，之后按称重法浇水；设空白对照，每处理五次重复；观察幼苗缓苗、长势情况，30天后检测成活率、株高、复叶长度、根系干重生理指标；检测叶片丙二醛和PAL酶活性；比较上述结果，确定本步骤选出的优努菌株；(5)田间小区试验，最终确定优势菌株将经过上述四步确定的优势菌株分别制成固体培养物，选择连荏五年以上，根部病害以及根结线虫发生较为严重的温室大棚进行应用比较试验；采用定苗期穴施方法，将菌剂与细田土混合，定量施入定苗穴中，之后的定苗、浇水等管理采用同常规措施，每处理30m2，三次随机重复；在生长中期和后期检测植株长势、防病、防线虫效果，以及对产量和品质的影响，综合比较以上指标，确定最优菌株。所述的酒红土褐链霉菌的筛选方法，所述的步骤(1)中采用75%乙醇对无菌水冲洗后的植株根系做表面消毒处理。所述的酒红土褐链霉菌的筛选方法，所述的步骤(4)降解根系自毒物质菌株筛选中选择苯甲酸、香豆素混合处理，两种药剂按l:l混合，每种药剂的用量比单一处理减倍。上述酒红土褐链霉菌的应用，其特征在于其活菌培养物用于制备防治栽培连作障碍、防病促生和解毒功能的土壤生物修复剤或调理剤的有效成分。本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于以北方设施蔬菜生产现状为背景，在进一步探明连作障碍的现状、构成和成因的基础上，提出了通过对根际微生态和根系的综合调控，实现高效稳定防治的研究思路，采用独创的分离筛选技术，获得了具有防病、促生和解毒等多种功能的根际益生菌菌株酒红土褐链霉菌S506,酒红土褐链霉菌S506是从蔬菜根际分离获得一株多功能根际优势菌株，将该菌的活菌体施入蔬菜根际，可有效防治枯萎病、根腐病、根结线虫病等多种蔬菜根部病害，并具有显著的促迸根系发育和降解根系自毒物质功能，在有效防治蔬菜、果树、药材等普遍发生的连作障碍难题具有广阔应用前景。图1是本发明中菌种的菌落形态图片。图2是本发明中的菌丝形态图片。图3是本发明中的分生孢子图片。具体实施例方式本发明提供的菌种是链霉菌属酒红土褐链霉菌("r0^^7j/C6^t/7>M:a/5^r^^/)，暂定名为S506，已于2008年9月11日提交中国普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.2664。该菌种是从河北省栾城县番茄根际土壤分离获得的。(1)拮抗菌株的分离筛选选用河北省栾城县境内栽培的番茄植株，去掉植株根部土壤，随机剪取新生主根和毛细根，置于含玻璃珠的无菌水中，充分摇动，将根取出，获得土壤悬浮液；取出的根系先用无菌水冲洗，然后作表面消毒处理，优选采用75%乙醇。用无菌水冲)争残余乙醇，于无菌研钵中研成糊状，制作根系悬液；将上述悬液摇匀后，进行稀释，取0.05-0.15ml涂布于高氏一号培养基上，24-26。C培养71-73小时，分离长势良好的链霉菌菌株；纯化后，进行平板纯培养；制取链霉菌菌块，分别以立枯丝核菌(/力7》(X^/7/5SP.)、镰刀菌(^/^r/^7/sp.)或腐霉菌(/^MW/T/sp.)病原菌为靶标，在PDA平板上迸行对峙培养，病原菌与目的菌相距3cm,每处理3次重复，同吋于PDA平板上单独接种病原菌作对照；一周后检查对峙培养结果，根据病原菌在对峙方向的菌落半径、对照菌落半径廿算抑菌率；抑菌率％=(对照菌落半径对峙菌落半径)/对照菌落半径xl00X,选择抑菌率高且对多种病原同吋具有防效的菌株参与下步筛选试验；(2)防病促生菌株的筛选采用育苗钵异步生测法，分别对步骤(1)获得的菌株进行防病和促生功能比较试验，栽培基质按大田壤土农家肥:蛭石=6-8:1-3:0.5-1.5比例配制，参试目的菌株和病原菌都制成固体培养物，按1%比例与上述培养基质混合；病原菌和生防菌混合接种的栽培基质用于抗病性检测，目的菌单独接种的用于促生效果检测，目的菌和病原菌均按栽培基质1%的质量比接种，基质混合均匀后，填装于育苗钵中；挑选两叶一心长势均匀一致的番茄幼苗移栽于上述培养钵中，每处理50棵，各分2组，随机排列，置于日光温室中培养；侵染率调査30天后将根挖出，调查病情指数；促生结果调查待番茄长到45片真叶时，将番茄苗整株挖出，检测整株鲜重、地上部干重、叶面积、主根长、根干重指标。