专利名称：：用于诊断或筛选节肢介体病毒感染的方法、在所述方法和它们的应用中使用的试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种用于诊断或筛选节肢介体病毒(arbovirus)感染、优选黄病毒科(flaviviridae)感染、更优选黄病毒(flavivirus)感染的方法，在所述方法和它们的应用中使用的试剂。
背景技术：
：节肢介体病毒(节肢动物传播的病毒)是在自然界循环中在吸血的节肢动物载体和易染病的脊椎动物寄主上保持的病毒。本发明包括了所有含有包膜蛋白的节肢介体病毒，虽然说明书主要集中在黄病毒种类。许多节肢介体病毒并且特别是许多黄病毒会引起人类或动物的严重的疾病，尤其是黄热病病毒(YFV)、登革热病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)等等。目前通过一些方法可以检测黄病毒的感染，包括病毒分离、用RT-PCR检测病毒RNA、以及靶向病毒蛋白或抗病毒免疫球蛋白分子的免疫化学试验。许多黄病毒在初次感染或继发性感染期间，病毒RNA、病毒蛋白、病毒粒子以及不同种类的抗体(IgM、IgA和IgG)的出现和消失的动力学被很好地记录下来。检测对抗病毒并存在于病人血清中的抗体，是通过免疫吸附试验建立了一个制定完善的和值得推荐的方法，用于黄病毒感染诊断(K皿o，2003;WH0，1997)。这些诊断的目的至少是双重的用实例确认区分黄病毒的疾病与其他有相似临床病状的疾病；和传播的监控。由于一些因素，使得感染黄病毒的诊断变得复杂。目前大多数用来测试抗一种黄病毒的抗体的血清学试验，会与这个家族的其他成员发生交叉反应(Kuno，2003)。这些交叉反应在一些黄病毒共传播的区域可能是有问题的。例如，许多抗WNY的抗体，会与JEV(日本脑炎病毒)、SLEV(圣路易斯脑炎病毒)甚至和DENV发生交叉反应(Granwehretal.，2004)。许多抗DENV的抗体，与YFV和JEV交叉反应(VorndamandKuno，1997)。DENV的四个血清型存在着一个特殊的问题。严重形式的登革热、登革出血热(DHF)和休克综合症(DSS)的发病机制，一直是争论的话题。有两个主要的理论被提出来。一般接受的假设是继发性感染或免疫增强理论(Halstead，2003;Mongkols即ayaetal.，2003)。另一个假设强调了病毒因子的参与(McBrSEQIDeandBielefeldt-Ohmann，2000)。因此初次和继发性感染的区别是理解DHF发病机制的关键。在初次感染和继发感染中都存在着病毒mRNA和抗原(Alconetal.，2002)。因此，DENV抗体的检测为区别感染的不同模式提供了唯一的方法。目前诊断试验使用酶联免疫吸附试验ELISA或快速试纸法(dipstickformat)来识别黄病毒感染。用于检测病人血清中的病毒抗体的免疫吸附试验(ISA)属于两种主要类型间接ISA和抗体特异性捕获ISA。在间接ISA中，用病毒抗原(virAg)敏化固相载体。在分析中被固定的抗原与人类或动物血清相互反应。最终，被结合的抗体由报告系统所显示，此报告系统通常是由免疫球蛋白结合蛋白(@Ig)和酶(Enz)之间的聚集体组成，典型的酶是辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(PhoA)。这就是酶联免疫吸附试验(ELISA)。也可以使用其他种类的探针，比如荧光团或胶态金。间接ISA的一般图示如下支持物-病毒抗原血清@Ig_报告分子(1)其中"-"代表共价键或固定化；并且""代表非共价键相互作用。Ig结合蛋白可能对特定种类Ig具有特异性(OIgX，其中X=M，A或G)。在这种情况下，可以称作IgX特异性间接ISA。已经描述过间接ISA的一些变体，尤其是抗原捕获ISA、表位阻断ISA以及亲合ISA(Blitvichetal.，2003;Johnsonetal.，2000;Matheusetal.，2005)。在IgM、IgA或IgG特异件捕获ISA中，用Ig结合蛋白(@IgX，X=M、A或G)敏化固相载体，该Ig结合蛋白可抗所研究的动物种类中的特定种类的Ig分子，并且大多数通常由异源抗体组成。被固定的Ig结合蛋白连续地与所分析的血清、病毒抗原和接着的报告系统反应，此报告系统一般是抗原结合分子(@virAg)和酶(Enz)的结合物。一般的IgX特异性捕获ISA(XAC-ISA)可以图示如下支持物-0IgX::血清病毒抗原@VirAg_报告分子(2)视Ig结合蛋白(@IgX)而定，可以称作IgM、IgG或IgA抗体捕获免疫吸附试验(MAC-ELISA、GAC-ELISA或AAC-ELISA)。用于IgM抗体的免疫吸附试验属于确定近期被黄病毒感染的最有用的血清学方案，因为这些IgM分子在感染初期出现，在疾病过程中快速增加，并且与IgG抗体相比与其他病毒的交叉反应较少(Kuno，2003)。最早在感染后第5天就可以检测IgM分子，但是通常它们与单体抗原的亲合力比其他类型的免疫球蛋白低。MAC-ELISA优于IgM特异性间接ELISA，因为来自于以前被相关病毒感染的IgG抗体对后者的试验的灵敏度有抑制作用(VorndamandKuno，1997)。WHO推荐它用于一些黄病毒感染、并且尤其是登革热的血清学诊断(WHO,1997)。MAC-ELISA有下列优点如果得到配对的血清样本，IgM上升的、稳定的或下降的滴度能显示出感染的时间。对单个样本的MAC-和GAC-ELISA平行试验中的IgM与IgG抗体的比值能用来区分初次感染和继发性感染，因为IgM/IgG的比值在前面的情况下是高于一，在后面的情况下是低于一(I皿isetal.，1989)。它可以检测脑脊髓液和唾液中的抗黄病毒的IgM(Kaoetal.，2005;Telesetal.，2005)。人们已经开发了IgA特异性的ELISA。IgA应答发展在IgM应答之后、但在IgG应答之前。平行MAC-ELISA和AAC-ELISA试验中的IgA/IgM比值能显示出DENV和WNV的感染是近期的、还是几个月之前的(PrinceandL即e-Nixon，20055Talarminetal.，1998)。免疫吸附试验的特异性主要来自于分析中的血清与抗原的相互作用，因此取决于抗原制品的内在性质。但是，它也可能来自于报告分子的内在性质。直到最近以来，用于ISA的抗原主要是被研究中的病毒感染的乳鼠大脑(SMB)或细胞培养物的提取物。这些抗原日益增多地被重组的prM/gpE病毒样颗粒(VLP)取代，其中prM和gpE是病毒的膜蛋白与包膜蛋白的前体，或具有gpE的重组胞外结构域(sE)。非结构性蛋白NS1也已经被用作IgG特异性间接ELISA和MAC-ELISA的抗原。NS1可以区分6初次感染和继发性感染，并且能正确识别初次感染的病人的血清中的感染性DENV的血清型(Shuetal.，2004;Shuetal.，2003;Shuetal.，2002)。许多MAC-ELISA使用抗病毒的多克隆抗体作为检测分子。这些多克隆抗体的批次之间在效力上是不同的，并且是病毒交叉反应性的，这将限制试验的特异性(Martinetal.，2000)。因此，单克隆抗体(mAb)比多克隆抗体(pAb)有更多优势，并且减少了特异性上的变化。广泛交叉反应性的mAb，例如mAb4G2和mAb6C_l，已被与酶结合并被广泛用作检测分子(Kuno，2003)。在位点S169P和G257R上的中和逃逸突变株已经在gpE的结构域1和2之间的界面上绘制了mAb4G2的表位(SerafinandAaskov，2001)。存在着其他种类的ISA，例如夹心ELISA(R.J.Kerschbaumeretal.，1996)，它的形式如下支持物HgGST::GST-(3D6表位)；scFv3D6-PhoA，其中的@GST代表抗谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的抗体；GST-(3D6表位)是GST和抗体3D6的表位的杂合蛋白；以及scFv3D6-PhoA是抗体3D6单链可变片段(scFv)和碱性磷酸酶的杂合蛋白。夹心ELISA试验被用于检测病人血清中抗原的存在，而不是如同本发明中的检测抗感染物的抗体的存在。此外，这种方法需要分离和表征至少两个待在试验中使用的非竞争性的抗体。另外一种ISA是反向ELISA(D.Ludolfsetal.，2007)，它的形式如下支持物-RF::血清rED3_HRP其中Rhumatoid因子(RF)是可识别IgG免疫球蛋白的Fc片段的自身免疫性抗体；以及rED3-HRP是辣根过氧化物酶(HRP)与西尼罗河病毒包膜蛋白重组结构域3(rED3)的化学结合物。辣根过氧化物酶HRP是单体蛋白，而碱性磷酸酶是二聚体，以及rED3-HRP杂合蛋白是通过rED3和HRP两个配对物化学耦合得到的。这项研究的作者清楚地提到，他们的"反向ELISA"不检测任何特异性的IgM抗体(472页，左列，31行以及以下)。他们得出结论，他们的反向ELISA能提高世界上对于西尼罗河病毒感染流行的认识。因此这个方法学最适合用在病毒感染流行的长期流行病学研究中。另外一种ISA是间接IgGELISA(D.W.C.Beasleyetal.，2004)，它的形式如下支持物-rED3::血清@IgG_HRP其中的@IgG-HRP是辣根过氧化物酶和抗人类IgG抗体的化学结合物。作者清楚地提到，重组结构域rED3被覆盖在微量滴定板的孔上的抗体微弱结合(2764页，34-39行)，因此不适合用于抗体捕获ELISA。