专利名称：一种博宁霉素的生物合成制备方法
技术领域：
本发明涉及一种博宁霉素(Z-893 )的制备方法，属于抗生素微 生物发酵培养领域。
背景技术：
博莱霉素族抗生素的分子结构
博莱霉素A2 R= -NH(CH2)S(CH3)
NH II
博莱霉素B2 R=-NH-(CH 2)4-NH-C-NH 2
博莱霉素A5 R= -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2 博莱霉素A6 R= -NH-(CH2)rNH-(CH2)4-NH-(CH2)rNH2 博宁霉素 R=-NH-(CH2)rNH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NHCOCH3 其中，博宁霉素(Boningmycin)是由轮技链霉菌平阳变种产生 的，属于博莱霉素族的化合物(专利号为98101253.1，发明名称为一 种抗肿瘤抗生素和其微生物发酵生产法)。博宁霉素不但具有抗肿瘤 作用，而且对银屑病、脂溢性皮炎和乳头瘤病毒所致的疾病如尖锐湿疣、扁平疣等有良好的作用，毒性低，外用无刺激性，具有良好的应 用前景。但其通过发酵培养所产生的活性产物中博宁霉素仅占约5% 以下，甚至只有痕迹量。
因此，为了适应工业化生产，并能有效降低成本，本发明的技术 人员通过继续研究，发现了一种高产率的博宁霉素生产方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种博宁霉素(Z-893 )的生物合成制备方 法，采用该方法发酵产生的活性产物中的博宁霉素含量高，活性产物 中博宁霉素的含量比例达到50~85%，具有良好的工业化生产前景。
为了实现本发明目的，本发明所述的博宁霉素(Z-893 )的生物 方法，该方法包括如下步骤
向轮技链霉菌(Streptomyces verticillus )或轮技链霉菌平阳变种 (Streptomyces verticillus Var. Pingyangensis n. var)的发酵培养基中添 加博宁霉素的末端胺体单乙酰精胺，然后发酵培养，并从培养液中回 收博宁霉素。
本发明所述的博宁霉素(Z-893 )的生物合成方法，其包括如下
1) 将产生博宁霉素的轮技链霉菌(Streptomyces verticillus )或轮 枝《连霉菌平阳变种菌种(Streptomyces verticillus Var. Pingyangensis n. var)进行发酵培养得培养液，1升发酵培养基中含有0.3 ~ 0.6克的单 乙酰精胺；
2) 对培养液进行提取、分离、精制而得博宁霉素。
其中，本发明采用了经过选育优化的轮技链霉菌或轮枝链霉菌平 阳变种，其为已知菌种，有关其形态特征、培养特征、生理特征、碳 源利用和抗菌谱等已有文献记载(微生物学报V19(4)，361-364.1979 )。 优选为轮枝链霉菌平阳变种Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 )或轮枝链霉菌6970 ( Streptomyces verticillus 6970)。当然，所有能够产生博宁霉素的菌种也都应属于本发明之列。本发明采用的用于培养微生物的培养基中应加入可被其利用的 碳源、氮源、无机盐、有机盐和能被其利用的痕迹量营养物，这些成 份可预先一次性地加入培养基中或者间歇或连续地加入培养基中，实 现博宁霉素的高产率。
在发酵培养基中需要加入博宁霉素的末端胺体单乙酰精胺，其加
入量为0.03%~0.06%，所加末端胺体可以是单体游离碱，也可以是 它的各种无机酸盐，如盐酸盐或硫酸盐等；还可以是能与之成盐的有 机酸盐。可以是有机合成品，也可以是天然来源的提取品或粗提品； 其加入培养基的方式可以是预先一次性地加入，也可以釆用间歇地或 连续地加入。
具体地说，本发明发酵培养基的组成为葡萄糖0.2~0.8%，淀 粉0.5 ~ 5.0%,豆饼粉0.5 ~ 6.0%,玉米粉0.5 ~ 5.0%,玉米浆0.1 ~ 2.0%,氯化钠0.1 ~ 0.5%，磷酸二氢钾0.005 ~ 0.03%,硫酸锌0.02 ~ 0.07%,硫酸铜0.001 ~ 0.020%，玉米油0.1-0.5%，单乙酰精胺 0.03% ~ 0.06%,其余为水，pH6.0~6.5。