综合比较抗病和促生效果，确定优势菌株；(3)防根结线虫菌株的筛选二齡幼虫的培养在黄瓜生长后期，挖取根结线虫发病重、根结多的黄瓜根，用清水洗去根部泥土，剪成长lcm的根段，放入500mL三角瓶中，倒入200mL0.5%NaC10溶液，甩力摇3分钟，混合溶液过100目筛，用无菌水冲洗筛上碎片5次，溶液再过500目筛，用无菌水冲洗筛上物，液体收集到容器中，获得卵悬浮液。将收集到的卵块或卵粒置于中性滤纸上，置于200目网筛上，网筛置于盛有清水的盆中，水位高度为浸湿滤纸，然后置于28。C恒温箱中孵化，每24小吋将盆中水过500网筛，将孵化的二齡幼虫收集于三角瓶中；置4。c冰箱中备用；防根结线虫功能菌株筛选吸取3nl线虫液于培养皿中，然后加入步骤(2)获得的目的菌株的培养液各lmL，对照加无菌水，每处理三次重复，混合液放入28。C恒溫箱中培养，培养13小时后，每皿中加2滴0.050《亚甲基蓝水溶液，510分钟镜检线虫死亡率，比较不同菌株培养液对二齡幼虫的致死效果；防根结线虫功能菌株盆栽复筛分别取连茬4年、8年和11年线虫危害较重的黄瓜大棚土壤，装入高14cm，直径16cm的花盆中。设置功能菌、阿维菌素和空白对照三组处理，每处理20盆，添加物用量为功能菌麸皮培养物5g/盆，0.2%阿维菌素乳油稀释1000倍，于定植后浇灌200mL/盆，用黄瓜做试验植物，将两片真叶的津绿3号黄瓜幼苗按每盆一棵移入，定植后，除阿维菌素处理外，每盆浇清水200mL,之后用称重法浇水，三个月后调查病情指数，分级并记录结果，分析严重度；采用的分级标准为0级，无根结；1级，有少数根结，占全根系的1%25%;2级，根系根结数量中等，占全根系的26%50%;3级，根系根结数量很多，占全根系的51%75%;4级，根系根结数量很多，占全根系的76Q/。1(F/。，病情指数(%)=2(级数x同级株数)/(总株数X4)xlOO,严重度是指有根瘤根的长度之和占总根系长度的百分比；比较上述结果，确定更优菌株；(4)降解根系自毒物质菌株筛选取大田壤土，风干后粉碎，过筛，215。C干热灭菌8小时。以苯甲酸、香豆素为酚酸类自毒物质试验材料，按酚酸自毒物质的最终浓度50、100、150、200、250ug/kg移取已配置好的浓度为1000mg/L的苯甲酸或香豆素的母液于灭菌土中，加入步骤(3)所确定菌株的麸皮培养物，混合均匀，分装入花盆中，每盆装土1.5kg。苯甲酸、香豆素的混合处理中，两种药剤按l:l混合，每种药剤的用量比单一处理减倍。将育好的有两片复叶的番茄苗按3棵/盆移栽到上述花盆中，定植后，浇水至饱和，之后按称重法浇水；设空白对照，每处理五次重复；观察幼苗缓苗、长势情况，30天后检测成活率、株高、复叶长度、根系干重生理指标；检测叶片丙二醛和PAL酶活性；比较上述结果，确定本步骤选出的优势菌株；(5)田间小区试验，最终确定优势菌株将经过上述四步确定的优势菌株分别制成固体培养物，选择连茬五年以上，根部病害以及根结线虫发生较为严重的温室大棚进行应用比较试验；采用定苗期穴施方法，将菌剤与细田土混合，定量施入定苗穴中，之后的定苗、浇水等管理采用同常规措施，每处理30M2,三次随机重复；在生长中期和后期检测植株长势、防病、防线虫效果，以及对产量和品质的影响，综合比较以上指标，确定具有如下形态特征和培养特征的最优菌株。1、形态特征酒红土褐链霉菌S506在大多数培养基上生长良好，革兰氏染色阳性；在高氏合成1号琼脂和G丫M琼脂等培养基上生长14天后，菌落呈圆形，基内菌丝发育良好，无橫隔，不断裂；气生菌丝丰茂，多分枝；孢子丝螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑。2、培养特征在不同培养基上进行了菌体培养试验，观察了气生菌丝、基内菌丝颜色和产色无情况，结果见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3、细胞型化学组分分析菌株S506的全细胞水解液含有L丄-DAP(L丄-二氨基庚二酸D涵no。加e，1cacid),无特征性糖；细胞壁属于I型，糖型C。4生理生化特征菌株S605的生理生化特征试验结果见表2。表2菌株S506的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2中+代表阳性；一代表阴性W代表弱阳性。菌株S506的16SrDNA序列与GenBank中相关序列Blast比对的结果表明，该菌株属于链霉菌属，与酒红土褐链霉菌6^r6^^7/77J/C6^1/77^CH/5^r^P75"同源性很高，为99.8%。根据形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析，将该菌种S506定为酒红土褐链霉菌(5L^p^77j/ca[/777^:a/^/r^^/5")。本发明所述的酒红土褐链霉菌(v5^厂6^^/7ZKC6^^7力^H/^/A^^/S)S506的应用，主要是利用其活菌培养物作为有效成分，生产具有防病促生和解毒功能的土壤生物修复剤或调理剤，用于连作障碍的防治。活菌培养物的制备即可液体深层发酵也可固体发酵，对培养基物料无特殊要求，'满足菌株生长的碳源、氮源、磷源和无机盐即可，麸皮、米糠、淀粉、各类渣油饼粕以及磷酸盐、食盐等均可用作培养物料，对PH值无特殊要求，培养过程适当通气或搅拌。实施例1酒红土褐链霉菌S506液体发酵菌剤A、菌种活化将酒红土褐链霉菌接种至高氏合成培养基平板上，28-35°C培养，反复转接2-3次，培养1周，使菌种活化；取出观察菌体的生长状态，以电子显微镜扫描，菌丝和分生孢子照片如图1所示。由图1可见，本发明的酒红土褐链霉菌S506的菌落呈圆形，基内菌丝无橫隔，不断裂；气生菌丝丰茂，多分枝；孢子丝螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑。B、酒红土褐链霉菌的液体种子制备种子培养物料由质量比为8o《的鼓皮或米糠粉、战玉米粉、2%豆饼粉、2。^甘油、0.1%硝酸钠、O.战氯化钠、0.3貌炭酸钙、0磷酸氫二钾、0.05%硫酸镁、0.05%硫酸亚铁和其余的水组成，自然PH,分装于三角瓶121-130。C高压灭菌30-60分钟，冷却至25-35°C，接种步骤A得到的酒红土褐链霉菌菌种，在25-30。C下，摇瓶培养48-72小时；C、酒红土褐链霉菌的液体深层发酵以步骤B的培养物为种子，以3-10^的比例接种于液体发酵罐的液体培养物料中，液体培养物料和培养条件与步骤B相同，通气搅拌培养72小吋，加入两倍体积的草炭粉吸附制得链霉菌菌剤。实施例2酒红土褐链霉菌S506液体发酵菌剤A、步骤A同实施例1;B、C、酒红土褐链霉菌S506的种子培养物料由质量比为2^的麸皮粉、2%玉米粉、1%豆饼粉、0.5%甘油、O.l貌肖酸钠、O.战氯化钠、CU碳酸钙、0.3%磷酸氳二钾、0.050^兗酸镁、0.05°^兗酸亚铁和其余的水组成，发酵及制剤条件同实施例1。实施例3酒红土褐链霉菌S506的液体发酵菌剂A、步骤A同实施例1;B、C、酒红土褐链霉菌的液体种子培养物料由质量比为4%的麸皮粉、4%玉米粉、2%豆饼粉、0.5%甘油、O.l貌肖酸钾、0,4%氯化钠、0.3%碳酸钙、0.3%磷酸氳二钾、0.05o儀fb酸镁、0.05%硫酸亚铁和其余的水组成。种子培养物料由质量比为4%的麸皮粉、4%玉米粉、2%豆饼粉、0.5%甘油、0.1%硝酸钾、0.4%氯化钠、0.3%碳酸钙、0.3%磷酸氳二钾、0.05%硫酸镁、0.05%硫酸亚铁和其余的水组成，发酵及制剤条件同实施例1。实施例4酒红土褐链霉菌S506的固体发酵菌剤A、步骤A同实施例1;B、酒红土褐链霉菌的液体种子制备种子培养物料由质量比为战的麸皮或米糠粉、2%玉米粉、0.5%豆饼粉、0.5%甘油、O.l站肖酸钠、O.