具有阿魏酸酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸的制作方法

专利名称：：具有阿魏酸酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。相关领域描述植物细胞壁多糖约构成植物细胞壁的90%，并且能分成三组纤维素，半纤维素和果胶。纤维素代表细胞壁多糖的主要成分。半纤维素是植物细胞壁第二丰富的成分。主要的半纤维素聚合物是木聚糖。植物细胞壁中发现的木聚糖的结构依赖于其来源而显著不同，但是总是包含日-1，4-连接的0-木糖骨架。0-1，4_连接的D-木糖骨架可以由各种侧链基团取代，如L-阿拉伯糖，D-半乳糖，乙酰基，阿魏酰基，对-香豆酰基和葡萄糖醛酸残基。木聚糖骨架的生物降解依赖于两类酶内切木聚糖酶和木糖苷酶。内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)将木聚糖骨架切割成更小的寡糖，其可以进一步由木糖苷酶(EC3.2.1.37)降解成木糖。其它与木聚糖降解有关的酶包括，例如，乙酰基木聚糖酯酶，阿拉伯糖酶，a“葡糖醛酸糖苷酶，阿魏酰基酯酶，和对_香豆酸酯酶。Faulds和Williamson，1991，J.Gen.Microbiol.137:2339_2345描述了来自橄榄色链霉菌(Str印tomycesolivochromogenes)的4_羟基-3-甲氧基-肉桂(阿魏酰基)酸酯酶的纯化和表征。Faulds和Williamson，1994，Microbiology140:779_787，描述了来自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶的纯化和表征。Kroon等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.23:255_262描述了由糖甜菜粕上黑曲霉生长而诱导的阿魏酸酯酶的纯化和表征。deVries等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:4638_4644公开了来自黑曲霉和塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)的阿魏酸酯酶基因。Castanares等，1992，EnzymeMicrobiol.Technol.14:875-884，描述了来自嗜松青霉(Penicillumpinophilu)的阿魏酰基/对_香豆酰基酯酶的纯化和性质。本发明涉及具有阿魏酸酯酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。发明概述本发明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%同一性；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中_高严紧条件下与以下杂交4(i)SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少75%同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。本发明还涉及编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自下组(a)编码包含氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQIDN02的成熟多肽具有至少75%同一性；(b)多核苷酸，其在至少中-高严紧条件下与以下杂交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的互补链；(c)多核苷酸，其包含与SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列具有至少75%同一性的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其编码SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，和产生具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法。本发明还涉及抑制所述具有阿魏酸酯酶活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及这种双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地dsRNA是siRNA或miRNA分子。本发明还涉及用具有阿魏酸酯酶活性的多肽降解含木聚糖材料的方法。本发明还涉及包含分离的多核苷酸的植物，所述多核苷酸编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽。本发明还涉及用于产生具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码具有阿魏酸酯酶的多肽；和(b)回收所述多肽。本发明进一步涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中将所述基因可操作地连接于编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至18或由SEQIDNO2的氨基酸1至18组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。附图简述图1显示特异腐质霉DSM1800CE1阿魏酸酯酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQIDNO1和2)。图2显示pMMar8的限制图谱。图3显示pHinsFAEBl的限制图谱。定义阿魏酸酯酶活性术语“阿魏酸酯酶活性”在本文中定义为4-羟基-3-甲氧基肉桂酉先—糖水角军Bl(4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl-sugarhydrolase)夕舌个生(EC3.1.1.73)，其催化从酯化的糖水解4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰基)基团，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酰基酯酶、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酰酯水解酶、FaeA、FaeB、cinnAE、FAE-I或FAE-II。已经报道了两种主要的阿魏酸酯酶(Cr印in等，2004，Appl.Microbiol.Biotechnol.63647-652)。A型阿魏酸酯酶从1，5_酯-连接的阿魏酰化的阿拉伯糖释放阿魏酸，并且在用木聚糖酶预处理或者将木聚糖酶与阿魏酸酯酶共温育时还能释放少量的5，5’_和8-0-4’-阿魏酸脱氢二聚体。A型阿魏酸酯酶还表现出对于底物的酚部分的优先性，所述底物包含甲氧基取代，特别是在碳3和/或5处，如在阿魏酸和芥子酸(sinapicacid)中所发生的。就针对合成底物的特异性而言，A型阿魏酸酯酶对于阿魏酸甲酯、芥子酸甲酯和对-香豆酸甲酯有活性，但是对于咖啡酸甲酯没有活性。B型阿魏酸酯酶释放与阿魏酰化阿拉伯糖残基的C-2或阿魏酰化半乳糖残基的C-6连接的阿魏酸酯，但是不能释放阿魏酸的二聚形式。B型阿魏酸酯酶对于底物的酚部分表现出优先性，所述底物包含一个或两个羟基取代，如分别在对香豆酸和咖啡酸中存在的。当存在甲氧基基团时水解速度显著降低。就针对合成底物的特异性而言，B型阿魏酸酯酶对于咖啡酸甲酯、阿魏酸甲酯和对-香豆酸甲酯有活性，但是对于芥子酸甲酯没有活性。就本发明而言，根据实施例中描述的方法确定阿魏酸甲酯活性。一个单位的阿魏酸酯酶活性等于能够在PH5，25°C每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。本发明的多肽具有SEQIDNO2的成熟多肽的阿魏酸酯酶活性的至少20%，优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少100%。CE1或CE1家族术语“CE1家族”或“CE1”在本文中定义为根据Coutinho和Henrissat,(1999)Carbohydrate-activeenzymes:anintegrateddatabaseapproach.于"RecentAdvancesinCarbohydrateBioengineering",H.J.Gilbert,G.Davies,B.Henrissat禾口B.Svensson编，TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,pp.3-12属于糖酯酶家族的多肽。含木聚糖材料术语“含木聚糖材料”在本文中定义为包含木聚糖作为组分的任何物质。木聚糖是包含0-1，4_连接木糖残基骨架的植物细胞壁多糖。4-0-甲基葡萄糖醛酸和阿拉伯糖的侧链通常以不同的量与乙酰和阿魏酰基团一起存在。木聚糖是半纤维素的主要组分。分离的多肽术语“分离的多肽”用于本文中指由来源分离的多肽。在一个优选的方面，多肽是如通过SDS-PAGE测定的，至少纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯的多肽。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%,更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%纯，最优选至少99.5%纯，并且甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过以下实现通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。成熟多肽术语“成熟多肽”在本文中定义为多肽，所述多肽以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截断、糖基化等。