抗原在捕获ELISA中的使用*由乳鼠大脑(SMB)或细朐j咅养物衍牛而来的病毒抗原当使用由SMB或细胞培养物衍生而来的病毒抗原时，GAC-或MAC-ELISA的特异性相差不多(Cardosaetal.，1992)。使用这些抗原制品进行的MAC-ELISA对于病毒的血清复合物一般是特异性的，但是很难区分血清复合物中的感染病毒。例如，它们能区分DENV与JEV或WNV的感染(Innisetal.，1989;Martinetal.，2002)。但是，它们很难区分4种DENV血清型的感染，即使在大多数的例子中感染血清型的信号是最强的(Nawaetal.，2000)。如果同时检测JEV血清复合物的这些黄病毒并使用精确的特定的诊断算法(Martinetal.，2002;2004)，它们能区分WNV感染与SLEV或JEV感染。但是，这种特异性的诊断只对初次感染是可能的，因为在正经历继发性感染和进一步的感染的病人中交叉反应性非常重要(Kaoetal.，2005;Telesetal.，2005)。*将重组体DrM/gpE-VLP和sE用作抗原根据检测灵敏度、特异性、精确度和其他统计测试的许多标准，在MAC-ELISA中使用来自于一些黄病毒的prM/gpE-VLP，与SMB衍生的抗原相比，会进行地一样好或更好(Holmesetal.，2005;Martinetal.，2002;Martinetal.，2000;Muerhoffetal.，2002)。对于DENV，VLP可以成功地检测初次感染的感染血清型(Shuetal.，2002;ShuandHuang，2004)。对于SLEV，VLP不与抗WNV和波瓦生病毒的IgM抗体交叉反应，这与由SMB衍生的抗原正相反(Purdyetal.，2004)。对于TBEV(Tick-BorneEnc印halitisVirus,蜱传播的脑炎病毒)，VLP不与抗JEV的IgM抗体交叉反应，与市场上的抗原正相反(Yoshiietal.，2003)。但是对于WNV，VLP与高比例的被其他黄病毒(JEV、SLEV、DENV、YFV)感染或接种的病人的血清发生交叉反应(Hogrefeetal.，2004)。在果蝇细胞中作为重组蛋白被表达的gpE的胞外结构域sE，被用于MAC-和GAC-ELISA的色谱分析中。这种免疫色谱测试，使用来自于DENV的4种血清型的重组sE结构域，其特异性和灵敏度可以与用SMB提取物作为抗原进行的传统的MAC-和GAC-ELISA相媲美(Cuzzubboetal.，2001)。*rED3作为抗原—些因素与ED3结构域作为免疫试验中的抗原是相关的它是高抗原性的和免疫原性的；最强的中和抗体是抗这个结构域的(CrillandRoehrig，2001;Sanchezetal.，2005);ED3结构域的序列比gpE的其他结构域的序列远得多(Gritsunetal.，1995);与不同的黄病毒交叉反应的对抗gpE的EDI和ED2结构域的抗体比对抗ED3结构域的抗体要多(CrillandChang，2004;Kanaietal.，2006;Modisetal.，2005;Roehrig，2003;Sanchezetal.，2005)。对于DENV，大肠杆菌的TrpE蛋白与四种ED3结构域的血清型形成的杂合蛋白TrpE-ED3，与细胞培养衍生的病毒抗原进行了比较。这两种抗原在检测恢复期血清中的抗DENV的IgM或IgG抗体上是一样灵敏的。但是，在区分DENV感染和YFV或JEV接种上，TrpE-ED3抗原比细胞培养物衍生的抗原有更高的特异性(Simmonsetal.，1998)。对于DENV，重组分离的ED3结构域(rED3)可以用免疫印迹条带试验来成功地检测感染血清型(Ludolfsetal.，2002)。对于WNV，在猴子、人类和马的血清试验中，rED3在IgG特异性的间接ELISA中比SMB衍生的抗原有更灵敏和更特异性的应答。它可以清楚地区分抗WNV和抗其他相关黄病毒的IgG应答(JEV、SLEV、MVEV)(Beasleyetal.，2004)。对于TBEV，rED3在IgG特异性的间接ELISA中比SMB衍生的抗原也有更灵敏和更特异性的应答。它可以区分蜱传播的(TBEV)和蚊传播的(YFV、DENV)黄病毒，但是不能区分黄病毒TBEV血清复合物的成员(Holbrooketal.，2004)。但是，分离的ED3结构域只能用于IgG或IgM特异性间接ISA的理由在下文中解释。当使用具有重组抗原的捕获ELISA时，将出现效价和折叠的问题以及检测的问题。-效价和折叠实际上，初步实验已经表明，来自于WNV的rED3结构域被覆盖在微量滴定板孔上的抗体微弱地结合，或者由于空间位阻的原因只是被捕获而并没有被检测的抗体结合。因此可以得出结论，rED3可能并不直接适用于捕获型试验(Beasleyetal.，2004)。但是，其他的解释也同样很有道理。黄病毒在它们的表面展示了180个单体(90个二聚体)的gpE，因此gpE和它的ED3结构域是以多个和相连的拷贝存在的(Kuhnetal.，2002;Mukhopadhyayetal.，2003)。相同分子的IgG、IgA或IgM能同时结合二至五个它的表位拷贝，并且这种结合的多效价模式导致了明显很强的亲合力(抗体亲抗原性)。抗原的效价在prM/gpEVLP中也是很高的(Ferlenghietal.，2001);其对于重组的抗原，象二聚体形式的水溶性gpE(sE)，效价是二(Kanaietal.，2006;Modisetal.，2003;Modisetal.，2005;Reyetal.，1995)，但是对于分离的ED3结构域只是一。因此，单体rED3结构域和IgM的一个结合位点之间的亲合力对于MAC-ELISA是不够的。对于IgG或IgA捕获ELISA，也能碰到类似的问题，尤其是初次感染。为了克服单体rED3结构域的这种局限，工程化它们的寡聚化是必要的。ED3结构域含有两个半胱氨酸残基。它们形成二硫键，此二硫键对于结构域正确折叠和结构域的抗原完整性是必要的(Roehrigetal.，2004)。rED3可以以正确折叠的状态在埃希氏菌属大肠杆菌的周质间隙中生成，在其中可以形成必不可少的二硫键。在周质间隙中的产生有个附加的优势，就是蛋白能通过简单的渗透休克而以浓縮的并且部分纯化的形式被提取出来。_检领[J为了定量比较针对一些不同抗原的血清的应答(例如针对不同的病毒血清型)从而推导出它的特异性，测试的检测系统对于所有测试的抗原必须是一样的。当使用多克隆抗体时情况就可能不是这样了。抗不同病毒或病毒血清型的普通表位的单克隆抗体的使用可能会引起下面的问题(i)抗原与人类血清的结合可能掩盖住示踪物单克隆抗体的表位。(ii)示踪抗体和不同的抗原之间的亲合力可以取决于表位的具体结构。结果，测试的输出信号与捕获的抗原量之间的关系可能因不同的抗原而变化。因此，需要比现有技术的试剂更好地适合ELISA试验、并且更优选适合XAC-ELISA试验的试剂。
发明内容因此，本发明涉及一种用于诊断或筛选在受试者或动物寄主中节肢介体病毒的方法，其特征在于，其包括(i)将来源于受试者或动物的样品与被Ig结合蛋白敏化的固相载体相接触，此Ig结合蛋白抗所研究的受试者或动物种类的特定种类的Ig分子，并且通常由异源抗体(抗IgX抗体)组成；以及(ii)将(i)中形成的免疫复合物与由杂合蛋白组成的检测分子一起温育，此杂合蛋白至少包含节肢介体病毒的ED3结构域、优选包含黄病毒的ED3结构域和碱性磷酸酶(PhoA)，检测出所述免疫复合物就是存在所述样品中节肢介体病毒的标记。根据进行所述方法的一个优选的实施方式，Ig结合蛋白选自由抗IgM、抗IgG和抗IgA所组成的组(@IgX，X=M、A或G)。根据进行所述方法的另一个优选的实施方式，所述节肢介体病毒优选是黄病毒。根据进行所述方法的另一个优选的实施方式，所述碱性磷酸酶选自由大鼠、小鼠、鸡、牛、酵母以及细菌碱性磷酸酶、优选大肠杆菌的碱性磷酸酶所组成的组。根据实施所述方法的进一步的优选的实施方式，所述杂合蛋白进一步包括多肽标记，该标记例如使用于从周质的提取物中纯化所述杂合蛋白。这种多肽标记的例子可以是HIS(hexahistidine，六聚组氨酸)、c-MYC、HA、VSV-G、HSV、V5和FLAG(Sigma产品)。因此，根据实施所述方法的进一步优选实施方式，所述杂合蛋白优选包含六聚组氨酸一一种合适的黄病毒ED3结构域和大肠杆菌的碱性磷酸酶，并且包含序列SEQIDNO:25。优选碱性磷酸酶由序列SEQIDNO:25组成。根据所述实施方法的实施方式，所述大肠杆菌的碱性磷酸酶是被修饰过的。更优选所述大肠杆菌的碱性磷酸酶在它的活性位点上包括两个突变D153G和D330N，并且包含序列SEQIDNO:24(LeDu等人，2002的编号)。在欧洲专利申请No.0752475中已经描述过这种修饰的PhoA。优选碱性磷酸酶由序列SEQIDNO:2组成。碱性磷酸酶的其他修饰也是可能的，并且包括在本发明中。出乎意料地，通过使用上述的检测分子，S卩，其至少包含黄病毒的结构域ED3和大肠杆菌的碱性磷酸酶，优选六聚组氨酸、黄病毒的结构域ED3和大肠杆菌的碱性磷酸酶(优选修饰过的碱性磷酸酶)的杂合蛋白，用于检测黄病毒的IgX抗体捕获免疫吸附测试可以在一些水平上得到显著的提高(i)用限定的同源分子种类替换在一些测试中使用的试剂(抗原或检测系统)粗制品；(ii)减少测试中必须的试剂数量和步骤；(iii)用能够在细菌中生成并容易被纯化的重组成分来取代涉及在安全实验室里对于制品的感染性的病毒、动物或细胞培养操作的测试中的所有成分。因此，检测分子优选(H6-ED3-PhoA)2杂合蛋白；所以，(H6-ED3-PhoA)2杂合蛋白的结合性通过PhoA部分的酶活性显现出来。许多产生比色的或化学荧光反应的PhoA的底物可以被用来显示。