专利名称：一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的特异性引物。
技术背景美丽盾巨孢囊霉(5"c^e〃as尸ora ca/os; ora)是一种丛枝菌根(arbuscular mycohizal, AM)真菌，因为菌根包括内生、外生、内外生菌根等，外生真菌 是可培养的，而AM真菌为内生菌根真菌的一种，它才是不可培养的。如果 缺乏必需的植物根系共生则无法完成生活史，不能继续繁殖、存活，即不能纯 培养。AM真菌不能纯培养，虽然可以利用湿筛倾析法从植物根际土壤中获得 AM真菌单个孢子，然后对单个AM真菌孢子进行DNA提取，使用真核生物 通用引物即可将其扩增出来、测序等技术就可以知道其序列，但是如果在多种 菌共同存在的混合DNA样品中，尚无法用现有的引物对从混合DNA样品中 直接扩增出具有美丽盾巨孢囊霉(5^fe//cwjrora ca/os/ ora)遗传特性的25S rDNADl/D2可变区域部分序列，给AM真菌侵染根系的检测带来了困难。发明内容本发明是为了解决现有的引物无法从混合DNA样品中直接扩增出具有美 丽盾巨孢囊霉(Sc"fe〃os; ora ca/ospora)遗传特性的25S rDNADl/D2可变区 域部分序列的问题，而提供一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物。本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物为 5'-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3'。将本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物命名为S.cal。本发明的引物是根据不同的AM真菌DNA的Dl区序列大小基本相同， 而D2区有一个大约50bp的插入序列，不同的AM真菌该插入序列碱基差异 大的特点而设计的。将本发明的引物S.cal (作为反向引物)与通用引物对中 的LR1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3')配对使用，即可从混合DNA 样品中直接扩增出长度为718bp的美丽盾巨孢囊霉(fewfe/Zospomca/c^^ra) 目的片段。
图1为用具体实施方式
二的引物对不同的DNA样品扩增出的序列的凝胶 电泳图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物为 5 '-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3 '。
具体实施方式
二本实施方式用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物 5 '-TTAAAGCC ATTACGTC AGCG-3 '作为反向引物。将正向引物LR1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3')与本实施方式的 反向引物配对使用。分别以含有5bw&〃o^ora m/as; ora DNA的混合样品、 iScwfe〃ay/ ora ca/aspora DNA样品禾口不含5bw/e〃as/ ora ca/as/ ora DNA的混合 样品为模板进行引物S.cal的特异性验证试验。PCR扩增体系及反应条件如下扩增反应体系为20nL由2.0^L DNA模板，1.6|aL浓度为2.5mmol/L的 dNTP, 2.0)iL 10x缓冲液(不含Mg2+)， 2.0^L浓度为25mmol/L的MgCl2， 2,0pL 浓度为10pmol/L的引物，0.2pL浓度为5U/pL的Taq酶(DNA聚合酶)和余 量的重蒸馏水组成；扩增反应条件:预变性95'C 3min，变性93。C lmin，退 火58。C lmin，延伸72°C lmin，共30个循环，延伸72°C 5min。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1 所示，图1中M泳道为标准条带，l号和2号泳道中的条带为含有&"&//0^^" c^/cwjwra DNA的混合样品扩增结果，3号和4号泳道中的条带为 w/o^ora DNA样品扩增结果，5号和6号泳道中的条带为不含Sc^/fo^ora ca/o^oraDNA的混合样品扩增结果。从图1中可以看出本实施方式用于扩增 美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物能够准确扩增出美丽盾巨孢囊霉 (5^te〃os; oraca/o5:;7ora)的25S rDNADl/D2可变区域部分序列片段。将1、 2、 3、 4号泳道对应的序列片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5a感受 态细胞测序，测序结果为序列长度为718bp，并且经blast分析，为美丽盾 巨孢囊霉(ScM.ca/os/ ora)特异性序列。〈110〉黑龙江大学<120〉 一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物〈160〉 2〈210〉 1 〈211〉 20 〈212〉 DNA <213>人工序列〈220〉<223〉本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物。 <400> 1ttaaagccat tacgtcagcg 20<210> 2〈211〉 20<212〉 DNA <213>人工序列<220>〈223〉与本发明的引物配对使用的LR1引物。 <400〉 1gcatstcaat朋gcgg3ggei 20
权利要求
1、一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物，其特征在于用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物为5′-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3′。
2、 根据权利要求1所述的一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物， 其特征在于用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物作为反向引物。
全文摘要
一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物，它涉及一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的特异性引物。本发明解决了现有的引物无法从混合DNA样品中直接扩增出具有美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)遗传特性的25SrDNA D1/D2可变区域部分序列的问题。本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物为5′-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3′。本发明的引物与通用配对引物中的LR1引物配对使用能够准确扩增出美丽盾巨孢囊霉目的片段。
文档编号C12Q1/68GK101333567SQ20081013684
公开日2008年12月31日 申请日期2008年7月30日 优先权日2008年7月30日
发明者接伟光, 雪 王, 葛菁萍, 蔡柏岩, 阎秀峰 申请人:黑龙江大学