培养方式可采用振荡培养、搅拌培养或其它方式，但对大量生产 来说，优选的方式为浸没搅拌培养，培养条件(时间、湿度、pH等) 随菌种不同而变化，也随培养基成分的变化有所不同，本领域技术人 员能够根据具体情况进行选择，当发酵液的生物活性达到峰值时终止 培养，根据其性质进行分离纯化，所得活性复合物中博宁霉素的含量 比可以达到50~85%，经分离、纯化得到的含铜博宁霉素，通过紫外 光谱、质谱分析表明所得化合物确为博宁霉素。
具体地说，本发明所述的发酵培养过程为将产生博宁霉素的轮 技链霉菌平阳变种菌种或轮枝链霉菌接种于斜面培养基上进行培养， 在28。C培养8天；然后将菌种斜面接种于种子培养基中，在28'C旋 转培养48小时后，再用于发酵，29。C培养7 8天后收获培养液。
本发明所用的斜面培养基组成为葡萄糖1.0%，蛋白胨0.5%， 淀粉1.0%,氯化钠0.5%，琼脂2,0%,其余为水，调pH7.2 7.5。
所述的种子培养基的组成为葡萄糖0.5%，淀粉2.5%,豆饼粉3.2%，玉米粉2.0%,玉米浆0.5%，氯化钠0.3%,磷酸二氢钾0.015%, 硫酸锌0.05%,硫酸铜0.01%,玉米油0.3%,自然pH。
本发明所述的发酵培养基与种子培养基的成分基本相同，所不同 的是另加了博宁霉素的末端胺体单乙酰精胺。
所用培养基都需要进行灭菌， 一般于120 'C灭菌30分钟即可。 本发明所述培养液的提取、分离、精制过程为发酵培养液用草 酸调pH2.0-3.0， NaOH调pH5.0-6.5,离心上清液并过滤，滤液通 过离子交换树脂柱，无盐水洗后，以0.1 0.5NHC1洗脱，收集活性 洗脱液，调pH4.5-6.5,再经大孔吸附树脂柱脱盐，以5~30%的丙 酮(含0.01N HC1)溶夜洗脱，收集含铜复合物，进行 CM-Sephadex-C-25 (NH4+)柱层析，并以0.1 ~ 1NNH4C1梯度洗脱， 按峰位收集含铜活性色带，大孔吸附树脂柱脱盐后，经脱铜处理得博 宁霉素。
本发明所述的博宁霉素的制备方法，以轮枝链霉菌为产生菌，通 过向发酵培养基中加入博宁霉素的末端胺体单乙酰精胺，使发酵产生 的有效复合物中博宁霉素的含量比大幅度提高至50~85%。
图l为本发明所述发酵培养液提取、分离、精制流程图。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例l
本实施例所用的产生博宁霉素的菌种为轮枝链霉菌平阳变种 Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 )，其斜面培 养基组成为葡萄糖1.0%,蛋白胨0.5%，淀粉1.0%,氯化钠0.5% 和琼脂2.0%,其余为水。调pH7.2，于120 。C灭菌30分钟，将菌种 接种于此斜面培养基上，在28。C培养8天，将生长良好的菌种斜面 接种于经过120 t:灭菌30分钟的种子培养基中，种子培养基的组成 为葡萄糖0.5%，淀粉2.5%,豆饼粉3.2%,玉米粉2.0%，玉米浆0.5%，氯化钠0.3%，磷酸二氢钾0.015%，硫酸锌0.05%,硫酸铜0.01%, 玉米油0.3%,其余为水，自然pH，接种后在28匸旋转培养48小时 后，做为种子，用于发酵。发酵培养基与种子培养基相同，另加单乙 酰精胺盐酸盐0.05%，调pH6.0后，同样于120 。C灭菌30分钟，将 培养好的种子转种于此发酵培养基中，29 'C培养8天后收获培养液。
采用本实施例的高产率发酵法所得主要组份博宁霉素的产率，在 复合物中所占比例可达85%。
如图l所示，将100升培养液用草酸调pH至3.0，再用氢氧化钠 调pH至6.5过滤，滤液通过离子交换树脂D151(lT型)，无盐水洗后， 以0.3N盐酸洗脱，收集活性部分调pH至6.5,再经大孔吸附树脂4006 脱盐，以10%丙酮(含0.01N盐酸)洗脱，收集活性部分，减压浓缩 至小体积，浓缩液用氨水调pH至6.5，进行CM-Sephadex-C-25(NH4+ 型)柱层析，无盐水洗柱后，以0.1 1.0N氯化铵梯度洗脱，按峰位 收集，合并，所得博宁霉素部分经大孔吸附树脂脱盐后，冷冻干燥， 可得到12.75克蓝色的博宁霉素含铜品。用含5% NaCl和5% EDTA 二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜。