优选使用微量滴定板来固定抗IgG或抗IgM的抗体。固定也可以用其他类型和规格的载体，尤其是光学纤维。因此，可以用(H6-ED3_PhoA)2杂合蛋白进行测试，用于检测抗ED3结构域的其他免疫球蛋白型，比如IgA和IgE，从而检测来源于人和不同动物例如小鼠、牛和马的免疫球蛋白，并且检测除血清外的其他体液中的免疫球蛋白。同样也可以用来源于那些没有被提及的其他节肢介体病毒或其他黄病毒的ED3结构域来进行测试，因为来源于这个分类群的病毒的E糖蛋白具有高度同源的结构。也可以用其他抗原蛋白或蛋白片段间的杂合体来进行测试，无论它们是否来源于病原体，以及无论它们在这些试剂中是以单体还是多聚体状存在。也可以延伸至包括另一种不同于PhoA的示踪蛋白的双功能杂合蛋白。最终，也可以延伸至这种情况通过基因融合或与不同于示踪蛋白的特异性蛋白组件的化学耦合，来得到抗原的寡聚化。在ED3结构域的核酸或氨基酸序列的基础上，通过化学合成编码ED3结构域的DNA片段的可能性，极大地推进了杂合体的构建。象(H6-ED3_PhoA)2或更普遍的(Ag_PhoA)2的双功能二聚杂合体有很多的应用。它们可以被用来(i)检测抗与PhoA融合的抗原(Ag)的抗体；(ii)检测抗抗原来自于其或模拟其的病原体的抗体；(iii)诊断病原体感染或验证病原体或免疫原的接种；(iv)研究病原体的流行病学；(v)研究与PhoA融合的蛋白或蛋白片段与分子、蛋白或细胞之间的相互作用；(vi)在化学文库中筛选和识别可改变融合蛋白或蛋白片段与靶分子、细胞的蛋白之间的相互作用的分子。以前没有描述过使用rED3来成功地检测被感染的个体血清中的IgM。通过构建其基因序列和碱性磷酸酶基因的杂合体，本发明依赖于同时将重组抗原二聚化和将它融合于酶示踪物的可能性。这样，得到可以检测低亲合力的抗体的试剂；例如IgM免疫球蛋白，其是五聚体的并且在被节肢介体病毒感染的初期出现。这个早期检测可以用作流行病管理的手段。因此，它清楚地与那些基于IgG的检测并且只能用追溯研究的测试(这些测试例如各种夹心法、反向和间接ELISA)区分开来。尤其是，如本发明所述的优于现有技术的方法和试剂的优点包括(i)在低安全等级实验室里生产诊断试剂；(ii)在单个步骤并且不需要任何化学反应步骤中，对于每个病毒生产单个试剂；(iii)使用人工的二聚体抗原能检测在感染初期出现并且亲合力低的IgM;(iv)针对病毒和感染种类的特异性检测；(iv)通过将抗原和酶示踪物融合来简化并加速诊断测试。因此，优选地，所述的杂合体(H6-ED3-PhoA^是在编码六聚组氨酸、病毒结构域ED3以及大肠杆菌的碱性磷酸酶的序列之间的基因水平上构建的。六聚组氨酸标记使得杂合体可以通过镍离子柱进行纯化。PhoA是二聚的周质蛋白。基因水平上过客蛋白与PhoA的融合导致了杂合蛋白的二聚化、它输出至周质间隙、以及保持折叠和两部分的功能(BoulainandDucancel，2004)。而且，过客蛋白在PhoA二聚体的晶体结构上插入的对称点位于分子的相同一侧，靠近另一个分子(17.6A)并且远离催化位点032.5A)(LeDuetal.，2002)。因此，杂合体(ED3-PhoA-H6)2的构建解决了抗原效价的问题。该杂合体包括它们自己的酶示踪物，并且杂合体的酶部分并不取决于其抗原部分的本性。利用这个新的试剂，MAC-或者AAC-或者MAC-ELISA只包括三种参与分子，如下图示支持物-0IgX::血清(朋-ED3-PhoA)2(3)其中X二M、A或G。根据实施本发明方法的另一种实施方式，包膜蛋白结构域3多肽选自下组黄热病病毒包膜蛋白结构域3多肽、西尼罗河病毒包膜蛋白结构域3多肽、登革热病毒包膜蛋白结构域3多肽、圣路易斯脑炎病毒包膜蛋白结构域3多肽、墨莱溪谷脑炎病毒包膜蛋白结构域3多肽以及日本脑炎病毒包膜蛋白结构域3多肽。更优选ED3结构域选自WNY(称为ED3.WN)、黄热病毒(ED3-YF)或登革热病毒(血清型1、2、3或4)，并且优选选自DENY的血清型1(称为ED3.DEN1)。例如在国际PCT专利申请W02004/016586中描述了黄病毒的ED3多肽。这些新的试剂出乎意料地简化了MAC-、AAC-和GAC-ELISA，有助于使得它们更具重现性和定量性，并且因此更具特异性。它们的制备只需要低等级的生物安全性和技术方法。本发明也涉及一种杂合蛋白，其特征在于，它包括合适的多肽标记、节肢介体病毒ED3结构域和碱性磷酸酶。尤其是，本发明涉及能用于如本发明所述方法的杂合蛋白。根据所述杂合蛋白的优选的实施方式，其包含六聚组氨酸、合适的黄病毒ED3结构域和大肠杆菌的碱性磷酸酶。所述的杂合蛋白优选是多聚体形式，更优选二聚体形式，例如(H6-ED3_PhoA)2。根据所述杂合蛋白的另一个优选的实施方式-当ED3结构域来自DEN1病毒时，所述的杂合蛋白(朋-ED3.DENl-PhoA)代表序列(SEQIDNO:2)。-当ED3结构域来自DEN2病毒时，所述的杂合蛋白(H6-ED3.DEN2-PhoA)代表序列(SEQIDNO:4)。-当ED3结构域来自DEN3病毒时，所述的杂合蛋白(H6-ED3.DEN3-PhoA)代表序列(SEQIDNO:6)。-当ED3结构域来自DEN4病毒时，所述的杂合蛋白(朋-ED3.DEN4-PhoA)代表序列(SEQIDNO:8)。-当ED3结构域来自西尼罗河病毒时，所述的杂合蛋白(H6-ED3.WN-PhoA)代表序列(SEQIDNO:10)，以及-当ED3结构域来自黄热病病毒时，所述的杂合蛋白(H6-ED3.YF-PhoA)代表序列(SEQIDNO:12)。本发明也涉及编码如本发明所述杂合蛋白的核酸。所述的核酸优选自下组编码H6-ED3.DENl-PhoA杂合蛋白的序列SEQIDN0:1、编码H6-ED3.DEN2-PhoA杂合蛋白的序列SEQIDNO:3、编码H6-ED3.DEN3-PhoA杂合蛋白的序列SEQIDNO:5、编码H6-ED3.DEN4-PhoA杂合蛋白的序列SEQIDNO:7、编码H6-ED3.WN-PhoA杂合蛋白的序列SEQIDNO:9和编码H6-ED3.YF-PhoA杂合蛋白的序列SEQIDNO:11。根据与EP0407259和EP0752475描述的方法类似的方法可以得到所述的杂合蛋白。优选地，它们是通过将正确的ED3插入表达载体pEBL1(SEQIDN0:13)中而得到，此载体包含了含有两个突变(D153G和D330N)的修饰过的碱性磷酸酶(SEQIDNO:24)，编号参见LeDu等人，2002。所述的表达载体于2007年4月23日以保藏号1-3747保藏在CNCM(法国培养物和微生物国家保藏中心，28rueduDocteurRoux，75015，巴黎)。本发明同样涉及了制备如本发明所述杂合蛋白的方法，所述方法的特征在于，其包括(a)通过将编码合适的节肢介体病毒的ED3多肽、优选黄病毒ED3多肽的序列插入至载体pEBLl(SEQIDNO:13)中，得到包含编码如上限定的杂合蛋白的序列的表达载体，(b)用(a)中获得的载体转化合适的大肠杆菌、优选XL1-Blue菌株(Bullock等人，1997描述)，(c)在合适的培养基中培养所述改造过的菌株，以及(d)从周质提取物中纯化标记_ED3-PhoA杂合蛋白。当标记是六聚组氨酸时，纯化步骤(d)通过在NiNTA树脂柱上的亲和层析来进行。如此得到的不同表达载体包含了表达合适的杂合蛋白的序列载体杂合蛋白表达PEBL11H6-ED3-DENl-PhoAPEBL12H6-ED3-DEN2-PhoAPEBL13H6-ED3-DEN3-PhoAPEBL14H6-ED3-DEN4-PhoAPEBL15H6-ED3-丽-PhoAPEBL17H6-ED3-YF-PhoA根据实施所述方法的一个实施方式，步骤(a)中的表达载体选自由如上限定的杂合蛋白的表达载体所组成的组，更优选杂合蛋白H6-ED3.DENl-PhoA的表达载体(pEBLll，于2007年4月23日以保藏号1-3748保藏在CNCM(法国培养物和微生物国家保藏中心，28rueduDocteruRoux，75015，巴黎))和杂合蛋白H6-ED3.WN-PhoA的表达载体(pEBL15，于2007年4月23日以保藏号1-3749保藏在CNCM(法国培养物和微生物国家保藏中心，28rueduDocteurRoux，75015，巴黎))。本发明也涉及用于筛选受试者或动物中节肢介体病毒抗体、优选黄病毒抗体的方法，所述方法包括(i)使来源于所述受试者或动物的样品与被Ig结合蛋白敏化的固相载体相接触，此Ig结合蛋白抗所研究的受试者或动物种类的特定种类的Ig分子，(ii)将(i)中形成的免疫复合物与检测分子一起温育，此检测分子由至少含有节肢介体病毒ED3结构域和碱性磷酸酶的杂合蛋白所组成，以及(iii)检测所述的节肢介体病毒抗体的存在。所述的检测优选通过加入pNPP并测定对硝基苯酚的形成来进行。在所有提到的方法和试剂盒中，Ig结合蛋白、ED3结构域、碱性磷酸酶以及多肽标记如同上述所描述的。本发明也涉及用于诊断和/或筛选受试者中节肢介体病毒抗体、优选黄病毒抗体的试剂盒，其包含-用Ig结合蛋白敏化的固相载体，此Ig结合蛋白抗所研究的动物种类的特定种类的Ig分子，并且通常由异源抗体(抗IgX抗体)组成，以及-至少一种杂合蛋白，其至少包含节肢介体病毒ED3结构域和碱性磷酸酶，-至少一个阳性对照，优选来自感染的个体的参照血清，以及-至少一个阴性对照，优选来自未感染的个体的参照血清。Ig结合蛋白优选自由抗IgM、抗IgG和抗IgA(0IgX，X=M、A或G)所组成的组，并且所述的杂合蛋白包括六聚组氨酸、合适的黄病毒的病毒ED3结构域和大肠杆菌的碱性磷酸酶。