专利名称：：一种头孢菌素c酰化酶及其载体和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，具体地说涉及一种头孢菌素c酰化酶，含有该头孢菌素C酰化酶基因的表达载体；以及用该酶制备7-氨基头孢烷酸的方法。技术背景头孢菌素类药物(Cephalosporins)与青霉素一样，是一族P-内酰胺类广谱抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并加速细胞壁的破坏而起到杀菌的作用。头孢菌素的抗菌部位为其母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanicacid,7-ACA)，由双氢噻嗪环和P-内酰胺环融合而成，它是各类半合成头孢菌素类抗生素药物的重要中间体。7-ACA主要由头孢菌素C(CephalosporinC，CPC)通过酶法或化学法裂解脱去7-位的D-a-氨基己二酰侧链得到。酶法具有工艺简单、安全、高效、无污染及产品质量稳定等优点，与传统的、污染严重的化学法相比具有较大的竞争优势，因而用酶法裂解CPC生产7-ACA已成为发展趋势。用酶法裂解生产7-ACA，分为一步酶法和两步酶法。其中，两步酶法是利用来源不同的两种酶进行两步催化反应首先，CPC在D-氨基酸氧化酶(D-AminoAcidOxidase,DAAO)的作用下，生成一个具有酮基的中间体，此中间体不稳定，易被同时生成的过氧化氢(H202)氧化为戊二酰基-7-氨基头孢垸酸(011^171-7-amidocephalosporanicAcid,GL-7-ACA)，然后其在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去侧链，生成7-ACA。一步酶法是利用头孢菌素C酰化酶(CephalosporinCacylase，CPC酰化酶)直接催化头孢菌素C，脱去7-位的D-a-氨基己二酰侧链，一步生成7-ACA。与两步酶法相比，一步酶法更为简单、便捷，因而日益受到重视。CPC酰化酶与GL-7-ACA酰化酶，均属于头孢菌素酰化酶，只是二者的底物特异性不同。天然的GL-7-ACA酰化酶只能催化GL-7-ACA生成7-ACA，不能催化CPC底物；而天然的CPC酰化酶虽然能够催化CPC—步生成7-ACA，但其对CPC的催化活性只为GL-7-ACA催化活性的2—4%(LiY等.EurJBiochem,1999，262(3):713-719.SaitoY等.ApplEnvirMicrob,1996，62(8):2919-2925)。产生CPC酰化酶的天然菌株主要为假单胞菌CP化i^omo"osw.)。已经克隆测序的基因来自尸化Mt/omo"(XSsp.N176(USP5，192,678)和P化wcfomowossp.SE83acyII(Matsuda等.J.Bacteriol.,1987,169:5821-5829)等。目前对CPC酰化酶的研究主要集中在对CPC酰化酶以及GL-7-ACA酰化酶进行改造，实现底物特异性转移以提高它们对CPC的活性和特异性。2001年，对来源于P"w6/omo"wsp.KAC-1的GL-7-ACA酰化酶的三维结构进行了成功测定，该结构表明更为广泛的相互作用发生在GL-7-ACA酰化酶与底物GL-7-ACA的戊二酰侧链之间(KimY等.Chem.Biol.，2001，8:12531264)。对源于户N176的CPC酰化酶的突变研究表明，一种在215位、296位和309位三个位点进行突变的突变体表现出了比GL-7-ACA更高的CPC酶活，在一定程度上实现了底物特异性的转移(PollegioniL等.ProteinScience,2005，14(12):3064~3076)。对i^ewcfomo"oystrainSE83acyll的研究(WO2005/014821Al)也取得了显著进展，通过对Vall22Ala-Glyl40Ser-Phe297Arg(Phe58(3Arg)-Ile314Thr(Ile75|3Thr)-11e415Val(11el76pVal)-Ser710Cys(Ser471(3Cys)等多点突变提高了对底物CPC的活性和特异性，CPC酶活相对于野生菌提高810倍左右，并能有效地用于一步酶法催化CPC生产7-ACA。因此通过基因工程方法对CPC酰化酶进行改造，是提高CPC酰化酶活性和底物特异性的有效途径。