在一个优选的方面，根据预测SEQIDNO2的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering101-6)，成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸19至291。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有阿魏酸酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，根据预测SEQIDN0:1的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是的SEQIDNO1的核苷酸55至1054。同一性由参数“同一性”描述的两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)使用EMBOSS软件(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16276-277)的Needle程序来确定，优选3.0.0版或更高版本。使用的可选参数为缺口罚分(gappenalty)10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62取代矩阵(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity)”(使用-nobrief选项获得)的输出结果作为百分比同一性，并计算如下(相同的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)使用EMBOSS软件(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，见上文)的Needle程序来测定，优选3.0.0或更高版本。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL取代矩阵(NCBINUC4.4的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)同源序列术语“同源序列”在本文中定义为在用SEQIDNO:2的特异腐质霉阿魏酸酯酶或其成熟多肽进行的tfasty搜索(Pearson,ff.R.，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，pp.185-219)中E值(或期望值)小于0.001的预测蛋白质。多肽片段术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有阿魏酸酯酶活性。在一个优选的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少230个氨基酸残基，更优选至少245个氨基酸残基，并且最优选至少260个氨基酸残基。亚序列术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQIDNO1或其同源序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，亚序列含有SEQIDN0:1的成熟7多肽编码序列或其同源序列的至少690个核苷酸，更优选至少735个核苷酸，并且最优选至少780个核苷酸。等位变体(allelicvariant)术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。分离的多核苷酸术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，多核苷酸是如通过琼脂糖电泳测定的，至少纯，优选5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯的多核苷酸。基本上纯的多核苷酸术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%，并且甚至最优选至少99.5%纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选在本文公开的多核苷酸是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。编码序列当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组核苷酸序列。cDNA:术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。核酸构建体术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或所述核酸是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(controlsequence)术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)0修饰术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。人工变体当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有阿魏酸酯酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其同源序列的修饰的核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(humanintervention)，通过修饰公开于SEQIDNO:1或它们的同源序列的多核苷酸序列来获得。发明详述具有阿魏酸酯酶活性的多肽在第一个方面，本发明涉及包含氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO2的成熟多肽具有优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，其与SEQIDNO:2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。本发明的多肽优选包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有阿魏酸酯酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一个优选方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一个优选方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸19至291，或其等位变体；或它们的具有阿魏酸酯酶活性的片段。在另一个优选方面，多肽包含SEQIDN0:2的氨基酸19至291。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有阿魏酸酯酶活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO2的成熟多肽组成。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸19至291或其等位变体；或它们的具有阿魏酸酯酶活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQIDN0:29的氨基酸19至291组成。在第二个方面，本发明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选非常低严紧条件下，更优选低严紧条件下，更优选中严紧条件下，更优选中_高严紧条件下，甚至更优选高严紧条件下，并且最优选非常高严紧条件下，与以下杂交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述互补链是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的全长互补链。SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸长度。例如，所述核酸探针的长度可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。因而，可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQIDNO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列；包含于SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-rayfilm)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。在一个优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQIDNO:1的核苷酸55至1054。在另一个优选方面，核酸探针是编码SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQIDNO:1。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)NRRLB-50077中的质粒pHinsFAEBl中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRLB-50077中的质粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽编码序列区域。