根据所述试剂盒的一个优选的实施方式，碱性磷酸酶是修饰过的碱性磷酸酶，包括在它的活性位点上的两个突变D153G和D330N(LeDu等人的编号)。优选碱性磷酸酶包含序列SEQIDNO:24。本发明也涉及包含病原体的合适抗原和碱性磷酸酶的杂合蛋白用于被所述病原体感染的体外诊断、或用于所述病原体流行病学研究的应用。本发明也涉及包含病原体的合适抗原和碱性磷酸酶的杂合蛋白用于抗所述病原体或其免疫原的疫苗接种的体外确证的应用。本发明也涉及包含蛋白或其片段和碱性磷酸酶的杂合蛋白用于研究与碱性磷酸酶融合的所述蛋白或其片段与分子、蛋白或细胞之间相互作用的应用。本发明也涉及诊断被病原体感染、用于确证被病原体或其免疫原接种、或用于研究所述病原体流行病学的方法，其特征在于，其包括(i)将来源于受试者或动物的样品与被Ig结合蛋白敏化的固相载体相接触，此Ig结合蛋白抗抗研究的动物种类的特定种类的Ig分子，(ii)将(i)中形成的免疫复合物与由杂合蛋白组成的检测分子一起温育，此杂合蛋白包含病原体的合适抗原和碱性磷酸酶，所述的免疫复合物的存在就是所述感染的标记。本发明也涉及研究融合于PhoA的蛋白或其片段与分子、蛋白或细胞之间的相互作用的方法，其特征在于，包括(i)将所述的分子、蛋白或细胞与包含融合于PhoA的蛋白或其片段的杂合蛋白相接触，以及(ii)检测在融合于PhoA的蛋白或其片段与所述分子、所述蛋白或所述细胞之间最终形成的复合物。本发明也涉及筛选抗节肢介体病毒的化合物的方法，所述的方法包括(i)将最终结合在固相载体上的抗节肢介体病毒的抗体或节肢介体病毒表面分子的受体与包含融合于PhoA的节肢介体病毒表位的杂合蛋白相接触；(ii)通过测定合适的信号，例如对硝基苯酚的形成，来检测在所述抗节肢介体病毒抗体或所述受体与所述表位形成的复合物；(iii)加入要检测的化合物；以及(iv)通过测定合适的信号，并且比较获得的信号与(ii)中获得的信号，来检测在所述抗节肢介体病毒抗体或所述受体与所述表位之间形成的复合物的量相对于在步骤(ii)中检测到的复合物的量是否降低。在所有的方法中，通过加入4-硝基苯基磷酸盐(pNPP)并测定对硝基酚的形成来直接测定复合物的形成。除了上述规定，本发明也包括其他规定，可从下面的实施本发明的实施例以及附图描述中体现出来，其中图1.质粒pLBll、pVP5、pLIP5GN-H6和pEBLl的结构。bla和即h基因各自编码氨苄西林和卡那霉素抗性。ss代表信号序列并且H6代表六聚组氨酸。下面部分是，在pLIP5GN-H6和pEBLl中的phoA信号序列的5'末端和phoA基因的主要部分之间的详细序列。垂直的箭头标明信号肽的切割位点。不属于phoA基因或其产物的残基是用斜体字排字的。图2.用H6-ED3.DENl-PhoA杂合体进行简化的小鼠血清GAC-ELISA。实心符号，来自被DENV1感染的小鼠的血清；空心符号，未感染小鼠的对照血清。方形，25t:下2.5小时显示的值；圆形，4t:下过夜显示的值；菱形，空白的平均值。2.5小时和过夜的对照血清信号迭加。图3.用H6-ED3.WN-PhoA杂合蛋白进行简化的小鼠血清MAC-ELISA。实心符号，用gpE.WN免疫的小鼠的血清；空心符号，未免疫的小鼠的对照血清。方形，25t:下3小时显示的值；圆形，4t:下过夜显示的值；菱形，空白的平均值。图4.简化的针对抗原的GAC-ELISA的特异性。用H6-ED3.DENl-PhoA和H6-ED3.WN-PhoA杂合蛋白平行进行的测试。实心符号，被DENV1感染的小鼠血清；空心符号，未感染的小鼠的对照血清。圆形，同种的H6-ED3.DENl-PhoA抗原；方形，非同种的H6-ED3.WN-PhoA抗原；菱形，空白的平均值。在4t:下过夜显示的值。图5.简化的针对抗原的MAC-ELISA的特异性。用H6-ED3.DENl-PhoA和H6-ED3.WN-PhoA杂合体平行进行的测试。实心符号，被WNV感染的小鼠的血清；空心符号，未感染的小鼠的对照血清。圆形，同种的H6-ED3.WN-PhoA抗原；方形，非同种的H6-ED3.DENl-PhoA抗原；菱形，空白的平均值。在4t:下过夜显示的值。图6.在用H6-ED3.DENl-PhoA杂合体进行的人血清的简化MAC-ELISA中信号的浓度依赖性。实心符号，初次感染DENV1的病人的血清；空心符号，DENV1的继发性感染。在25t:下3小时显示的值。图7.用朋-ED3.DENl-PhoA杂合体进行的被DENV四种血清型感染的病人的血清的简化的MAC-和GAC-ELISA。血清被稀释400倍，并且在25。C下3小时测试显示的值。(A)，简化的MAC-ELISA。(B)，简化的GAC-ELISA。(C)，MAC-和GAC-ELISA的信号的比值r。样品1.l，被DENV1初次感染的血清；1.2，被DENV1继发性感染的血清；2、3和4，被DENV2、DENV3和DENV4感染的血清；C，健康个体的血清；N和B，分别没有添加血清或抗人Ig的测试中的信号。具体实施例方式下面的例子是用来阐明本发明，但并非对其进行限制。实施例1:材料和方法-培养基、缓冲液和试剂盒已经描述过培养基LB(SambrookandRussell，2001)和SB(Pliickthun，1996)。氨苄西林使用的浓度是200i！g/mL，卡那霉素是50yg/mL。含有氨苄西林的LB培养基被用于所有的基因构建体。用Qi即r印SpinMinipr印试剂盒(购自Qiagen)进行质粒DNA的制备，用GelExtraction试剂盒(购自Qiagen)从琼脂凝胶中提取DNA，用QuickLigation试剂盒(Roche)连接DNA，用NuPAGENovex系统(Invitrogen)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用96孔微量滴定板(Maxisorb，Nunc)进行酶联免疫吸附测试(ELISA)。PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)购自Invitrogen或Sigma-Aldrich;牛血清白蛋白购自Roche;低脂奶粉购自Regilait;Tween20、4_硝基苯基磷酸盐(pNPP)和5_溴_4_氯_3_碘磷酸盐(Xp)购自Sigma-Aldrich。缓冲液A含有50mMTris-HCl，pH8.0，500mMNaCl;缓冲液B，含有PBS中0.05%Tween;缓冲液C，含有PBS中0.1%Tween;缓冲液D，10%乙醇胺，pH9.8，0.01MMgS04;缓冲液E，缓冲液D中20iiMZnCl2。_细菌、质粒和病毒株已经描述过大肠杆菌XL1-Blue菌株(Bullocketal.，1987)和质粒pET20b+(www,nova咖.com)、pUC-4K(基因库登录号No.X06404)(VieiraandMessing,1982)、pCR-Blunt(Bernardetal.，1994)、pQUANTAbody(BoulainandDucancel，2004)、pLBll(Lisovaetal.，2007)以及pVP5(Lisovaetal.，2007)。XLl-Blue超级感受态细胞(Stratagene)、pCR-Blunt(Invitrogen)、pET20b+(Novagen)以及pUC-4K(AmershamBiosciences)购自供应商。质粒pLIP5GN_H6是pQUANTAbody的衍生物(图1)。已经描述过登革热病毒的血清型1的FGA/89病毒株(DENV1;基因库登录号AF226687)(DuartedosSantosetal.，2000)、西尼罗河病毒的IS-98-STl病毒株(WNV;基因库AF481864;(Malkinsonetal.，2002))、麻疹病毒的Schwarz病毒株的重组型MVSehw以及它的衍生型MVs^-sEWNV(Despresetal.，2005)。pUC-4K携带即h基因，以可容易移动的DNA盒形式赋予卡那霉素抗性。在启动子ptac的控制下，pQUANTAbody携带来自大肠杆菌的phoA基因的突变等位基因。这个等位基因编码在其活性部位有两个突变D153G和D330N并有提高的催化性能的碱性磷酸酶(PhoA)(BoulainandDucancel，2004;LeDuetal.，2002;Mulleretal.，2001)。pLIP5GN_H6与pQUANTAbody的不同之处在于六个组氨酸密码子(H6)和多克隆位点区域的存在，两者都位于phoA的密码子27和28之间、信号序列的下游(图1)。pLBll和pVP5在pET20b+的Ncol和Xhol限制位点之间各自携带编码ED3.DEN1和ED3.WN的基因片段(图1)。MVSchw-sEWNV表达来源于WNY的水溶性形式的gpE。-抗体和抗血清山羊抗人的IgM和IgG(Sigma-Aldrich)购自供应商。人的血清来自于法国圭亚那的巴斯德研究所国家节肢介体病毒参照中心的保藏库。它们是从显示出基本的登革热临床症状(发热、头痛、肌肉疼痛、关节疼痛)并伴随着/或不伴随发疹和少量出血表现的病人那里收集。血清通过标准的诊断方法来表征，尤其是使用小鼠大脑提取物作为抗原的GAC_禾口MAC-ELISA。山羊抗小鼠的IgM(Pierce)和IgG(Sigma-Aldrich)购自供应商。已经描述过小鼠的单克隆抗体mAb4Ell(Bedouelleetal.，2006)。已经描绘了ED3.DEN1结构域表面的表位；它是不连续的和构象的(Lisovaetal.，2007)。通过在JO天用病毒感染BALB/c小鼠，在J28天用相同的病毒攻击以及在J53天采血，得到抗DENV1的小鼠血清。