发明内容本发明第一个目的是提供一种催化活性高且产物耐受性高的CPC酰化酶。本发明第二个目的是提供含有上述CPC酰化酶编码基因的载体和转化体。本发明第三个目的是提供一种上述CPC酰化酶在制备7-氨基头孢垸酸上的应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案本发明一种CPC酰化酶，其编码基因为下述DNA序列之一(a)具有SEQIDNO:4所示的DNA序列；(b)与SEQIDNO:4所示的DNA序列具有80X以上同源性的DNA序列，且编码具有CPC酰化酶活性的蛋白质；(c)在高严谨条件下可与SEQIDNO:4所限定的DNA序列杂交，且编码具有CPC酰化酶活性的蛋白质的DNA序列。上述CPC酰化酶，其中所述(b)优选为具有85%以上同源性；更优选的(b)为具有90%以上的同源性。上述CPC酰化酶，其具有如下的氨基酸序列在SEQIDNO:3的氨基酸序列基础上，至少下列一个位点的氨基酸被其他氨基酸所替换，其中所述的氨基酸为263位精氨酸(Arg263)、270位甲硫氨酸(Met270)、295位脯氨酸(Pro295)、296位组氨酸(His296)、309位组氨酸(His309)、666位亮氨酸(Leu666)、675位丙氨酸(Ala675)及677位亮氨酸(Leu677)。所述的氨基酸残基均位于底物结合及催化的活性中心部位以及底物进出活性中心的通道位置上。上述CPC酰化酶，优选突变为在SEQIDNO:3的氨基酸序列基础上，至少下述一个位点的氨基酸被所述的氨基酸替换270位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸(Met270Phe);309位组氨酸替换为缬氨酸(His309Val);675位丙氨酸替换为甘氨酸(Ala675Gly);677位亮氨酸替换为苯丙氨酸(Leu677Phe)。本发明一种CPC酰化酶CAase-TUl，具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。CAase-TUl是在SEQIDNO:4所编码氨基酸序列(SEQIDNO:3)的基础上，其第677位的亮氨酸被苯丙氨酸取代(Leu677Phe)。本发明一种CPC酰化酶CAase-TU2，具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。CAase-TU2是在SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的基础上，其第675位的丙氨酸被甘氨酸取代(Ala675Gly)。所述的SEQIDNO:4所示的DNA序列，是根据SEQIDNO:3的氨基酸序列，面向大肠杆菌宿主表达所需要的优选密码子和基因高表达所需要的适宜鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)碱基含量，反向设计并从头合成的新的DNA序列，该DNA序列具有如下特征原天然CPC酰化酶acyll基因(SEQIDNO:2，2325bp)的高度稀有密码子(使用频率为10。％以下)从46个下降到0个；一般稀有密码子(使用频率为1020。/O从76个下降到43个；原天然CPC酰化酶acyll基因(SEQIDNO:2)中的GC碱基含量从69.0%下降到59.8%;同时，在基因的10601065位碱基处引入五coiI限制性内切酶位点GAATTC，并删除了原基因SEQIDNO:2内部的五coiI、5amM和的酶切位点。所述的SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，是在来自尸wi^owo"osp.SE83acyII的野生CPC酰化酶(其氨基酸序列如SEQIDNO:l所示)的基础上，在Vall22Ala-Glyl40Ser-Phe5邓Arg-Ile75pThr-Ilel76|3Val-Ser471(3Cys六个位点引入氨基酸突变而得到的(WO2005/014821Al)。所述的来自尸MW6fowowwsp.SE83acylI的野生的CPC酰化酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:l所示，由774个氨基酸残基组成，包括239个氨基酸残基的a亚基序列和535个氨基酸残基的卩亚基序列，其原始CPC酰化酶基因序列为SEQIDNO:2所示的DNA序列。含有上述本发明CPC酰化酶编码基因的重组表达载体、宿主菌均属于本发明的保护范围。按照本领域技术人员熟知的方法，可以构建含有上述CPC酰化酶编码基因的重组载体和转化体。含有上述CPC酰化酶编码基因的表达载体，可以是组成型或诱导型的载体。所述的诱导型表达载体，包括pET或其它系列诱导型表达载体。如一种携带CPC酰化酶突变体基因的诱导型表达载体PET28-CPCacy(见图1)。