经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定， 分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。 对比例1
在相同条件下，采用轮枝链霉菌平阳变种，发酵培养基中不加单 乙酰精胺。博宁霉素的产率比在5%以下。 实施例2
本实施例所用的产生博宁霉素的菌种为轮枝链霉菌6970 (Streptomyces verticillus 6970 ),其斜面培养基组成为葡萄糖2.0%, 淀粉1.5%,氯化钠0.3%和琼脂1.5%,其余为水。调pH7.4，于120 °C 灭菌30分钟，将菌种接种于此斜面培养基上，在30。C培养6天，将 生长良好的菌种斜面接种于经过12(TC灭菌30分钟的种子培养基中， 种子培养基的组成为葡萄糖0.2%，淀粉3.5%，豆饼粉4.5%,玉米 粉0.5%,玉米浆0.7%,氯化钠0,1%,磷酸二氢钾0.02%,硫酸锌0.01%,硫酸铜0.001%,玉米油0.5%,其余为水，自然pH，接种后在26。C 旋转培养60小时后，做为种子，用于发酵。发酵培养基与种子培养 基相同，组成为葡萄糖0.2%,淀粉5.0%,豆饼粉0.5%，玉米粉 5线玉米浆2.0%,氯化钠0.1%,磷酸二氢钾0.03%,硫酸锌0.01%, 硫酸铜0.02%，玉米油0.1%，单乙酰精胺盐酸盐0.06%,其余为水， 调pH6,2后，同样于120 t:灭菌30分钟，将培养好的种子转种于此 发酵培养基中，3厂C培养6天后收获培养液。
釆用本实施例的高产率发酵法所得主要组份博宁霉素的产率，在 复合物中所占比例可达70%。
将100升培养液用草酸调pH至2.0，再用氢氧化钠调pH至6.0 过滤，滤液通过离子交换树脂D151(fT型)，无盐水洗后，以0.5NHC1 洗脱，收集活性部分调pH至6.2，再经大孔吸附树脂4006脱盐，以 30%丙酮(含0.01NHC1)洗脱，收集活性部分，减压浓缩至小体积， 浓缩液用氨水调pH至6.5,进行CM-Sephadex-C-25 ( NH/型)柱层 析，无盐水洗柱后，以0.1 1.0N氯化铵梯度洗脱，按峰位收集，合 并，所得博宁霉素部分经大孔吸附树脂4006脱盐后，冷冻干燥，可 得到10.5克蓝色的博宁霉素含铜品。用含5% NaCl和5% EDTA 二钠 盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜。
经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定， 分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。 对比例1
在相同条件下，采用轮枝链霉菌6970，发酵培养基中不加单乙酰 精胺，博宁霉素根本不产出。 实施例3
本实施例所用的产生博宁霉素的菌种为轮技链霉菌平阳变种 Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 )，其斜面培 养基组成为葡萄糖0.5%,蛋白胨1.0%,淀粉0.3%,氯化钠0.7% 和琼脂2.5%，其余为水。调pH7.5，于120 'C灭菌30分钟，将菌种 接种于此斜面培养基上，在26匸培养9天，将生长良好的菌种斜面接种于经过120 。C灭菌30分钟的种子培养基中，种子培养基的组成 为葡萄糖0.8%，淀粉1.5%，豆饼粉1.5%，玉米粉3.0%,玉米浆 0.1%,氯化钠0.5%,磷酸二氢钾0.01%,硫酸锌0.01%，硫酸铜0.02%, 玉米油0.1%,其余为水，自然pH，接种后在3(TC旋转培养30小时
后，做为种子，用于发酵。发酵培养基与种子培养基相同，组成为 葡萄糖0.8%,淀粉0.5%,豆饼粉6.0%，玉米粉0.5%,玉米浆0.1%， 氯化钠0.5%,磷酸二氢钾0.01%，硫酸锌0.08%，硫酸铜0.001%, 玉米油0.5%，单乙酰精胺盐酸盐0.03%，其余为水，调pH6.5后，同 样于120 "C灭菌30分钟，将培养好的种子转种于此发酵培养基中， 27X:培养9天后收获培养液。