从相同种类的未感染的小鼠得到对照血清。阳性血清IgG的滴度如下所述，并且通过抗结构域ED3.DEN1的间接ELISA来测定，等于30，000(Despresetal.，2005)。通过在JO天用重组的病毒MVs^-sE,感染CD46-IFNAR小鼠，在J18天采血，获得抗来源于WNY的sE的血清。用"空"病毒MV^感染小鼠，获得对照血清。阳性和对照血清的IgM的滴度各自等于1000和100。实施例2:中间载体pEBLl的构建，于2007年4月23日以保藏号1-3747保藏在CNCM(法国培养物和微生物国家保藏中心，28rueduDocteurRoux，75015，巴黎)。位于质粒pLIP5GN-H6克隆区域的限制性位点是非常近的，在这个区域很难进行双重限制性切割操作。因此将卡那霉素抗性盒插入这个区域的SalI位点。用SalI酶消化质粒pUC-4，并且含有即h基因的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。同样用Sail消化pLIP5GN-H6。纯化的片段和线形的载体通过连接进行重组。通过将连接的混合物转化进XL1-Blue感受态细胞，并且在含有氨苄西林和卡那霉素的LB培养基上筛选转化细胞，来回收重组质粒pEBLl(SEQIDNO:13)。更确切地说*XLl_Blue(pEBLl)XLl-Blue(pEBLl)是含有pEBLl质粒的大肠埃希氏杆菌菌株。pEBLl被工程化成用来简化在六聚组氨酸、想要的过客蛋白(黄病毒的ED3)和来自大肠杆菌的具有提高的催化性能的碱性磷酸酶之间的融合蛋白的构建。在pEBLl中，将赋予卡那霉素抗性的DNA盒插入过客基因的位置。因此根据Herma皿等人以前在1990年描述的克隆策略，过客基因的插入是容易实施和监控的。承用于XLl-Blue(pEBL)构建的细菌菌株和质粒见实施例l。生物体是氨苄西林和卡那霉素抗性的通过将生物体平皿接种在含有LB琼脂培养基UOOiig/ml氨节西林和50iig/ml卡那霉素的皮式培养皿上，能够检验表现型。实施例3:ED3-PhoA杂合基因的构建方法编码黄病毒ED3结构域和PhoA之间杂合蛋白的ED3-phoA杂合基因，其构建如下所述用限制性内切酶Smal首先消化质粒pEBLl(见实施例2)，用电泳来验证消化的完成，并且通过在MicrospinG25柱(Amersham-Biosciences)上的大小排阻层析将被消化的DNA脱盐。然后用Sail酶消化线形pEBL，并且用电泳和对应卡那霉素抗性盒的DNA片段(1252bp)的出现来监控此限制性切割。通过使用两个寡核苷酸引物和高保真聚合酶Pfu-Turbo(Stratagene)的PCR来扩增ED3基因。在ED3基因5'末端杂交的引物引入了Sail位点，在3'末端杂交的引物引入了Seal和Spel位点。Seal位点(AGT-ACT)优于Smal位点(CCC-GGG)，是因为后者引入了一个罕用密码子CCC。Scal、Spel和Sail位点在ED3.DEN1和ED3.WN基因中是没有的。用Sail和Seal消化PCR产物。通过琼脂糖凝胶和提取来纯化消化产物，然后通过连接来重组。重组的质粒通过转化被引入XL1-Blue菌株，并且重组细菌通过在Xp指示培养基上形成蓝色菌落和对卡那霉素敏感而被筛选。用于扩增来源于质粒pLBll的ED3.DEN1的引物，含有下面的序列，其中限制性位点被在其下面划线5'-GCCGGCGGTCGACAAAGGGATGTCATATGTGATGTGCAC-3'(SEQIDNO:14)5'-GTTTAGTACTAGTTTTCCCTATGCTGCTTCCCTTC-3'(SEQIDNO:15)。同样地，用于扩增ED3.WN的引物含有下面的序列5'-GCCGGCGGTCGACAAAGGAACAACCTATGGCGTCTG-3'(SEQIDNO:16);5'-GGTGAGTACTAGTTTTGCCAATGCTGCTACCAGAC-3'(SEQIDNO:17)。重组质粒，编码H6-ED3.DENl-PhoA的pEBLll和编码H6-ED3.WN-PhoA的pEBL15的序列，通过与pEBLl克隆区域之外杂交的寡核苷酸来检测。5'-GCACTGGCACTCTTACCGTTAC-3'(SEQIDNO:18);5'-CAGTCTGATCACCCGTTAAAC-3'(SEQIDNO:19)。实施例4:双功能的ED3-PhoA杂合体的生成和纯化生成和纯化H6-ED3-PhoA杂合体是由XLl-Blue菌株中的质粒pEBLll和pEBL15产生的。通过将分离的菌落接种于SB液体培养基(1/10体积)并37t:过夜培养，得到生产菌株的预培养物。将预培养物以一定体积的相同的培养基稀释得到初始的吸光度=0.25-0.30，在3(TC下培养直到A6。Qnm=1.5-2.O，用0.2mMIPTG来诱导启动子ptac，进一步在相同的温度下培养2小时，得到生成物。所有接下来的步骤在4t:下进行。培养物以5000rpm离心10分钟。细菌沉淀物重悬浮在含5mM咪唑、lmg/ml多粘菌素B硫酸盐(Sigma-Aldrich)的缓冲液A(l/40体积)中，并且细菌悬浮液用磁力搅拌仪轻柔搅拌1小时。通过在13000rpm下离心悬浮液10分钟来收集周质提取物，并且在-2(TC下冷冻。通过NiNTA树脂柱(培养物的0.6ml/L，Qiagen)的亲和层析从周质提取物中纯化ED3-PhoA杂合体。用周质提取物上柱，并且用含20mM咪唑的缓冲液A(10体积的树脂)洗涤。被结合的蛋白以40至lj100mM梯度的咪唑缓冲液A洗脱。用还原条件的SDS-PAGE(12X丙烯酰胺)分析纯化物的组分。收集含有朋-ED3-PhoA并被纯化至〉90X的部分，汇集，并且通过P10柱(Amershambiosciences)的大小排阻层析被转移至PBS缓冲溶液中。它们在转移进PBS之前或之后在-S(TC下骤冷，功能性质方面没什么不同(见结果)。纯化的H6-ED3-PhoA杂合体的浓度通过使用A28。和单体的消光系数e28。^二40680M—1011—"来确定，此消光系数用subroutineP印statsofthesoftwaresuiteEMBOSS(Riceetal.，2000)由它们的氨基酸序列计算而来。间接ELISA间接ELISA在200iiL/孔体积的微量滴定板上进行。抗体mAb4E11用PBS稀释10000倍。孔板的孔1到11用抗体溶液加样，孔12用PBS单独加样，孔板在4t:下过夜温育用于吸附反应。用缓冲液B(3次)洗涤小孔，在25t:下用3XBSA的缓冲液B封闭3小时，并且用缓冲液B(4次)再次洗涤。朋-ED3.DENl-PhoA杂合体(0.2yM初始浓度)用1%BSA的缓冲液B依次以2倍梯度稀释。孔1-10用杂合体的前10次的稀释来加样，孔11用稀释缓冲液单独加样，并且孔12用杂合体的最低的稀释溶液来加样。孔板在25t:下温育1小时，用于捕获反应。小孔象上述那样被洗涤，捕获的杂合体通过加入含5mM(2mg/ml)pNPP的缓冲液D来显示。fC下过夜于A4。5nm处检测对硝基苯酚的形成。酶活性在25t:下于缓冲液D或E中，于A4。5nm处检测从pNPP形成的对硝基苯酚盐(pNP)。pNPP(5mM)的起始浓度是饱和的(LeDuetal.，2002)，并且因此动力学参数keat可以通过公式来计算dA405nm/dt=kcatE0e(pNP)(4)其中dA4。5nm/dt是pNP形成的初始速度；E。是(H6-ED3-PhoA)2二聚体的总浓度；以及e405nm(PNP)=1.78X104M—W乂Mulleretal.，2001)。kcat值通过E0的几个值来测定，并且求平均值。朋-ED3-PhoA杂合体的功能性18为了评估H6-ED3-PhoA杂合体的功能性，测定它们的磷酸酶活性，并且分析它们被单克隆抗体mAb4E11的识别。H6-ED3.DENl-PhoA和H6-ED3.WN-PhoA杂合体对于pNPP脱磷酸化变成PNP是有活性的，在缓冲液D中在25t:下对于一个二聚体分子k。at值分别等于190±18s—"和154±6s—、在间接ELISA中被结合的H6-ED3.DENl-PhoA特异性地固定mAb4Ell，被它内在的磷酸酶活性显示。这些结果表明，杂合体的PhoA部分是正确折叠的并且是二聚体的，因为PhoA的二聚体形式的活性是它的单体形式的100倍(BoulangerandKantrowitz，2003)。它们表明，杂合体的ED3.DEN1部分作为抗原是正确折叠的和有功能的，因为mAb4E11的表位是不连续的、构象的和包含在结构域里的(Lisovaetal.，2007)。因为每个杂合体分子的抗原性质通过其内在的磷酸酶活性显示出来，结果表明绝大部分的H6-ED3.DENl-PhoA分子同时具有所有必需的性质，即它们的PhoA部分是二聚体的和有活性的，并且它们的ED3.DEN1部分是抗原性的和处于二价的状态。在PhoA多肽链位点7中的两个残基都位于PhoA二聚体结构的同一侧(LeDuetal.，2002)。因此，朋-ED3-PhoA二聚体中ED3部分的两个拷贝也应当在分子的同一侧并且根据抗体亲抗原模式与免疫球蛋白相互作用。上面的结果足以显示，朋-ED3-PhoA杂合体能够在GAC-和MAC-ELISA中使用。通过间接ELISA来显示H6-ED3.DENl-PhoA和抗体mAb4E11之间的识别的存在，其表位是不连续的和构象的，其中mAb4E11被固定在微量滴定板的小孔中并且通过杂合体的碱性磷酸酶活性来显示与杂合体的结合。这个实验表明，每个杂合体分子的两个部分ED3.DENl和PhoA是同时有功能性的。