所述的组成型表达载体，包括与麦芽糖结合蛋白MBP融合表达的pMKC组成型表达载体(YUH.M.等，JournalofMolecularBiocatalysisB:Enzymatic,2006,43，118-123)及其它高效组成型表达载体。如携带CPC酰化酶突变体基因的一个组成型表达载体pMKC-CPCacy(见图2)。本发明采用诱导型表达载体，其所述的宿主菌优选为BL21(DE3)(Promega公司)或JM109(DE3)(鼎国公司)或其它适宜菌株等作为受体菌。本发明采用组成型表达载体，其宿主菌优选为co//TBI(NewEnglandBiolab公司)、五.co/fJM105(赛百盛公司)或其它适宜菌株等作为受体菌。上述CPC酰化酶转化体的构建方法，可以采用常规的氯化钙法或电穿孔转化法(SambrookJ等.MolecularCloning:ALaboratorymanual.ColdSpringHarbor:NY:ColdSpringHarborLaboratoryPress.1989)。上述CPC酰化酶、携带有上述CPC酰化酶编码基因的重组表达载体或转化体在制备7-氨基头孢垸酸上的应用。本发明CPC酰化酶突变体的粗酶液首先采用硫酸铵饱和沉淀进行初步纯化，进一步采用树脂、硅胶或亲和层析柱等载体进行固定化，即可用于从CPC制备7-氨基头孢垸酸。本发明具有如下优点(1)、本发明CPC酰化酶基因表达活性高，可以在重组大肠杆菌中高活性表达；(2)、本发明CPC酰化酶催化活性高，且成功实现了底物特异性的转移，对底物CPC的催化活性是GL-7-ACA的4~6倍左右；(3)、本发明CPC酰化酶的产物耐受性高。最终，采用本发明提供的改良型CPC酰化酶，能够高效催化底物CPC生成产物7-ACA，为7-ACA的一步酶法工业化生产奠定了坚实基础。图l.携带CPC酰化酶基因的重组质粒pET28-CPCacy示意图图2.携带CPC酰化酶基因的重组质粒pMKC-CPCacy示意图图3.重组大肠杆菌诱导型和组成型表达CPC酰化酶SDS-PAGE图其中M:蛋白质分子量标准；1为JM105/pMKC-CPCAcy，其中68kDa条带为CPC酰化酶a亚基与MBP融合表达产物，58kDa条带为CPC酰化酶(3亚基；2为BL21(DE3)/pET28a-CPCacy，其中58kDa条带为CPC酰化酶卩亚基，28kDa条带为CPC酰化酶a亚基(含3.4kDa融合肽链)图4.本发明CPC酰化酶突变体催化底物CPC合成7-ACA的的高压液相色谱(HPLC)图，其中A:CPC标准品；B:7-ACA标准品；C:诱导型表达收获的CPC酰化酶的催化反应液。具体实施方式实施例1头孢菌素C酰化酶基因序列的设计与合成(1)本发明CPC酰化酶基因设计采用Genebank中尸wwcfomo"assp.SE83cephalosporinacylaseII的蛋白质序列(SEQIDNO:1,GenbankAAA25690)，同时引入SEQIDNO:3中的六个突变位点Vall22Ala-Glyl40Ser-Phe58卩Arg-Ile75pThr-Ilel76(3Val-Ser471|3Cys(WO2005/014821A1)，利用在线服务器DNAWorks(网址http:〃helixweb.nih.gov/dnaworks)反向设计CPC酰化酶的基因序列。根据大肠杆菌密码子简并性及偏好性，上述面向大肠杆菌宿主高表达而重新设计的CPC酰化酶基因序列为SEQIDNO:4，该序列中//一般稀有密码子(使用频率低于20%)从野生基因SEQIDNO:2的76个降低至43个，占全基因的5.6%;高度稀有密码子(使用频率低于10%)从SEQIDNO:2的46个下降为0;GC含量从SEQIDNO:2的68.99%降低至57.81%，从而有利于在大肠杆菌中获得高活性的CPC酰化酶。(2)新基因SEQIDNO:4采用AssemblyPCR合成所需的寡DNA片断(Oligos)设计用DNAWorks服务器将全长为2328bp的CPC酰化酶基因SEQIDNO:4分为两段进行01igos的设计。第I段总长为1065bp，DNAWorks服务器输出34条Oligos用于该基因的合成。第II段总长为1263bp，DNAWorks服务器输出38条Oligos用于该基因的合成。各Oligos的长度约为50bp，Oligos序列之间有20-25bp左右的重叠区。各序列重叠部分退火温度为58±1.9°C。在第I段基因两端通过引物Aup/A^引入BawHI/五coRI酶切位点。Aup序列为CGGGATCCATGACGATGGCGGCGAAA(下划线为BamHI酶切位点)，A^序列为GGAATTCGCGGTCCGCACCACCGCGAACTGCAAT(下划线为五coRI酶切位点)。