戦氯化钠、0.3貌炭酸钙、0.3%磷酸氯二钾、0.05%硫酸镁、0.05%硫酸亚铁和其余的水组成,自然PH，分装于三角瓶121-130。C高压灭菌30-60分钟，冷却至25-35°C,接种步骤A得到的酒红土褐链霉菌菌种，在25-30。C下，摇瓶培养犯-72小时；C、酒红土褐链霉菌的固体发酵固体发酵物料由质量比为45o《的麸皮或米糠，85^的麦饭石粉，1.5%的豆饼粉，O.(FZ的硝酸钾、0.15幼勺磷酸氳二钾、0.15站勺氯化钠、O.战的碳酸钙和其余的水组成，121-130。C高压灭菌，冷却至25-35°C,按3-10%的比例接入步骤B的液体菌种，搅拌均匀，分装于无菌曲盘，在30土5。C条件下，间断通气培养72小吋，35-5CTC低温风干至物料含水量在12%以下，制得链霉菌菌剤活菌含量2xl09cfu-g—1。实施例5酒红土褐链霉菌S506的固体发酵菌剤A、步骤A同实施例4;B、液体种子培养基由质量比为鄉的麸皮粉、战玉米粉、2%豆饼粉、0.5%甘油、0.1°/。硝酸钠、0.戦氯化钠、0.战碳酸钙、0.战磷酸氳二钾、0.050/。硫酸镁、005%硫酸亚铁和其余的水组成，发酵条件同实施例4;C、酒红土褐链霉菌的固体发酵物料由质量比为35%的麸皮、10%的页岩粉、1%的豆饼粉，0.W的硝酸钾、0.15%的磷酸氯二钾、0.15%的氯化钠、0.战的碳酸钙和其余的水组成，发酵及制剤条件同实施例4。实施例6酒红土褐链霉菌S506的固体发酵菌剤A、B、同实施例4;C、酒红土褐链霉菌的固体发酵物料由质量比为5Qo《的麸皮、5o义的沸石粉、1%的豆饼粉，O.，勺硝酸钾、0.15Q《的磷酸氢二钾、0.15幼勺氯化钠、O.战的碳酸钙和其余的水组成，发酵及制剤条件同实力包例4。酒红土褐链霉菌菌剂应用示例1(在育苗期应用)在蔬菜育苗基质中，按1%质量比加入酒红土褐链霉菌菌剤，混合均匀后，撒酒红土褐链霉菌菌剂应用示例2(在定植期应用)在蔬菜定植吋，将酒红土褐链霉菌菌剂与5倍的细田土或充分腐熟的有机肥混合，搅拌均匀，然后将混合物均匀施入定植穴中。之后的定苗，培土，浇水同常规操作。以上应用以及对根际微生物区系、对根系自毒物质的解除和田间应用等效果试验结果表明，酒红土褐链霉菌S506具有如下综合功能(1)显著促迸根系发育，提高植株对旱、盐碱、土传病等的抗逆性能，促进了植株对土壤养分的有效利用，为生长中后期的优质高产奠定了基础；(2)显著提高根际活菌总量，并改善根际微生物区系结构，使细菌、放线菌数量提高，丝状真菌、病原菌数量下降；(3)有效控制镰刀菌、丝核菌、根结线虫等病原物对根系的侵染，防效与常用的化学杀菌剤五氯硝基本相当，对线虫的防治超过了阿维菌素；(4)降解酚酸类根系自毒物质，显著缓解根系分泌和上荏根系腐烂释放毒素对根系的伤害。在连茬多年的蔬菜老区应用，可以显著提高育成苗的质量，病害少，根系发达，缩短移植后的缓苗时间，提高后期抗病能力。在生长中后期，可有效控制根部病害和地上部病害的发生，减少用药奶50%，综合产量增加25%以上。近几年，在河北、山东、河南、福建、上海等地的多种蔬菜和果树上进行了应用，均表现出了同样的抗病、增产和品质改善效果，均超过了国内外的同类技术和产品。详细试验数据见"应用试验报告"(附件)。上述关于酒红土褐链霉菌、筛选方法及应用的描述仅作为本发明几种技术方案提出，不作为对其单一限制条件。权利要求1、一种酒红土褐链霉菌，其保藏编号为CGMCCNo.2664。