因此，这两个部分是正确折叠的，它们必需的二硫键在周质的氧化介质中形成，并且它们的组合是二聚体的，因为PhoA只有在寡聚状态才是有显著活性的。每个杂合体分子都是二聚的和双功能的。间接ELISA实验表明，有可能通过(朋-ED3.DENl-PhoA)2来检测ED3.DEN1结构域和抗体mAb4E11之间的识别。该杂合体可以用来检测ED3和其他分子，象抑制剂、其他抗体、受体或甚至整个细胞之间的相互作用。H6-ED3.DENl-PhoA和H6-ED3.WN-PhoA的催化常数keat的值确证了杂合体分子PhoA部分的高活性和它们的二聚体的状态。重组ED3通过PhoA的人工二聚化部分地模仿了它们在整个病毒表面的多聚性的呈现和它们与抗体或其他受体相互作用的多价位的模式。实施例5:GAC-ELISA和MAC-ELISA方法捕获ELISA在lOOiiL/孔体积的微量滴定板上进行。抗IgG和抗IgM的抗体用PBS稀释(终浓度是lmg/mL)。孔板上的孔1至11用抗体溶液加样，并且孔12只用PBS加样。孔板在4t:下过夜温育，用于吸附反应。第二天早晨，用缓冲液C(3次)洗涤小孔，在37t:下用3%(w/v)奶粉的缓冲液C封闭1小时，然后用缓冲液C(3次)再次洗涤。分析中的血清和对照血清用1%奶粉的缓冲液C稀释100倍，然后依次稀释；朋-ED3-PhoA杂合体用相同的缓冲液稀释(单体的最终浓度是0.5iiM)。孔1-10用血清的前10次的稀释液来加样，孔11用稀释缓冲液单独加样，并且孔12用血清的最低的稀释溶液来加样。孔板在37°C下温育1小时，用于抗体捕获反应。小孔用缓冲液C洗涤(3次)然后用H6-ED3-PhoA溶液加样。孔板在37t:下温育l小时，用于结合反应。按上述步骤洗涤小孔，并且通过添加5mMpNPP的缓冲液E来显示被结合的H6-ED3-PhoA分子。在25。C下几小时或4。C下过夜后测定~。5。如果血清的信号值至少是空白对照的两倍时，认为血清的信号是有效的。血清的滴度等于仍然有效的最大稀释倍数。用于小鼠血清进行的捕获ELISA试验与用于人血清的试验一样，除了延长洗涤之外，抗IgM抗体使用的最终浓度是2.4mg/mL，H6-ED3.DENl-PhoA单体的最终浓度是0.2iiM，以及pNPP在缓冲液D中。结果用于抗黄病毒的IgG的定量的简化的GAC-ELISA它用来检验H6-ED3-PhoA杂合体是否能够在免疫的小鼠的血清中检测出抗同种的黄病毒的IgG，因此可以简化常用于血清学的GAC-ELISA方案。因此，抗小鼠IgG的抗体通过在塑料上的被动吸附而被固定在微量滴定板上。用该被固定的抗体来捕获存在于小鼠血清中的IgG。抗ED3结构域的IgG，通过H6-ED3-PhoA杂合体经其抗原部分的结合性和它的PhoA部分的催化活性来显示(见公式3)。用被DENV1免疫的小鼠的血清来进行测试。未免疫的小鼠的血清、没有添加抗IgG抗体的空白试样以及没有添加血清的空白试样被用作对照(见材料和方法部分)。被H6-ED3.DENl-PhoA杂合体催化并在A4。5nm处监控的由pNPP生成的pNP，被用作信号来显示结合反应(图2)。低饱和度的A，，信号形成与免疫血清浓度的函数关系。这些试验独立重复三次，过夜后显现的免疫血清的滴度>50000(2.5小时后>12500)。未免疫的血清的信号与空白信号相比没什么不同，反之过夜后免疫血清的信号显示视浓度而定比空白信号高2至18倍(2.5小时后2至6倍)。这些结果确证了朋-ED3.DENl-PhoA的两部分在同一个分子杂合体中是同时有功能的。它们表明，此杂合体能灵敏地、定量地并且特异性地检测血清中抗ED3.DEN1结构域的IgG的存在，因此能检测出登革热病毒的感染。用于抗黄病毒的IgM的定量的简化的MAC-ELISA同样地，它用来检验H6-ED3-PhoA杂合体是否能够在免疫的小鼠的血清中检测出抗黄病毒的IgM，因此可以简化常用的MAC-ELISA方案。抗小鼠IgM的抗体被固定化。用该固定化的抗体来捕获存在于小鼠血清中的IgM。抗ED3结构域的IgM用二价的H6-ED3-PhoA杂合体来显示(见公式3)。用被嵌合体病毒MVSehw_sEWNV免疫的小鼠的血清来进行测试，MVSehw_sEWNV表达WNY的gpE的分泌型。用空载体MVSchw免疫的小鼠血清、没有添加抗IgM抗体的空白试样以及没有添加血清的空白试样被用作对照(见材料和方法部分)。H6-ED3.WN-PhoA杂合体用来显示结合反应(图3)。低饱和度的信号形成与免疫血清浓度的函数关系。过夜后显现的免疫血清的滴度>800(3小时后>400)。过夜温育后未免疫的血清的A4。5nm信号比空白信号最多高1.7倍，反之免疫血清的信号视浓度而定比空白信号高2至6.4倍。温育3小时后显示对于未免疫血清这些数字是1.2倍，对于免疫血清是2至2.6倍。注意，对于血清的相对浓度《2.5%。，未免疫血清的信号没有显著地与空白信号区分开来。这些结果确证了H6-ED3.WN-PhoA的两部分在同一个分子杂合体中是同时有功能的。它们表明，杂合体可以灵敏地、定量地和特异性地检测抗ED3.WN结构域的IgM的存在。它们表明，杂合体可以使人们早期检测出与WNY的接触(在第8天)。实施例6:通过ED3-PhoA杂合体来辨别黄病毒根据本发明通过实施交叉反应来测定简化的GAC-和MAC-ELISA的特异性。将被20DENVl病毒免疫的小鼠的血清提交给两个被H6-ED3.DENl-PhoA杂合体或H6-ED3.WN-PhoA显示的平行GAC-ELISA试验(图4)。相应地，将被MVs。hw_sEWNV嵌合病毒免疫的小鼠的血清提交给两个被朋-ED3.DENl-PhoA杂合体或朋-ED3.丽-PhoA显示的平行MAC-ELISA试验(图5)。过夜显示后，GAC-ELISA中同种的信号比非同种的信号最多高达5.4倍，并且MAC-ELISA中最多高达3.9倍。当然，当考虑到特异的信号(血清的信号减去空白的信号)时，这些数值会大得多。这些结果表明，如同这里所描述的，GAC-和MAC-ELISA是特异性的，并且它们可以允许人们确定涉及的感染或免疫接种的黄病毒的种类。实施例7:用简化的GAC-和MAC-ELISA来测试人的血清用H6-ED3.DENl-PhoA杂合体来检测来自曾感染过登革热病毒DENVl至DENV4四种血清型之一的病人的血清。对于DENV1，三个血清样品是在症状开始之后的第9天与第28天之间采集，对应于登革热病毒的初次感染；两个血清样品在第13天和第18天采集，对应于继发性感染。对于DENV2、DENV3和DENV4，在第8天和第32天之间采集样品，不知道是初次感染还是继发性感染状态。这些血清以前以乳鼠大脑作为抗原，用GAC-和MAC-ELISA标准方法测试过。使用下面的对照一个试验中没有添加抗人IgG或IgM的固定抗体；一个实验中没有添加血清；两个实验中使用的是没有被登革热病毒感染的病人的血清。对于在MAC-ELISA(图6)中初次感染DENVl病人的血清和对于在GAC-ELISA(未图示)中继发性感染DENV1病人的血清，饱和度的A^，信号形成与血清中浓度的函数关系。它直线型上升直至血清的相对浓度>2.5%。。因此，使用相对浓度用于以下分析。25t:下3个小时的试验的显现是足够的。在20个检测的血清中，只有对应于初次感染的三个血清在MAC-ELISA中给出阳性信号，即，超过对照信号的两倍；所有其他的血清给的信号与对照是相同的(图7A)。因此，根据本发明简化的MAC-ELISA可以检测出DENVl的初次感染，并且将DENVl感染和其他三种血清型区分开来。在GAC-ELISA中四种血清样品给出阳性信号两个样品来自于DENVl继发性感染的病人；来自于DENV2感染的病人的六个样品中的一个样品(2d);来自于DENV4感染的病人的两个样品中的一个样品(4a)(图7B)。因此，根据本发明简化的GAC-ELISA可以在症状开始后第13天检测出DENVl的继发性感染。病人的血清2d和4a在简化的GAC-ELISA中得分为阳性，可能以前被DENVl未注意地感染过。采集样品的当天和在简化的MAC—ELISA和GAC-ELISA中的信号值之间没有看到相关性。用平行的MAC—ELISA和GAC-ELISA中的信号比值r来测定登革病毒的感染是否是初次感染还是继发性感染类型。根据本发明计算简化的捕获ELISA中的信号比值(图7C)。对应于DENVl初次感染的三个血清的r>1.90。对应DENV2、DENV3和DENV4感染的血清r<1.4，除了血清2d和4a之外。对应于DENVl继发性感染的血清，血清2d和4a的r<0.4。因此，比值r可以区分初次感染和继发性感染，以及也区分DENVl的初次感染和其他DENV血清型的感染。(朋-ED3.DENl-PhoA)2杂合体被成功地应用于简化的GAC-ELISA中，来显示在抗病毒被高免疫的小鼠的血清中、或在经受了病毒继发性感染的病人的血清中抗DENVl的IgG的存在。相同的杂合体被成功地应用于简化的MAC-ELISA中，来显示在经受了病毒的初次感染的病人的血清中抗DENVl的IgM的存在。简化的GAC-ELISA使得我们能区分小鼠的DENVl感染和WNY感染。简化的GAC-ELISA和MAC-ELISA组合使得我们能区分人的DENVl感染和其他三种DENV血清型感染，以及区分DENV1的初次感染和继发性感染。同样，(H6-ED3.WN-PhoA)2杂合体被成功地应用于简化的MAC-ELISA中，来显示小鼠的血清中抗丽V的IgM的存在。简化的MAC-ELISA使得我们能区分WNY感染和DENV1感染。简化的GAC-ELISA和MAC-ELISA的高特异性和灵敏度可能来自于两个因素ED3结构域作为抗原的使用和检测系统的独立性，包括针对抗原的本性和它与血清的免疫球蛋白的相互作用的与PhoA的融合。