在第II段基因两端通过引物811/61(^引入&0111////"(1111酶切位点。B叩序列为GGAATTCGATATTGTGGAAACCCGTCA(下划线为￡coRI酶切位点)，B!。w序列为CCCAAGCTTTCACGCCGGCACTA(下划线为///"dIII酶切位点)。(3)第I段基因的AssemblyPCR合成过程由北京三博远志生物技术有限公司合成34条Oligos序列和引物。将各Oligos以等浓度混合，取7混合液为模板，采用P/wDNA聚合酶进行高保真扩增。PCR扩增反应体积为20ul，户/"DNA聚合酶的浓度根据使用说明书的推荐确定；浓度为2.5mM的单核苷酸混合液(dNTPs)2.0ul;94。C变性5min后，进入35个循环的变性一退火一延伸过程(94。C，30s;58。C，45s;72。C，2min)，最后72。C延伸10min。该步骤可获得含第I段基因的混合液；以该混合液为模板，用第(2)步设计的基因两端引物Aup和A一再次进行PCR扩增，扩增反应条件同上，即可获得最终的1065bp第I段目标基因。(4)第II段基因的AssemblyPCR合成过程基本同第I段基因。Oligos和引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。将各Oligos以等浓度混合，取7|iL混合液为模板，采用P/wDNA聚合酶进行高保真扩增。扩增反应条件和合成过程同上。最后以第(2)步设计的Bup和B^为基因两端引物，再次进行PCR扩增，扩增反应条件同上，即可获得最终的1263bp第II段目标基因。(5)第I段和第II段基因的连接将人工合成的两段基因以及质粒pUC18分别采用限制性内切酶BawHI/￡coRI和￡coRI/i//"dIII双酶切。pUC18和各限制性内切酶和缓冲液均从宝生物工程(大连)有限公司购得。酶切反应体积20|aL，质粒用量4pL，基因片断(PCR产物)10|aL，各酶用量lpL，缓冲液2pL，采用无菌水补足20pL。37"C反应4小时，采用常规0.7%琼脂糖凝胶电泳，分别回收得到基因片断和质粒骨架。采用T4DNA连接酶(Promega公司)在4"进行连接反应14小时。将连接反应物转化宿主菌Eco//JM109感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，涂布LB平板(氨苄青霉素抗性，Amp+)，挑选阳性克隆，进行摇瓶培养12h。收获细胞，采用常规试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取小量质粒进行常规酶切和电泳验证，获得重组质粒pUC18-acy，即获得了本发明CPC酰化酶基因的人工设计全序列(SEQIDNO:4)。提交该CPC酰化酶基因进行DNA测序分析(北京三博远志生物技术有限公司)，结果表明，克隆获得的CPC酰化酶基因的全DNA序列与设计结果完全一致(见SEQIDNO:4)。实施例2诱导型表达载体pET28-CPCacy与转化体BL21(DE3)/pET28-CPCacy的构建(1)质粒pET28-CPCacy的构建对实施例1获得的质粒载体pUC18-acy采用SflmHI////m/in双酶切。酶切反应体积20!iL，质粒用量4pL，各酶用量lpL，缓冲液2pL，采用无菌水补足20pL。37"C反应过夜，获得酶切产物CPC酰化酶基因。采用相同方法酶切质粒载体pET28a(Novagen公司)，获得pET28a的线性质粒骨架。用PCR产物回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)纯化酶切产物后，将CPC酰化酶基因和pET28a的线性质粒骨架在4"C采用T4DNA连接酶进行连接反应14h。将连接反应物转化宿主菌JM109感受态细胞，涂布LB平板(卡那霉素抗性，Kan+)，挑选阳性克隆，进行摇瓶培养12h。收获细胞，采用常规试剂盒提取小量质粒进行常规酶切和电泳验证，获得重组质粒pET28-CPCacy(见图1)。(2)转化体BL21(DE3)/pET28-CPCacy的构建采用电穿孔转化法将重组质粒pET28-CPCacy转化大肠杆菌co//BL21(DE3)(Promega公司)。取1(al纯化后的质粒于一个1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电转杯一起置于冰上预冷；将50(ilBL21(DE3)感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min;打开电转仪，调节电压为1250V;将质粒和感受态细胞的混合物转移至已预冷的电转杯中，轻轻敲击使得混合物均匀进入电转杯的底部，同时注意混合物中不能有气泡。