对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS,200ug/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2XSSC、0.2%SDS优选至少在45°C(非常低严紧性)，更优选至少在50°C(低严紧性)，更优选至少在55°C(中严紧性)，更优选至少在60°C(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65°C(高严紧性)，并且最优选至少在70°C(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比牛艮据Bolton禾口McCarthy计算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)得出的Tm低大约5°C至大约10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，ImM石舞酸二fil内(sodiummonobasicphosphate)，0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6XSSC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟，并用6XSSC在比计算的Tm低5°C至10°C的温度洗涤两次，每次15分钟。在第三方面，本发明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分离的多肽，其由包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%同一性的同一性程度，其编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽。参见本文的多核苷酸部分。在第四方面，本发明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的人工变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸,如多组氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或结合域(bindingdomain)。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和a-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烧羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适PH等。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，阿魏酸酯酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；fflodaver等，1992，FEBSLett.30959-64必需氨基酸的同一性也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如由Reidhaar-Olson禾口Sauer，1988，Science24153-57；Bowie禾口Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；W095/17413；或W095/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美国专利号5，223，409；W092/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽，如SEQIDNO2的氨基酸19至291的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。具有阿魏酸酯酶活性的多肽的来源本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。本发明具有阿魏酸酯酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Str印tococcus)、链霉菌12属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一个优选的方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一个优选的方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)或马链球菌兽瘟亚种(Str印tococcusequisubsp.Zooepidemicus)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一个优选的方面，所述多肽是不产色链霉菌(Str印tomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。本发明具有阿魏酸酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟赌菌属(Ceriporiopsis)、毛_壳属(Chaetomidium)、金抱子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)>M(Lentinula)>Leptospaeria>|ifM(Magnaporthe)>Melanocarpus>多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(PeniciIlium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一个优选的方面，所述多肽是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太，所述多月太具有阿魏酸酯酶活性。在另一个优选方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、Ml^^9(Aspergillusaculeatus)Λ^^ftβ(Aspergillusawamori)Λffiβ(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角质金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆抱状德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖,廉抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉红,廉抱(Fusariumroseum)、接骨木,廉抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆,廉抱(Fusariumtorulosum)、拟丝抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、白奉巴齿菌(Irpexlacteus)、米M毛毒(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、THielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱壳(THielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱壳(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱壳(Thielaviaovispora)、THielaviaperuviana、瘤抱梭抱壳(THielaviaspededonium)、^包冑(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、zhtMi包胃(Thielaviaterrestris)、@He(Trichodermaharzianum)(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一个优选方面，所述多肽是灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)或疏棉状腐质霉(Humicolalmuginosa)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一个更优选的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的特异腐质霉多肽。在一个最优选的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的特异腐质霉DSM1800多肽，例如，包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽。可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfectandimperfectstates)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的同一性。这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有阿魏酸酯酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568_76；Svetina等，2000,J.Biotechnol.76245-251；Rasmussen-Wilson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488_3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498_503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505_512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982_987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过GenenaseI切割(Carter等，1989,Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld435-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，见上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上文)。