2、根据杈利要求l所述的酒红土褐链霉菌，其特征在于该菌种DNA序列测定结果为GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATCCTCGCAGGCATCTGCGAGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAG丌GGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTMCTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGMAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCMCATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCA丌AAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCTTGTGGTGCTGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGTCACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCC丌ATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGA丌GGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACG丌CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGGAGCTGTCG。3、根据杈利要求l所述的酒红土褐链霉菌的筛选方法，其特征在于包括如下步骤(1)拮抗菌株的分离筛选选用河北省栾城县境内栽培的番茄植株，去掉植株根部土壤，随机剪取新生主根和毛细根，置于含玻璃珠的无菌水中，充分摇动，将根取出，得土壤悬浮液；取出的根系先用无菌水冲洗，然后作表面消毒处理，用无菌水冲)争残余乙醇，于无菌研钵中研成糊状，制作根系悬液；将上述悬液摇匀后，进行稀释，取0.05-0.15ml涂布于高氏一号培养基上，24-26。C培养71-73小时，分离长势良好的链霉菌菌株，纯化后，进行平板纯培养；制取链霉菌菌块，分别以立枯丝核菌(//77》^:to/7"s口.)、镰刀菌(f〃wr7》/77sp.)或腐霉菌(Pj^力/^7SP.)病原菌为靶标，在PDA平板上进行对峙培养，病原菌与目的菌相距3cm,每处理3次重复，同吋于PDA平板上单独接种病原菌作对照;一周后检查对峙培养结果，根据病原菌在对峙方向的菌落半径、对照菌落半径廿算抑菌率；抑菌率％=(对照菌落半径对峙菌落半径)/对照菌落半径xlOOX,选择抑菌率高且对多种病原同吋具有防效的菌株参与下步筛选试验；(2)防病促生菌株的筛选采用育苗钵异步生测法，分别对步骤(1)获得的菌株进行防病和促生功能比较试验，栽培基质按大田壤土农家肥:蛭石=6-8:1-3:0.5-1.5比例配制，参试目的菌株和病原菌都制成固体培养物，按1%比例与上述培养基质混合；病原菌和生防菌混合接种的栽培基质用于抗病性检测，目的菌单独接种的用于促生效果检测，目的菌和病原菌均按栽培基质1%的质量比接种，基质混合均匀后，填装于育苗钵中；挑选两叶一心长势均匀一致的番茄幼苗移栽于上述培养钵中，每处理50棵，各分2组，随机排列，置于日光温室中培养；侵染率调查30天后将根挖出，调查病情指数；促生结果调查待番茄长到45片真叶时，将番茄苗整株挖出，检测整株鲜重、地上部干重、叶面积、主根长、根干重指标；综合比较抗病和促生效果，确定优势菌株；(3)防根结线虫菌株的筛选二齡幼虫的培养在黄瓜生长后期，挖取根结线虫发病重、根结多的黄瓜根，用清水洗去根部泥土，剪成长lcm的根段，放入500mL三角瓶中，倒入200mL0.5%NaC10溶液，用力摇3分钟，混合溶液过100目筛，用无菌水冲洗筛上碎片5次，溶液再过500目筛，用无菌水冲洗筛上物，液体收集到容器中，获得卵悬浮液，将收集到的卵块或卵粒置于中性滤纸上，置于200目网筛上，网筛置于盛有清水的盆中，水位高度为不低于浸湿滤纸，然后置于28。C恒温箱中孵化，每24小时将盆中水过500网筛，将孵化的二齡幼虫收集于三角瓶中，置4。C冰箱中备用；防根结线虫功能菌株筛选吸取3mL线虫液于培养皿中，然后加入步骤(2)获得的目的菌株的培养液各lmL，对照加无菌水，每处理三次重复，混合液放入28。