将电转杯放入电转化仪，按下电击键，听到蜂鸣声后，向杯中迅速加入800ial的LB液体培养基(配方见《分子克隆指南》)，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。置于37'C，220rpm摇床培养30min。取50(il菌液涂布于含有50pg/ml卡那抗生素的LB固体培养基平板，放入37'C培养箱培养20小时，得基因重组菌BL21(DE3)/pET28-CPCacy。实施例3组成型CPC酰化酶表达载体与转化体的构建质粒pMKC-CPCacy的构建方法同实施例2(1)，采用5flmHI////"^in双酶切，获得CPC酰化酶全基因。同时采用相同方法酶切质粒载体pMKCJqy(YUH.M.等.JournalofMolecularBiocatalysisB:Enzymatic,2006,43,118-123)，获得pMKC的线性质粒骨架。用PCR产物回收试剂盒纯化后，将CPC酰化酶基因和pMKC的线性质粒骨架在4。C采用T4DNA连接酶进行连接反应14h，构建组成型表达重组质粒pMKC-CPCacy(见图2)。转化方法同实施例2(2)，采用电穿孔转化法将pMKC-CPCacy转化大肠杆菌五.co"JM105(天根生化科技(北京)有限公司)，获得转化体JM105/pMKC-CPCacy。实施例4采用OverlapPCR方法构建CPC酰化酶CPCase-TUl基因及其转化体从本发明基因序列SEQIDNO:4出发，通过三步OverlapPCR扩增，引入Leu438(3Phe突变，构建改良型CPC酰化酶CPCase-TUl。第一步以实施例2中pET28-CPCAcy质粒为模板，采用Mup/A438引物进行扩增。其中，Mup的序列为CCGGAATTCGATATTGTGGAAACCCGTCAT(下划线部分为酶切位点)；A438的序列为ACTAACCGGGTTAAACAGTGCGGCCCA(下划线部分为突变引入位点)；尸/"DNA聚合酶扩增常规条件扩增，退火温度60°C，即可获得438P突变位点前片断。第二步扩增采用B438/Mdown引物，其中B438的序列为TGGGCCGCACTGTTTAACCCGGTTA(下划线部分为突变引入位点)，Mdown的序列为CCCAAGCTTTCACGCCGGCACTAATTCTT(下划线部分为///^/111酶切位点)；其它条件同第一步扩增，即可获得438P突变位点后片断。第三步扩增采用上述Mup/Mdown引物，以第一、第二步扩增获得的片断为模板，其它条件同上，即可获得Leu43邓Phe突变的全基因序列。对Leu43邓Phe突变的基因序列和实施例2所得pET28-CPCAcy质粒分别进行￡coRI////"dn双酶切，酶切条件同实施例2(1)。常规0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收突变基因序列以及pET28-CPCAcy的骨架大片断。采用T4DNA连接酶4"C过夜连接14hr，电穿孔法转入JM109感受态细胞，固体LB培养基37°C过夜培养至长出大小适中的单菌落。挑取单菌落接入卡那霉素抗性LB液体培养基，37°C、200rpm过夜培养；提质粒，即可获得P亚基Leu438(3Phe突变的诱导型表达质粒pET28-CPCaseTUl。电穿孔转化大肠杆菌宿主BL21(DE3)，即得转化体BL21(DE3)/pET28-CPCaseTUl。具体实验方法同实施例2。实施例5采用OverlapPCR方法构建CPC酰化酶CPCase-TU2基因及其转化体方法同实施例4，从本发明基因序列SEQIDNO:4出发，通过三步OverlapPCR扩增，引入Ala436pGly-Leu"邓Phe双突变，构建改良型CPC酰化酶CPCase-TU2。其中，第一步扩增采用Mup/A436-438引物对，Mup同上，A436-438的序列为ACTAACCGGGTTAAACAGACCGGCCCA(下划线部分为突变引入位点)；第二步扩增采用B436-438/Mdown引物，Mdown同上，B436-438的序列为TGGGCCGGTCTGTTTAACCCGGTTA(下划线部分为突变引入位点)，第三步扩增以上述第一、第二步扩增获得的436(3、438(3双突变前后片断为模板，其它条件同上，即获得Ala"6(3Gly-Leu438(3Phe双突变的基因序列。转化方法同实施例4，进一步成功构建P亚基Ala436pGly-Leu438(3Phe双突变的诱导型表达质粒pET28-CPCaseTU2。