多核苷酸本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有阿魏酸酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由编码本发明具有阿魏酸酯酶活性的多肽的核苷酸序列组成。在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1或由SEQIDNO=I组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRLB-50077中所含质粒pHinsFAEBl中含有的序列，或由大肠杆菌NRRLB-50077中所含质粒pHinsFAEBl中含有的序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的成熟多肽编码序列或由SEQIDNO1的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸55至1054或由SEQIDNO1的核苷酸55至1054组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRLB-50077中所含质粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽编码序列或由大肠杆菌NRRLB-50077中所含质粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽编码序列组成。本发明还包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQIDNO1的亚序列，所述亚序列编码具有阿魏酸酯酶活性的SEQIDNO2的片段。本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQIDNO1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，或由具有至少一个突变的SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列组成，其中所述突变核苷酸序列编码SEQIDNO:2的成熟多肽。用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从腐质霉属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(speciesvariant)。本发明还涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQIDNO1的成熟多肽编码序列具有优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%同一性的同一性程度，其编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽。修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适PH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQIDNO:1的多肽编码区存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991,ProteinExpressionandPurification2一107。对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上文)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的阿魏酸酯酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物_酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，deVos等，1992，见上文；Smith等，1992，见上文；Wlodaver等，1992，见上文)。本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中等严紧条件，更优选中_高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下序列杂交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文所定义的。在一个优选的方面，互补链是SEQIDNO:1的所述成熟多肽编码序列的全长互补链。本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下方法获得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下序列杂交(i)SEQIDNO1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽。在一个优选的方面，互补链是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的全长互补链。核酸构建体本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截断的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子大肠杆菌Iac操纵子、天蓝色链霉菌(Str印tomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727_3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的启动子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican,1980,242:74_94中；禾口在Sambrook等，1989，见上文中描述。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢17曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰孢Daria(WC)00/56900)、镶片镰孢Quirm(W000/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截断的和杂合的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast8:423_488描述。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYCl)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3，末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为信号以将聚腺苷残基添加至转录的mRNA。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码区米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上文描述。在一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至18，或者由SEQIDNO:2的氨基酸1至18组成。在另一个优选方面，信号肽编码序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至54，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至54组成。调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))0前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(W095/33836)的基因获得前肽编码区。当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(nextto)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA)，或可以使用转座子(transposon)。本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脱羧酶(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase))、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水链霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10，000碱基对，优选400至10，000碱基对，并且最优选800至10，000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(r印licator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分离AMAl基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝的细胞，和由此得到多核苷酸的额外拷贝。