(H6-ED3-PhoA)2的双功能的二聚体的特异性应当比直到目前还在使用的抗原和检测系统的特异性要高。实施例8:用简化的MAC-ELISA来检测人的血清在进一步的试验系列中，收集被登革热病毒四种血清型DEN1至DEN4之一感染或被黄热病病毒(YFV)感染的病人的血清，并用MAC-ELISA标准方法(Talarminetal.，1998)和PCR(Lanciottietal.，1992)来表征。标准MAC-ELISA使用感染的乳鼠大脑的提取物作为抗原，并且PCR使用对于每个病毒血清型(表I)特异的引物。引物的序列和扩增的条件如(Lanciottietal.，1992)所述。尤其是引物的序列如下所示引物Dl:5，-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3'(SEQIDNO:26)。引物D2:5'-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3，(SEQIDNO:27)。引物TSl:5，-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3'(SEQIDNO:28)。引物TS2:5，-CGCCACAAGGGGCATGAACAG-3，(SEQIDNO:29)。引物TS3:5，-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3'(SEQIDNO:30)。引物TS4:5'-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA—3'(SEQIDNO:31)。扩增发生在含有下列成分的lOOii1体积中50mMKCl、10mMTris(pH8.5)、1.5mMMgCl2、0.01%gelatin、200yM四种脱氧核苷酸三磷酸盐的每种、5mM二硫苏糖醇、50pmol每个弓l物、2.5个单位的rav-2重组RT(Amersham，ArlingtonHeights,111.)禾口2.5个单位的Amplitaq聚合酶(PerkinElmer，Norwalk，康涅狄格州)。这个反应允许在热循环程序中进行，42t:下孵育1小时，然后进行35次循环的变性(94°C，30秒)，引物退火(55°C，1分钟)和引物延伸(72°C，2分钟)。表I.用于简化MAC-ELISA和GAC-ELISA分析的人血清的数量。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在上述的表I中，第1列用标准诊断方法在病人血清中检测出的黄病毒(见本文)。第3列用对应于DENV四种血清型的H6-ED3-PhoA杂合体平行检测的血清的数量。第4列用四种H6-ED3.DEN-PhoA杂合体和H6-ED3.YF-PhoA杂合体平行检测的血清的数量。第4列的血清组成了第3列血清的一个亚组。19个感染YFV病人的血清中有四个来自于卡宴市(法国圭亚那)的巴斯德研究所并且对应于近期刚接种抗YFV的病人，剩余的15个血清来自于达喀尔(塞内加尔)的巴斯德研究所。根据本发明通过简化的MAC-ELISA，使用五个对应的H6-ED3_PhoA杂合体并且按以前所描述的方法(见实施例5)，对采集的血清进行试验。简化的MAC-ELISA的一般形式如下所示支持物-0huIgX::血清(H6-ED3-PhoA)2其中恥uIgM是抗人IgM的抗体。发明者认为血清试验的信号A是阳性的，只要它比对照的信号Ac高两倍以上，即A〉2Ac。后者存在于实施的n次重复试验(n^3)、并且不添加抗人IgM的抗体的试验。表II给出了对于每种血清和杂合体的阳性信号的比例。对于每种血清，同种的杂合体的阳性信号的比例是最大的，除了DENV4感染的病人的血清之外。在最近的例子中，ED3.DENl-PhoA和ED3.DEN2-PhoA杂合体的阳性信号的比例是最高的。DEN2和YF血清很少与非同种的杂合体反应。相反，DEN1血清经常与DEN2和DEN3杂合体反应，并且DEN4血清与每种DEN杂合体反应。相反，对于每种杂合体，同种的血清的阳性信号的比例是最大的，除了ED3.DEN4-PhoA与每种血清都很微弱的反应之外。尤其是，DEN1和YF杂合体很少与非同种的血清反应。表II.通过简化的MAC-ELISA使用H6-ED3-PhoA杂合体来检测人的血清。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在上述的表II中，第1列给出了用于测试的H6-ED3-PhoA杂合体类型，即，其ED323部分的病毒来源。2-6列给出了每种血清和杂合体的阳性血清的比例。如果血清的信号A高于对照信号Ac的两倍(A>2Ac)，血清的信号被认为是阳性的；如果低于对照信号的两倍(A<2Ac)，则是阴性的。表I中给出了人血清的数量和性质。表III给出了每种血清和每种杂合体的比例(血清信号)/(对照信号)的平均值，即〈A/Ac〉。对于每种血清，同种的杂合体的平均值是最大的，除了DEN4的血清之外。然而，对于每种杂合体，同种的血清的平均值一般来说不是最大的。表III.简化的MAC-ELISA中的人血清的相对信号。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在上述的表III中，第1列给出了在试验中使用的H6-ED3-PhoA杂合体。2_6列给出了每种血清和杂合体的A/Ac平均值。详情见表II说明。实施例9:使用临界信号的简化的MAC-ELISA的灵敏度和特异性表IV的第1行给出了每种血清和同种的杂合体的简化的MAC-ELISA的灵敏度。这个灵敏度对于DEN1和DEN2血清是高的，对于DEN3和YF血清是中等的，对于DEN4血清是低的。如果只限于来自于卡宴市的巴斯德研究所和对应于接种病人的四个YF血清，灵敏度会高得多(四个阳性信号)。ED3.YF-PhoA杂合体，其序列对应于YFN的疫苗菌株17D，与检测出抗野生型菌株的IgM相比，可能更好地检测出抗疫苗病毒的IgM。表IV.用于人血清的简化的MAC-ELISA的灵敏度和特异性。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在表IV中，第1行的灵敏度被定义为当用同种的H6-ED3-PhoA杂合体一起测定时给出阳性信号的血清的比例(见表II的对角线)。在第2行中的DEN血清型特异性被定义为在用同种的DEN杂合体测定时给出阳性信号的血清中，当用三个非同种的DEN杂合体测定时给出阴性信号的血清的比例。在第3行中的DEN血清型特异性被定义为在用同种的杂合体测定时给出阳性信号的血清中，当用同种DEN杂合体测定时给出的信号高于用三个非同种的DEN杂合体测定时给出的信号的血清的比例。测定第2行和第3行的DEN血清型特异性使用的是表1、第3列的血清。在第4行中的种群特异性被定义为用同种DEN杂合体测定时给出阳性信号并且用YF杂合体测定时给出阴性信号的DEN血清的比例；以及用同种的YF杂合体测定时给出阳性信号并且用所有的四个DEN杂合体测定时给出阴性信号的YF血清的比例。在第5行中的病毒特异性被定义为在用同种的杂合体测定时给出阳性信号的血清中，用同种的杂合体测定时给出的信号高于用非同种的杂合体测定时给出的信号的血清的比例。第4行和第5行的种群特异性和病毒特异性的测定使用的是表1、第4列的血清。其他详情见表II。在简化的MAC-ELISA中DEN血清型的ED3_PhoA特异性是计算为在用同种的杂合体测定时给出阳性信号(A>2Ac)的血清中，用三个非同种的杂合体测定时给出阴性信号(A<2Ac)的血清的比例。该血清型特异性对于ED3.DEN2-PhoA是高的，对于DEN3杂合体是中等的，对于DEN4杂合体是低的(表IV，第2行)。在简化的MAC-ELISA中病毒种群的ED3_PhoA杂合体的特异性一方面计算为用同种ED3.DEN-PhoA杂合体测定时给出阳性信号并且用ED3.YF-PhoA杂合体测定时给出阴性信号的DEN血清的比例；另一方面计算为用同种的ED3.YF-Ph杂合体测定时给出阳性信号并且用所有的ED3.DEN-PhoA杂合体测定时给出阴性信号的YF血清的比例。病毒种群的特异性每个都^89%，对于ED3.DENl-PhoA和ED3.DEN4-PhoA杂合体，高达100%(表IV，第4行)。实施例10:使用最大信号的简化的MAC-ELISA的特异性ED3-PhoA杂合体的这样的模结构使得在简化的MAC-ELISA中的信号强度仅仅取决于在它的ED3部分用血清的抗体之间的识别特性。这种特性使得人们能定量地比较用携带不同ED3结构域的ED3-PhoA杂合体测定时由特定的血清得到的信号。因此，发明者计算出用同种ED3-PhoA杂合体测定时给出阳性信号、以及用同种杂合体测定时给出的信号高于用非同种杂合体测定时给出的信号的血清的比例。发明者计算了四种ED3.DEN杂合体的这些比例，然后计算了五种ED3-PhoA杂合体的这些比例。用这种方式计算的四种DEN杂合体的血清型特异性，对于DEN1、DEN2和DEN3杂合体是^89%，对于DEN4杂合体是零(表IV、第3行)。计算五种杂合体的病毒特异性是^89%，除了DEN4杂合体之外(表IV、第5行)。实施例11:用简化的GAC-ELISA来检测人的血清收集被登革热病毒的三种血清型DEN1、DEN2和DEN3中的一种感染的病人的血清，并且用IgG特异性的间接ELISA和PCR标准方法来表征。间接ELISA使用感染的乳鼠大脑的提取物作为抗原，并且PCR使用对每个病毒血清型特异的引物(表I)。