电穿孔转化大肠杆菌宿主BL21(DE3)，即得转化体BL21(DE3)/pET28-CPCaseTU2。实施例6本发明CPC酰化酶基因在诱导型和组成型转化体中的表达试验将实施例2和实施例3获得的本发明CPC酰化酶基因SEQIDNO:4的诱导型表达菌株BL21(DE3)/pET28-CPCacy和组成型表达菌株JM105/pMKC-CPCacy进行平行培养。首先在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中(培养基组成为50ml/300ml摇瓶，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0)分别接种单菌落，37°C、200rpm培养12h，制作种瓶。从种瓶中按照2%接种量转接到含50mg/L卡那霉素的发酵培养基中(培养基为玉米浆50g/L，酵母膏10g/L，NH4C12.5g/L，甘油5.0g/L，KH2P042.3g/L，K2HP0416.4g/L，pH7.5)，28°C、200rpm条件下摇瓶培养24小时。对于诱导型表达转化体BL21(DE3)/pET28-CPCacy，采用终浓度为ImM/L异丙基-卩-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导CPC酰化酶的表达。对于组成型表达转化体JM105/pMKC-CPCacy，不加IPTG，直接在28。C相同条件下摇瓶培养24小时。收集菌体，进行常规十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺蛋白质凝胶电泳(SDS-PAGE)检测CPC酰化酶的表达，本发明CPC酰化酶基因SEQIDNO:4的诱导型和组成型表达都获得了大量的活性蛋白(见图3)。以CPC为底物，采用高压液相色谱法(HPLC)测定CPC酰化酶的酶活。首先制备粗酶液4ml菌液在4"C、8000rpm离心10min，所得沉淀用0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)洗涤两次后重悬于2ml缓冲液，冰浴超声10min(320W，3X3X60次)；在4。C，15000rpm离心5min获取上清；加入100pl底物(0.1MTris-HCl缓冲液配制60mg/mlCPC溶液，pH8.0)，并用缓冲液补加至200pl，37。C反应5min后，加入600pi终止液(20%乙酸与0.05mol/LNaOH溶液2:1体积混合)。8000rpm离心3min，取500^1上清液进行HPLC分析(phenomenexC18柱，150x4.6mm;流动相15%甲醇，7.5%乙腈，1%乙酸;254nm检测吸光度)，测定CPC酰化酶的酶活。酶活单位定义为每分钟催化生成1iamol7-ACA所需的酶量。酶活测定结果表明，BL21(DE3)/pET28-CPCacy和JM105/pMKC-CPCacy对底物CPC的催化活性分别为2950U/L和3120U/L，分别是专利文献WO2005/014821Al中报道的SEQIDNO:3所示CPC酰化酶活性(1207U/L)的2.4倍和2.6倍。实施例7本发明CPCase-TUl催化CPC生成7-ACA试验对实施例4获得的诱导型转化体BL21(DE3)/pET28-CPCaseTUl进行摇瓶培养。培养条件同实施例6。收集50ml菌液，用0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)洗涤后低温超声破碎，细胞破碎后的粗酶液直接用于3%CPC钠盐到7-ACA的催化转化，28"C下摇床振荡反应lh。取样500^1，用HPLC法分析，结果(见图4)表明，本发明CPC酰化酶CPCase-TUl可以成功地将底物CPC—步转化生成7-ACA。按照实施例6所述的催化条件，同时以CPC和GL-7-ACA为底物进行催化反应，酶活分析结果表明，CPCase-TUl对CPC底物的催化活性达到3000U/L,而对GL-7-ACA底物的催化活性为625U/L，说明成功实现了底物特异性的转移。根据实施例6所述的反应体系，在100piCPC溶液和相同酶活的原CPC酰化酶与CPCase-TUl(突变CPC酰化酶)混合液中加入终浓度为1.25g/L的7-ACA，考察产物抑制情况。37。C温浴5min后加入600|il终止液(50mMNaOH与20%冰醋酸1:2混合)；离心后取500pi上清与100(xl0.5°/。(w/v)PDAB甲醇溶液混合，37。C温浴10min后测定415nm吸光度。结果表明，CPCase-TUl的保留酶活为初始的75%,比SEQIDNO:3所示的CPC酰化酶提高19%。