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于多肽的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，使载体作为染色体整合体或如前所述的自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌和海洋芽孢杆菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在21另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742_751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5771—5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，FoliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞，例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞，例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.321295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-2070)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，可以使用任何已知的将DNA引入宿主细胞的方法。宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)禾口接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，见上)。在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽抱纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner，F.A.，Passmore,S.Μ.，禾口Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是YarrowiaIipolytica细胞。在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Cori0Ius)JIl球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属/嗜热霉属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B誉角质金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、|￡金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium),辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.编，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o产生方法本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是腐质霉属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是特异腐质霉。在一个最优选的方面，所述细胞是特异腐质霉DSM1800。本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，该多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzymeassay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(pr印arative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有阿魏酸酯酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(foragegrass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(calIus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质夕卜体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)禾口细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seedcoat)。同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞将编码本发明多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。表达载体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。对于组成性表达，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980,Cell21:285_294，Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675_689；Zhang等，1991,PlantCell3:1155_1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storagesinktissue)例如种子、马铃薯块莲和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolicsinktissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863_878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885_889)，来自豆球蛋白(Iegumin)B4和蚕豆(Viciafaba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708_711)、来自种子油体蛋白(oilbodyprotein)的启动子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935_941)，来自欧洲油菜(Brassicanapus)的贮藏蛋白napA启动子，或本
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公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在TO91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85_93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecularandgeneralgenetics248:668_674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573_588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金属。启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上文，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可得到的那些。将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990，Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15_38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryoniccalli)或发育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2275-281;Shimamoto,1994，CurrentOpinionBiotechnology5:158_162；Vasil等，1992，Bio/Technology10667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所描述的。转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有阿魏酸酯酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。去除或减少阿魏酸酯酶活性本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的26多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行核苷酸序列的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、0_甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(几个)核苷酸或其转录或翻译所需的调控元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。消除或减少核苷酸序列通过细胞表达的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，随后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化子。在一个特别优选的方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述核苷酸序列。或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此减少或消除翻译的蛋白质的量。本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。这样生成的多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及生产天然或异源多肽的方法，其包括(a)在有益于生产多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。