根据本发明通过简化的GAC-ELISA，使用三个对应的H6-ED3-PhoA杂合体按照以前所描述的方法(见实施例5)，对收集的血清进行试验。简化的GAC-ELISA的一般形式如下所示支持物-0huIgG::血清(朋-ED3-PhoA)2其中恥uIgG是抗人IgG的抗体。当血清试验的信号高于对照的信号两倍时，发明者认为它是阳性的。后者存在于实施的n次重复试验(n>3)并且不添加抗人IgG的抗体的试验中。在简化的GAC-ELISA中用同种杂合体测定时的阳性血清的比例是低的，并且最大不超过29%(表V)。表V.用于人血清的简化的GAC-ELISA的灵敏度和特异性。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在表V中，灵敏度和血清型特异性的定义如同表IV。表I中给出了人血清的数量和性质。在实施例8-11中表征的H6-ED3-PhoA使得发明者通过简化的MAC-ELISA能早期识别出登革热病毒或黄热病病毒最近的感染。除了DEN4病毒外，灵敏度以如下顺序从高到非常高DEN1>DEN2>DEN3=YF>>DEN4。这些灵敏度的差异可能归因于依照于病毒的ED3结构域的不同免疫原性水平。在这种假设下，ED3.DEN4结构域的免疫原性可能比其他三个血清型DEN1-DEN3或YFV结构域的免疫原性小。作为另一种选择，灵敏度的差异可能归因于特定的菌株、以及因此发明者用于构建重组杂合体的病毒的序列。例如，用于YFV感染的简化的MAC-ELISA可以通过任意使用两个杂合体来得到改进，一个对应于17D疫苗菌株并且另一个对应于野生型菌株。五个被检测的杂合体都有很好的病毒种群特异性，即登革热种群对比黄热病种群都高于89%。当用不同的杂合体进行定量比较相同的血清试验时，它们也都有很好的血清型特异性，除了DEN4杂合体之外都高于89%。这个结果表明，抗ED3.DEN4的抗体识别黄病毒之间共有的表位。用H6-ED3-PhoA杂合体的血清型DEN1-DEN3对人血清进行的简化的GAC-ELISA，其灵敏度低。这个结论是否是普遍的并且应当延伸至其他病毒或生物体，尚需确定。图2和4显示了用H6-ED3.DENl-PhoA杂合体对被DENV1免疫的小鼠的血清进行简化的GAC-ELISA的灵敏度。发明者也显示了对人血清进行的简化的MAC-和GAC-ELISA的信号的定量比较，并且它能区分DENV1的初次感染和继发性感染，见实施例7和图7。因此，可以在低等级的安全性实验室中制备重组的H6-ED3-PhoA杂合体。它们能早期检测黄病毒的感染，并且允许临床医生区分病毒的种群或甚至登革热病毒的血清型。参考文献Alcon，S.，Talarmin，A.，Debruyne，M.，Falconar，A.，Deubel，V.，andFlamand，M.(2002).Enzyme-linkedimmunosorbentassayspecifictoDenguevirustype1nonstructuralproteinNSlrevealscirculationoftheantigeninthebloodduringtheacutephaseofdiseaseinpatientsexperiencingprimaryorsecondaryinfections.JClinMicrobiol40,376—381.AnandaRao，R.，Swaminathan，S.，Fernando,S.，Jana，A.M.，andKhanna，N.(2005).Acustom-designedrecombinantmultiepitopeproteinasadenguediagnosticreagent.ProteinExprPurif41，136_147.Beasley，D.W.，Holbrook，M.R.，TravassosDaRosa，A.P.，Coffey，L.，Carrara，A.S.，Phillippi-Falkenstein，K.，Bohm，R.P.，Jr.，Ratterree，M.S.，Lillibridge，K.M.，Ludwig，G.V.，etal.(2004).UseofarecombinantenvelopeproteinsubunitantigenforspecificserologicaldiagnosisofWestNilevirusinfection.JClinMicrobiol42,2759-2765.Bedouelle，H.，Belkadi，L，England,P.，Guijarro，J.I.，Lisova，0.，Urvoas，A.，Del印ierre，M.，andThullier，P.(2006).Diversityandjunctionresiduesashotspotsofbindingenergyinanantibodyneutralizingthedenguevirus.FebsJ273,34-46.Bernard,P.，Gabant，P.，Bahassi，E.M.，andCouturier,M.(1994).Positive—selectionvectorsusingtheFplasmidccdBkillergene.Gene148，71—74.Blitvich，B.J.，Marlenee，N.L，Hall，R.A.，Calisher，C.H.，Bowen，R.A.，Roehrig，J.T.，Komar，N.，Langevin，S.A.，andBeaty，B.J.(2003).Epitope-blockingenzyme—linkedimmunosorbentassaysforthedetectionofserumantibodiestowestnilevirusinmultipleavianspecies.JClinMicrobiol41，1041—1047.Boulain，J.C.，andDucancel，F.(2004).ExpressionofrecombinantalkalinephosphataseconjugatesinEscherichiacoli.MethodsMolBiol267，101-112.Boulanger，R.R.，Jr.，andKantrowitz，E.R.(2003).CharacterizationofamonomericEscherichiacolialkalinephosphataseformeduponasingleaminoacidsubstitution.JBiolChem278，23497-23501.Builock,W.0.，Fernandez,J.M.，andShort,J.M.(1987).XL1-Blue:ahighefficiencyplasmidtransformingrecAEscherichiacolistrainwithbeta-galactosidaseselection.BioTechniques5，376_379.Cardosa，M.J.，Tio，P.H.，Ni,皿itya，S.，Nisalak，A.，andI皿is，B.(1992).IgMcaptureELISAfordetectionofIgMantibodiestodenguevirus-comparisonof2formatsusinghemagglutininsandcellculturederivedantigens.SoutheastAsianJTropMedPublicHealth23，726-729.Crill，W.D.，andChang，G.J.(2004).Localizationandcharacterizationofflavivirusenvelopeglycoproteincross—reactiveepitopes.JVirol78，13975-13986.Crill，W.D.，andRoehrig，J.T.(2001).MonoclonalantibodiesthatbindtodomainIIIofdenguevirusEglycoproteinarethemo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上的抗节肢介体病毒的抗体或节肢介体病毒表面分子的受体与包含融合于PhoA的节肢介体病毒表位的杂合蛋白相接触，(ii)通过测定合适的信号，例如对硝基苯酚的形成，来检测在所述抗节肢介体病毒抗体或所述受体与所述表位之间形成的复合物，(iii)加入待检测的化合物，以及(iv)通过测定合适的信号并且将获得的信号与(ii)中获得的信号相比较，检测在所述抗节肢介体病毒抗体或所述受体与所述表位之间形成的复合物的量与在步骤(ii)中检测到的复合物的量相比是否降低。全文摘要一种用于诊断或筛选节肢介体病毒感染、优选黄病毒科感染、更优选黄病毒感染的方法，在所述方法和它们的应用中使用的试剂。所述方法包括(i)将来源于受试者或动物的样品与被Ig结合蛋白敏化的固相载体相接触，此Ig结合蛋白抗所研究的受试者或动物种类的特定种类的Ig分子，以及(ii)将(i)中形成的免疫复合物与由杂合蛋白组成的检测分子一起温育，此杂合蛋白至少包含节肢介体病毒的ED3结构域和碱性磷酸酶(PhoA)，检测出所述免疫复合物就是所述样品中节肢介体病毒存在的标记。文档编号C12N15/62GK101784561SQ200880103542公开日2010年7月21日申请日期2008年6月13日优先权日2007年6月15日发明者于格·贝杜埃勒,利蒂希娅·布勒芒,埃洛蒂·布里安-利茨勒,菲利普·德普雷斯,菲利普·迪萨尔申请人:巴斯德研究所;法国国家科学研究中心