序列表<110>清华大学<120>—种头孢菌素C酰化酶及其载体和应用<160>6<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>774<212>PRT<213>Pseudomonassp.<400>1MetThrMetAlaAlaLysThrAspArgGluAlaLeuGinAlaAlaLeu151015ProProLeuSerGlySerLeuSerlieProGlyLeuSerAlaProVal202530ArgValGinArgAspGlyTrpGlylieProHislieLysAlaSerGly354045GluAlaAspAlaTyrArgAlaLeuGlyPheValHisAlaGinAspArg505560LeuPheGinMetGluLeuThrArgArgLysAlaLeuGlyArgAlaAla65707580GluTrpLeuGlyAlaGluAlaAlaGluAlaAsplieLeuValArgArg859095LeuGlyMetGluLysValCysArgArgAspPheGluAlaLeuGlyAla100105110GluAlaLysAspMetLeuArgAlaTyrValAlaGlyValAsnAlaPhe115120125LeuAlaSerGlyAlaProLeuProlieGluTyrGlyLeuLeuGlyAla130135140GluProGluProTrpGluProTrpHisSerlieAlaValMet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uArgGinThrLeulieAla545550555560TrpAspGlyArgMetAspAlaGlySerGinAlaAlaSerAlaTyrAsn565570575AlaPheArgArgAlaLeuThrArgLeuValThrAlaArgSerGlyLeu580585590595600605ProGinGlyGinValTrpTrpAlaValProThrLeuLeuArgAsnAsp610615620AspAlaGlyMetLeuLysGlyTrpSerTrpAspGluAlaLeuSerGlu625630635640AlaLeuSerValAlaThrGinAsnLeuThrGlyArgGlyTrpGlyGlu645650655GluHisArgProArgPheThrHisProLeuSerAlaGinPheProAla660665670TrpAlaAlaLeuPheAsnProValSerArgProlieGlyGlyAspGly675680685<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>859095LeuGlyMetGluLysValCysArgArgAspPheGluAlaLeuGlyAla100105110GluAlaLysAspMetLeuArgAlaTyrAlaAlaGlyValAsnAlaPhe115120125LeuAlaSerGlyAlaProLeuProlieGluTyrSerLeuLeuGlyAla130135140GluProGluProTrpGluProTrpHisSerlieAlaValMetArgArg145150155160LeuGlyLeuLeuMetGlySerValTrpPheLysLeuTrpArgMetLeu165170175AlaLeuProValValGlyAlaAlaAsnAlaLeuLysLeuArgTyrAsp180185190AspGlyGlyGinAspLeuLeuCyslieProProGlyValGluAlaGlu195200205ArgLeuGluAlaAspLeuAlaAlaLeuArgProAlaValAspAlaLeu210215220LeuLysAlaMetGlyGlyAspAlaSerAspAlaAlaGlyGlyGlySer225230235240AsnAsnTrpAlaValAlaProGlyArgThrAlaThrGlyArgProlie245250255LeuAlaGlyAspProHisArgValPheGlulieProGlyMetTyrAla260265270GinHisHisLeuAlaCysAspArgPheAspMetlieGlyLeuThrVal275280285ProGlyValProGlyPheProHisArgAlaHisAsnGlyLysValAla2卯295300TyrCysValThrHisAlaPheMetAspThrHisAspLeuTyrLeuGlu305310315320GinPheAlaGluAspGlyArgThrAlaArgPheGlyAsnGluPheGlu325330335<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>580585590595600605ProGinGlyGinValTrpTrpAlaValProThrLeuLeuArgAsnAsp610615620AspAlaGlyMetLeuLysGlyTrpSerTrpAspGluAlaLeuSerGlu625630635640AlaLeuSerValAlaThrGinAsnLeuThrGlyArgGlyTrpGlyGlu645650655GluHisArgProArgPheThrHisProLeuSerAlaGinPheProAla660665670TrpAlaGlyLeuPheAsnProValSerArgProlieGlyGlyAspGly675680685AspThrValLeuAlaAsnGlyLeuValProSerAlaGlyProGluAla690695700ThrTyrGlyAlaLeuCysArgTyrValPheAspValGlyAsnTrpAsp705710715720AsnSerArgTrpValValPheHisGlyAlaSerGlyHisProAlaSer725730735ProHisTyrAlaAspGinAsnAlaProTrpSerAspCysAlaMetVal740745750ProMetLeuTyrSerTrpAspArglieAlaAlaGluAlaValThrSer755760765GinGluLeuValProAla770权利要求1、一种CPC酰化酶，其编码基因为下述核苷酸序列之一(a)具有SEQIDNO4所示的DNA序列；(b)与SEQIDNO4所示的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列，且编码具有CPC酰化酶活性的蛋白质；(c)在高严谨条件下可与SEQIDNO4所限定的DNA序列杂交，且编码具有CPC酰化酶活性的蛋白质的DNA序列。2、按照权利要求1所述的CPC酰化酶，其特征在于其氨基酸序列为在SEQIDNO:3所示的氨基酸序列基础上，至少下列一个位点的氨基酸被其他氨基酸所替换，所述的氨基酸为263位精氨酸、270位甲硫氨酸、295位脯氨酸、296位组氨酸、309位组氨酸、666位亮氨酸、675位丙氨酸和677位亮氨酸。3、按照权利要求2所述的CPC酰化酶，其特征在于其氨基酸序列为在SEQIDNO:3所示的氨基酸序列基础上，至少下述一个位点的氨基酸被所述的氨基酸替换270位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸；309位组氨酸替换为缬氨酸；675位丙氨酸替换为甘氨酸；677位亮氨酸替换为苯丙氨酸。4、按照权利要求2或3所述的CPC酰化酶，其特征在于所述的CPC酰化酶在SEQIDNO:3所示的氨基酸序列基础上，其第677位的亮氨酸被苯丙氨酸取代，其具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。5、按照权利要求4所述的CPC酰化酶，其特征在于所述的CPC酰化酶在SEQIDNO:3所示的氨基酸序列基础上，其第675位的丙氨酸被甘氨酸取代，其具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。6、含有权利要求1所述CPC酰化酶编码基因的重组表达载体。7、含有权利要求1所述CPC酰化酶编码基因的宿主菌。8、按照权利要求7所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌为五.co//BL21、JM109、五.co/ZTBl或￡.co//JM105等。9、权利要求1至5任一所述的CPC酰化酶在制备7-氨基头孢烷酸上的应用。10、权利要求6所述的重组表达载体在制备7-氨基头孢烷酸上的应用。全文摘要本发明公开了一种CPC酰化酶，该酶的编码基因为SEQIDNO4所示的DNA序列以及与它具有80％以上同源性的DNA序列。本发明还公开了含有编码CPC酰化酶的载体和转化体以及该酶的用途。该酶表达活性高、催化活性高、并且产物耐受性高，能够高效催化底物CPC生成产物7-ACA。文档编号C12N15/63GK101240285SQ200810102219公开日2008年8月13日申请日期2008年3月19日优先权日2008年3月19日发明者于慧敏,明安,宋文斯,沈忠耀,晖罗申请人:清华大学