在另一方面，本发明涉及通过发酵可产生本发明的多肽以及目标蛋白产物的细胞来生产基本上无阿魏酸酯酶活性的蛋白质产品的方法在发酵之前、过程中或发酵完成之后向发酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能够抑制阿魏酸酯酶活性的试剂，从发酵液中回收目标产物，并且任选地将回收的产物进行进一步纯化。在另一方面，本发明涉及如下生产基本上无阿魏酸酯酶活性的蛋白质产品的方法在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的PH和温度处理以基本上减少阿魏酸酯酶活性，和从发酵液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的PH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与阿魏酸酯酶抑制剂处理组合使用。依照本发明的这个方面，可能去除至少60%，优选至少75%，更优选至少85%，还更优选至少95%，并且最优选至少99%的阿魏酸酯酶活性。可使用此方法获得阿魏酸酯酶活性的完全去除。组合的pH和温度处理优选在2-4或9-11范围内的pH和至少60_70°C范围内的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常30至60分钟是足够的。用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。用于产生基本上无阿魏酸酯酶的产物的本发明的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(anxiolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素过氧化酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。阿魏酸酯酶缺陷细胞也可以用于表达在制药上引起兴趣的异源蛋白质如激素、生长因子、受体等。可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、PH耐受性等。在另外的方面，本发明涉及基本上无阿魏酸酯酶活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。抑制具有阿魏酸酯酶活性的多肽表达的方法本发明还涉及抑制多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包含本发明多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，dsRNA是长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更长的双链体核苷酸。dsRNA优选是小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA(SiRNA)。在另一个优选的方面，dsRNA是用于抑制翻译的微RNA(miRNA)。本发明还涉及用于抑制细胞中多肽表达的这些双链RNA(dsRNA)分子，其包含SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不受到任何特定作用机制的限制，但dsRNA能进入细胞，并引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括内源mRNA。当细胞接触dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地受到称为RNA干扰(RNAi)的过程的降解。本发明的dsRNA可以用于基因沉默疗法。在一个方面，本发明提供使用本发明的dsRNAi选择性地降解RNA的方法。所述过程可以在体外、在活体外(exvivo)或在体内进行。在一个方面，dsRNA分子能够用于产生细胞、器官或动物中的功能缺失突变(loss-of-functionmutation)。制备或使用选择性降解RNA的dsRNA分子的方法在本领域中公知，参见，例如，美国专利号6，506，559；美国专利号6，511，824；美国专利号6，515，109；和美国专利号6，489，127。组合物本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的阿魏酸酯酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichmentfactor)±曾力口。所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(ρ印tidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。可以通过例如属于以下属或种的微生物产生其它酶曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。下面给出的是本发明多肽组合物的优选的用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。用途本发明还涉及用于使用具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法。本发明的多肽能用于降解或修饰植物细胞壁或来自植物细胞壁的任何含木聚糖材料。各种用途的实例如下所述(其它用途参见，WO2002/18561)。本发明的多肽的剂量和使用该制备物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。通过完全或部分去除侧分支可以促进木聚糖的酶法降解。在降解木聚糖的过程中，本发明的多肽优选与其它木聚糖降解酶组合使用，如木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和它们的组合。例如，可以由乙酰木聚糖酯酶去除乙酰基团；由α-阿拉伯糖苷酶去除阿拉伯糖基团；由阿魏酸酯酶去除阿魏酰基，并由α-葡糖醛酸糖苷酶去除葡糖醛酸基团。由木聚糖酶，或木聚糖酶和侧分支水解酶的组合释放的寡聚物可进一步由木糖苷酶降解成游离木糖。本发明的多肽优选是组合物的组分，所述组合物包含一种或多种(几种)木聚糖降解酶，特别是木聚糖酶。在下述各种用途中，本发明的多肽优选与一种或多种(几种)木聚糖降解酶组合使用。因此，本发明还涉及用于降解含木聚糖材料的方法，其包括用这种具有阿魏酸酯酶活性的多肽处理含木聚糖材料。在一个优选的方面，进一步用木聚糖降解酶处理含木聚糖材料。木聚糖降解酶选自下组木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，和它们的组合。可以降解植物细胞以促进不同类型的处理，促进木聚糖之外的组分的纯化或提取，如从谷类纯化β_葡聚糖或β_葡聚糖寡聚体，提高饲料价值，降低水结合容量，提高废水装置中的降解能力，促进转化，例如草和玉米转化成青贮饲料，等。本发明的多肽可以用于各种植物细胞壁来源材料或废料的酶法水解，例如，来自造纸的废料，或者农业残余物如麦秸，玉米穗轴、玉米纤维、全玉米植物、干果壳、草、植物皮壳、豆荚，酒糟、糖甜菜粕等。多肽还可以用于修饰植物细胞壁来源物质的粘度。例如，多肽可以用于降低含木聚糖材料的粘度，促进粘性含木聚糖材料的加工，如在小麦分离中。本发明的多肽还与有限活性的其它木聚糖分解酶一起使用以降解木聚糖，产生寡糖。寡糖可用作膨胀剂，如从谷类细胞壁物质释放的阿拉伯木聚糖寡糖，或者来自谷类的或多或少经过纯化的阿拉伯木聚糖。本发明的多肽还可以与其它木聚糖分解酶组合使用，以将木聚糖降解成木糖和其它单糖(美国专利5，658，765)。释放的木糖可以转化成其它化合物。本发明的多肽还可以用于木质纤维素生物质降解或转化成可发酵糖中，以产生，例如，燃料、饮用乙醇和/或发酵产品(例如，酸、醇、酮、气体等)。多肽优选与其它木聚糖降解酶和纤维素酶组合物(内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)组合使用。本发明的多肽可以与其它酶如葡聚糖酶一起使用，以促进从富含油的植物物质提取油，如从玉米胚提取玉米油。本发明的多肽还可以在烘培中使用，以提高面团的发面、弹性和/或稳定性和/或烘培产品的体积、团粒结构和/或保鲜性质。多肽可以用于制备面团或者从任何类型的面粉或粉(例如，基于小麦、黑麦、大麦、燕麦或玉蜀黍)制备的烘培产品。用本发明的多肽制备的烘培产品包括面包、面包卷、小艇馅饼(baquettes)等。为了烘培，本发明的多肽可以用作唯一或主要酶活性，或者可以与其它酶如木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，过氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶组合使用。本发明的多肽还可以用于动物饲料的修饰，并且可以在体外(通过修饰饲料的组分)或体内发挥作用。可以向包含大量阿拉伯木聚糖和葡糖醛酸木聚糖的动物饲料组合物中加入多肽，例如，包含谷类如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉蜀黍的饲料。在加入饲料时，多肽将促进植物细胞壁材料的体内分解，一部分是由于肠粘度下降(Bedford等，1993，Proceedingsofthe1stSymposiumonEnzymesinAnimalNutrition，pp.73—77)，从30而实现动物对植物营养成分的利用得到改善。因此，动物的生长速率和/或饲料转化比例(即，消化的饲料的重量相对于增重的比例)提高。本发明的多肽还可以用于纸和纸浆工业，尤其是在漂白过程中用于增加漂白纸浆的亮度，从而降低漂白阶段使用的氯的量，并增加循环纸过程中纸浆的游离度(Eriksson，1990,WoodScienceandTechnology24:79_101；Paice等，1988,Biotechnol.andBioeng.32:235-239，和Pommier等，1989，TappiJournal187-191)。此外，多肽可以用于含木质纤维素纸浆的处理，从而提高其漂白能力。木质纤维素纸浆的处理可以，例如，如美国专利No.5，658，765、WO93/08275、WO91/02839和W92/03608中所述进行。