釆用本实施例的高产率发酵法所得主要组份博宁霉素的产率，在 复合物中所占比例可达50%。
将100升培养液用草酸调pH至3.0,再用氢氧化钠调pH至5.0 过滤，滤液通过离子交换树脂D151(lT型)，无盐水洗后，以0.1N盐 酸洗脱，收集活性部分调pH至6.5,再经大孔吸附树脂4006脱盐， 以5%丙酮(含0.01N HC1)洗脱，收集活性部分，减压浓缩至小体 积，浓缩液用氨水调pH至6.5,进行CM-Sephadex-C隱25 (NH/型) 柱层析，无盐水洗柱后，以0.1 1.0N氯化铵梯度洗脱，按峰位收集， 合并，所得博宁霉素部分经大孔吸附树脂脱盐后，冷冻干燥，可得到 7.5克蓝色的博宁霉素含铜品。用含5% NaCl和5% EDTA 二钠盐的 水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜。
经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定， 分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1、一种博宁霉素的生物合成制备方法，该方法包括如下步骤先将产生博宁霉素的轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)或轮枝链霉菌平阳变种菌种(Streptomyces verticillus Var.Pingyangensis n.var)进行发酵培养得培养液；然后对培养液进行提取、分离、精制；其特征在于，发酵过程中1升发酵培养基中加入0.3～0.6克的单乙酰精胺。
2、 根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于，所述的菌种为轮枝链霉菌平阳变种Q835( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n,spQ835 )及其变株。
3、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的单乙 酰精胺为单体游离碱、单乙酰精胺盐酸盐、单乙酰精胺硫酸盐、单乙 酰精胺其它无机酸盐或能与之成盐的有机酸盐中的一种。
4、 根据权利要求1 3任意一项所述的制备方法，其特征在于， 所述发酵培养为将产生博宁霉素的轮枝链霉菌或轮枝链霉菌平阳变 种菌种接种于斜面培养基上进行培养，在26-30 。C培养6-9天；然 后将菌种斜面接种于种子培养基中，在26 ~ 30 "C旋转培养36 ~ 60小 时后，再27~31 。C发酵培养6 9天后收获培养液。
5、 根据权利要求1~4任意一项所述的博宁霉素的制备方法，其 特征在于，所述培养液的提取、分离、精制过程为发酵培养液用草 酸调pH2.0 3.0, NaOH调pH5.0~6.5，离心上清液并过滤，滤液通 过离子交换树脂柱，无盐水洗后，以0.1 0.5NHC1洗脱，收集活性 洗脱液调pH4.5 ~ 6.5,再经大孔吸附树脂柱脱盐，以5 ~ 30%的丙酮(含 0.01NHC1)溶夜洗脱，收集含铜复合物，进行离子交换凝胶柱层析， 并以0.1 1NNH4C1梯度洗脱，按峰位收集含铜活性色带，大孔吸附 树脂柱脱盐后，经脱铜处理得博宁霉素。
全文摘要
本发明提供一种博宁霉素(Z-893)的生物合成制备方法，该方法采用向博宁霉素的产生菌轮枝链霉菌或轮枝链霉菌平阳变种的发酵培养基中添加末端胺体单乙酰精胺，然后发酵培养，并从培养液中回收博宁霉素。该方法使发酵产生的有效复合物中博宁霉素的含量比大幅度提高至50～85％。
文档编号C12R1/625GK101608199SQ20081011536
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者瑞 张, 石莲英, 许鸿章, 陈汝贤, 敏 鲁 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所