C恒温箱中培养，培养13小时后，每皿中加2滴0.05%亚甲基蓝水溶液，510分钟镜检线虫死亡率，比较不同菌株培养液对二龄幼虫的致死效果；防根结线虫功能菌株盆栽复筛分别取连茬4年、8年和11年线虫危害较重的黄瓜大棚土壤，装入高Wcm,直径16cm的花盆中。设置功能菌、阿维菌素和空白对照三组处理，每处理20盆，添加物用量为功能菌麸皮培养物5g/盆，0.2%阿维菌素乳油稀释1000倍，于定植后浇灌200mL/盆，用黄瓜做试验植物，将两片真叶的津绿3号黄瓜幼苗按每盆一棵移入，定植后，除阿维菌素处理外，每盆浇清水200mL,之后用称重法浇水，三个月后调查病情指数，分级并记录结果，分析严重度；采用的分级标准为0级，无根结；1级，有少数根结，占全根系的^25%;2级，根系根结数量中等，占全根系的26%50o《；3级，根系根结数量很多，占全根系的5^75%;4级，根系根结数量很多，占全根系的76%100%,病情指数(%)=2(级数x同级株数)/(总株数X4)xlOO,严重度是指有根瘤根的长度之和占总根系长度的百分比；比较上述结果，确定更优菌株；(4)降解根系自毒物质菌株筛选取大田壤土，风干后粉碎，过筛，215。C干热灭菌8小吋。以苯甲酸或/和香豆素为酚酸类自毒物质试验材料，按酌酸自毒物质的最终浓度50、100、150、200、250ug/kg移取已配置好的浓度为1000mg/L的苯甲酸或香豆素的母液于灭菌土中，加入步骤(3)所确定菌株的麸皮培养物，混合均匀，分装入花盆中，每盆装土1.5kg。将育好的有两片复叶的番茄苗按3棵/盆移栽到上述花盆中，定植后，浇水至饱和，之后按称重法浇水；设空白对照，每处理五次重复；观察幼苗缓苗、长势情况，30天后检测成活率、株高、复叶长度、根系干重生理指标；检测叶片丙二醛和PAL酶活性；比较上述结果，确定本步骤选出的优势菌株；(5)田间小区试验，最终确定优势菌株将经过上述四步确定的优势菌株分别制成固体培养物，选择连茬五年以上，根部病害以及根结线虫发生较为严重的温室大棚进行应用比较试验；采用定苗期穴施方法，将菌剂与细田土混合，定量施入定苗穴中，之后的定苗、浇水等管理采用同常规措施，每处理30m2,三次随机重复；在生长中期和后期检测植株长势、防病、防线虫效果，以及对产量和品质的影响，综合比较以上指标，确定最优菌株。4、根据权利要求3所述的酒红土褐链霉菌的筛选方法，其特征在于所述的步骤(1)中采用75%乙醇对无菌水冲洗后的植株根系做表面消毒处理。5、根据权利要求3所述的酒红土褐链霉菌的筛选方法，其特征在于所述的步骤(4)降解根系自毒物质菌株筛选中选择苯甲酸、香豆素混合处理，两种药剤按l:l混合，每种药剤的用量比单一处理减倍。6、根据杈利要求1所述的酒红土褐链霉菌的应用，其特征在于其活菌培养物用于制备防治栽培连作障碍、防病促生和解毒功能的土壤生物修复剤或调理剤的有效成分。全文摘要本发明提供一种链霉菌属酒红土褐链霉菌(Streptomycesvinaceusdrappus)，暂定名为S506，已于2008年9月11日提交中国普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.2664。本发明中菌种的分离筛选方法包括如下步骤(1)拮抗菌株的分离筛选；(2)防病促生菌株的筛选；(3)防根结线虫菌株的筛选；(4)降解根系自毒物质菌株筛选；(5)田间小区试验，最终确定优势菌株。本发明酒红土褐链霉菌S506的应用包括通过液体深层发酵或固体发酵制备活菌培养物，其活菌培养物用于制备防治栽培连作障碍、防病促生和解毒功能的土壤生物修复剂或调理剂的有效成分。文档编号C12N1/20GK101619293SQ200810079468公开日2010年1月6日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者张翠绵,李晓芝,李洪涛,王占武申请人:河北省农林科学院遗传生理研究所