本发明的多肽还可以用于啤酒酿造中，特别是可增加包含，例如，大麦和/或高粱麦芽的麦芽汁的过滤能力(W02002/24926)。多肽可以以与常规用于酿造的戊聚糖酶相同的方式使用，例如，如ViStor等，1993，J.Inst.Brew.99:243_248和EP227159所述。此外，多肽可以用于处理酿酒酒糟，即，啤酒麦芽汁生产的残余物，其中包含大麦或发芽大麦或其它谷类，从而促进残余物的利用，例如，用作动物饲料。本发明的多肽可以用于分离植物细胞壁材料的组分，特别是谷物组分如小麦组分。特别关注的是将小麦分离成谷蛋白/面筋(gluten)和淀粉，即，具有可观商业利益的组分。所述分离工艺可通过使用本领域已知方法进行，方便地为作为水力旋流(hydroclone)或倾析工艺进行的所谓打糊(batter)工艺(或湿磨工艺)。在所述打糊工艺中，起始材料为待进行分离的植物材料(如小麦)的稀释的可泵送的分散液。在小麦分离工艺中，所述分散液通常由小麦粉与水制得。本发明的多肽还可以用于制备水果或蔬菜汁以增加产量。本发明的多肽还可以用作用于纺织品的酶法煮炼(scouring)系统的组分。本发明的多肽还可以与其它酶功能组合用于洗衣洗涤剂应用。信号月太本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，该基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至18或由SEQIDNO2的氨基酸1至18组成，其中所述基因对于核苷酸序列是外源的。在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至54，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至54组成。本发明还涉及包含这种核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，包括(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这样的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包含组合以形成编码产物的两种或两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含部分或全部多肽序列的组合，所述多肽序列从至少两种不同的蛋白质获得，其中一个或多个(几个)对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程的变异。优选蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。在一个更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在一个甚至更优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。实施例材料作为缓冲液和底物使用的化学品是至少试剂等级的商业产品。菌株将特异腐质霉DSM1800用作编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽的家族CEl基因的来源。黑曲霉MBinl20菌株(W02004/090155)用于表达编码具有阿魏酸酯酶活性的多肽的特异腐质霉基因。培养基PDA平板由每升39g马铃薯右旋糖琼脂组成。YP培养基由每升IOg酵母提取物和20g细菌用蛋白胨组成。COVEA脲-乙酰胺+平板由每升20mlCOVEA盐溶液，220g山梨醇，IOg葡萄糖，IOmlIM乙酰胺和30g细菌用琼脂；pH5.2组成。COVEA盐溶液由每升26gKCl、26gMgSO4、76gKH2PO4和50mlCOVEA痕量元素溶液组成。Cove痕量元素溶液由每升0.04gNa2B4O7·10Η20、0·4gCuSO4·5Η20、1·2gFeSO4·7Η20、0·7gMnSO4·H20,0.8gNa2MoO2·2H20和IOgZnSO4·7H20组成。M410培养基由每升50g麦芽糖，50g葡萄糖，2gMgSO4·7H20，2gKH2PO4,4g柠檬酸酐粉末，8g酵母提取物，2g脲，0.5gAMG痕量金属溶液，和0.5gCaCl2；pH6.0组成。AMG痕量金属溶液由每升14.3gZnSO4·7Η20，2·5gCuSO4·5Η20，0·5gNiCl2·6Η20，13.8gFeSO4·7Η20，8·5gMnSO4·7Η20，和3g柠檬酸组成。LB培养基由每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠组成。实施例1特异腐质霉阿魏酸酯酶的鉴定N-末端蛋白质测序。根据制造商建议的条件，在CRITERI0N8_16%Tris-HClSDS-PAGE凝胶(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)上分离包含推定的酯酶的20μ1ULTRAFL0L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)。使用PRECISIONPLUSPROTEIN标准品(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)作为分子量标记物。在配备有Trans-Blot转化池的CRITERION凝胶设备(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)上，以100伏特，使用10%甲醇，pH11.0中的10MCAPS(3-[环己基氨基]-1-丙烷磺酸)，历时2小时，将蛋白质样品从SDS-PAGE凝胶电印迹在PVDF膜(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上。用40%甲醇/1%乙酸中的0.1%考马斯蓝R-250将膜染色20秒钟，并在50%甲醇中脱色以观察蛋白质条带。切下30kDa的蛋白质条带并测序。根据制造商建议的规程，使用具有在线毛细管HPLC和液相三氟乙酸(TFA)传递的PROCISE494蛋白质测序仪(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)进行肽和蛋白质的N-末端测序。通过在线毛细管HPLC，用在450ml的溶剂A3和B2(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)中的9ml包含乙酸、乙酸钠和己烷磺酸钠的PREMIX浓缩物(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)完成乙内酰苯硫脲-氨基酸的检测，其中溶剂A3包含在水中的3.5%四氢呋喃，而溶剂B2包含乙腈/2-丙醇。用AppliedBiosystems610数据分析软件2.Ia版(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)，用MACINTOSHG4处理器收集并分析数据。通过在光源下显示层析图而进行序列测定。N-末端确定为Ala-Ser-Leu-Gln-Gln-Val-Trp-Asn-Trp-Gly-Ala-Asn-Pro(SEQIDNO2的氨基酸19至31)。ULTRAFL0L的蛋白质分级。首先使用HIPREP26/10脱盐柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ,USA)，将ULTRAFL0L的2ml等分试样缓冲液交换入含150mM氯化钠的20mM乙酸钠pH5中。然后使用以具有3，000道尔顿分子量截留膜的VIVASPIN20离心柱(VivascienceAG,Hannover,Germany)的超滤，将得到的缓冲液交换的物质(18.5ml)浓缩至3ml。然后在HIL0AD26/60SUPERDEX200制备级大小排阻柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上通过大小排阻层析，用相同的缓冲液等度洗脱来分级经过缓冲液交换和浓缩的ULTRAFL0L材料的2ml等分试样。将在280nm显示出UV吸光度的级分合并成来自不同洗脱时间的六个单独的汇集物，每个汇集物的总体积为20-40ml。使用以具有3，000道尔顿分子量截留膜VIVASPIN20离心柱超滤，将汇集的级分浓缩至l_5ml。根据制造商建议的条件，在CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝胶上分离每个浓缩的汇集级分的20μ1。使用PRECISIONPLUSPROTEIN标准品作为分子量标记物。从盒中去除凝胶，并用考马斯蓝(G250)蛋白质染料(BIO-SAFECoomassieStain,Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules，CA，USA)染色，并且用剃刀刀片切下可见条带，用于蛋白质鉴定分析。用于肽测序的多肽凝胶内消化。使用MULTIPROBEIILiquidHandlingRobot液体操作机器人(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA,USA)进行凝胶内消化。在IOOmM碳酸氢铵pH8.0中用50μ1IOmM二硫苏糖醇(DTT)还原30kDa蛋白质凝胶条带30分钟。还原后，在IOOmM碳酸氢铵pH8.0中用50μ155mM碘乙酰胺将凝胶块烷基化20分钟。使干燥的疑胶块在室温在25μ1胰蛋白酶消化溶液中膨胀30分钟，所述溶液包含6ng测序级胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)每μ50mM碳酸氢铵pH8，然后在40°C消化8小时。上述每个反应步骤之后都用合适的溶液按照制造商的标准规程，进行多次洗涤和预洗涤。使用50μ1乙腈在反应之间使凝胶块脱水，并且在各步骤之间将凝胶块风干。用甲酸/2%乙腈在HPLC级水中两次提取肽30分钟。将肽提取溶液转移至96孔有边的PCR型板(ABGene,Rochester,NY,USA)，其已经冷却至10_15°C，并用96孔板盖(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA,USA)覆盖以防止蒸发。进一步在4°C保存板直至可进行质谱分析。蛋白质鉴定。对于串联质谱进行的从头肽测序，使用Q-T0FMICR0(WatersMicromassMSTechnologies,Milford,MA,USA)，一种混合的正交四柱时间飞行质谱仪进行LC/MS/MS分析。Q-T0FMICR0可以使用MASSLYNX软件4.1版完全由微处理器控制(WatersMicromassMSTechnologies，Milford，MA，USA)。Q-T0FMICR0配备有ULTIMATE毛细管和纳米流HPLC系统，其与FAM0S微型自动取样器和SWITCHOSII柱切换设备(LCPackings/Dionex,Sunnyvale,CA,USA)偶联，用于浓缩和使样品脱盐。将样品载入到配置在进样环中的保护柱(300μmIDX5cm,PEPMAPC18)，并使用SwitchosII泵以0.1%甲酸水溶液以40μ1每分钟洗涤2分钟。在75μπιIDX15cm，C18,3μm,IOOA,PEPMAP纳米流融合毛细管柱(LCPackings,SanFrancisco,CA,USA)上，使用NAN-75校准器(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)以来自175μ1/分钟的分流的175nl/分钟的流速分离肽。在45分钟的间隔中应用0.甲酸中的5%至80%乙腈的分步洗脱梯度。在215nm监测柱洗脱液，并通过配有纳米喷雾界面的电子喷雾离子源将洗脱液导入Q-TOFMICRO中。以探测扫描模式获取数据，m/z的质量范围为400-1990，将针对MS的标准切换至MS/MS以包括高于10.0次计数每秒的离子强度，并且电荷状态为+2、+3和+4。可以1.9秒的扫描时间和0.1秒的扫描间隔时间获得多达4种共洗脱物质的分析光谱。通常使用45伏特的锥孔电压，并且对碰撞能量编程以根据洗脱肽的质量和电荷状态而变化，并且在10-60伏特的范围内。合并获取的光谱，平滑处理，并以自动的方式放在中央，并产生峰列表。使用PR0TEINLYNX全局服务器2.2.05软件(WatersMicromassMSTechnologies,Milford,MA,USA)和PEAKSStudio4.5版(SPl)(BioinformaticSolutionsInc.，Waterloo,Ontario,Canada)针对所选数据库搜索峰列表。评价来自PR0TEINLYNX和PEAKSStudio搜索的结果，并进一步通过评价每个目的离子的MS/MS光谱而分析未鉴定蛋白质，并且通过鉴定y和b离子系列和将质量差异与合适的氨基酸相匹配来确定从头序列。从凝胶内消化的30kDa多肽凝胶条带的几个多电荷离子获得肽序列。将514.772m/z序列的二电荷胰蛋白酶肽确定为Asn-Ser-Tyr-Pro-Gly-Tyr-[Asp/Asn]-Gly-Arg(SEQIDNO:2的氨基酸195至203)。将516.33lm/z序列的三电荷胰蛋白酶肽离子确定为[Ile/Leu]-Gly-His-Ala-Pro-Ala-Val-Asp-Glu-[Gln/Lys]-[Gln/Lys]-Leu-Leu-Arg(SEQIDNO2的氨基酸269至282)。将516.33lm/z序列的另一个三电荷胰蛋白酶肽离子确定为Met-[Gln/Lys]-[Ile/Leu]-Val-His-Gly-[Ile/Leu]-[Gln/Lys]-Asp-Phe-[Ile/Leu]-Val-Arg(SEQIDNO2的氨基酸207至219)。将540.305m/z序列的二电荷胰蛋白酶肽离子确定为Pro-[Gln/Lys]-Cys(a)-Gly-Tyr-Glu-Ala-Leu-Lys(SEQIDNO2的氨基酸220至228)。Cys(a)是半胱氨酸丙烯酰胺，来自SDS-PAGE的人工产物。[Ile/Leu]和[Gln/Lys]不能区分，因为它们的质量相当。实施例2特异腐质霉DSM1800基因组DNA提取特异腐质霉DSM1800在45°C在PDA平板上生长至汇合(confluence)。从PDA平板切下4mm2方块，接种到包含25mlYP培养基的带挡板125ml摇瓶中，所述培养基包含2%葡萄糖，并在41°C在200rpm振荡温育2天。使用MIRACLOTH(Calbiochem,LaJolla,CA,USA)通过过滤富集菌丝，在去离子水中洗涤两次，并在液氮下冷冻。用研钵和杵，将冷冻菌丝磨成细粉，并使用DNEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)分离总DNA。实施例3从特异腐质霉DSM1800分离阿魏酸酯酶基因的部分片段使用共有-简并杂合寡核苷酸引物程序(C0DEH0P；Rose等，1998，NucleicAcidsResearch26:1628_1635)，根据实施例1中所述的已鉴定肽片段，设计如下所示的简并引34物，其具有与相关的阿魏酸酯酶序列同源的区域。弓丨物FAEsenseF5'-CARCARGTNTGGAAYTGGGGNGC-3‘(SEQIDNO3)简并引物FAEsensF的蛋白质翻译QQVffNWG引物HiFAE-degR5'-GGCGGCGGCCGTCRTANCCNGGRTA-3‘(SEQIDNO4)简并引物HiFAE-degR的蛋白质翻译YPGYDGRR为了获得特异腐质霉阿魏酸酯酶基因的初始DNA片段，在40°C-60°C中的六个不同退火温度进行梯度PCR。扩增反应物(25μ1)包括作为模板的80ng特异腐质霉DSM1800基因组DNA,dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,引物FAEsenseF和引物HiFAE-degR#50pmol,IXADVANTAGEGC-MeltLA(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)，和1.25单位ADVANTAGEGC基因组聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.，Westbury，NY,USA)进行扩增，程序为在95°C预变性1分钟；30个循环，每个循环为95°C变性30秒，50°C+/_10°C退火30秒(6个梯度选择)并在72°C延长1分钟；并在72°C最终延长6分钟。在TBE(10.8gTris碱，5.5g硼酸和4ml0.5MEDTApH8.0每升)缓冲液中，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物。从凝胶切除来自56°C退火温度的约700bp的PCR产物条带，根据制造商的说明，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)纯化，并使用染料-终止子化学(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods3847-60)和引物步移，用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自动化DNA测序仪(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,Inc.，FosterCity,CA,USA)测序。获得部分序列，其编码实施例1中鉴定的肽片段，并用于设计简并引物。实施例4全长特异腐质霉阿魏酸酯酶基因的鉴定根据制造商的说明，使用GEN0MEWALKER通用试剂盒(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)鉴定来自特异腐质霉DSM1800的全长阿魏酸酯酶基因。简而言之，分别用四种可留下平末端的不同的限制性酶(DraI，EcoRV,PvuII和StuI)消化来自特异腐质霉DSM1800的总基因组DNA。然后分别将每批消化的基因组DNA与GEN0MEWALKER衔接头(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)连接以产生四个文库。然后将这四个文库作为PCR反应中的模板，使用如下所示的基因特异性引物，其中两个用于编码阿魏酸酯酶的N-末端的5’末端片段上游的一级和二级PCR扩增，另两个用于编码阿魏酸酯酶的C-末端的3’末端片段下游的一级和二级PCR扩增。根据从如实施例3中所述获得的特异腐质霉的部分阿魏酸酯酶基因序列，设计下述引物。N-末端引物Hins_FAE_GSPl_Rl(—级)5'-CATGGCATGGCGAGCAGGGCATTGCTT-3‘(SEQIDNO5)引物Hins_FAE_GSP2_Rl(二级)5'-GCGGTCCGGCACATAGATGTGGAACTG-3‘(SEQIDNO6)35C-末端引物Hins_FAE_GSPl_Fl(—级)5'-GGAGCCATTCTTCGGCGGGATATTGGG-3‘(SEQIDNO7)引物Hins_FAE_GSP2_Fl(二级)5'-TATCAAATCATGCGGCGCGACTAACCG-3‘(SEQIDNO8)一级扩增物在25μ1终体积中包括作为模板的1μ1(约6ng)各个文库，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,IOpmol衔接头引物(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA),50pmol弓丨物Hins_FAE_GSPl_Rl或Hins_FAE_GSPl_Fl，IXADVANTAGEGC-MeltLA缓冲液(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)，和1.25单位ADVANTAGE,GC基因组聚合酶混合物。使用EPPEND0RFMASTERCYCLER5333进行N-末端扩增，程序为在95°C预变性1分钟；7个循环，每个循环为95°C变性25秒；在72°C退火并延伸5分钟；和32个循环，每个循环为95°C变性25秒；在67°C退火并延伸5分钟；和在67°C最终延伸7分钟。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333进行C-末端扩增，程序为在95°C预变性1分钟；5个循环，每个循环为在95°C变性25秒；在72°C退火并延伸5分钟；和7个循环，每个循环为在95°C变性25秒；在72°C退火并延伸5分钟；和32个循环，每个循环为在95°C变性25秒；在67°C退火并延伸5分钟；和在67°C最终延伸7分钟。二级扩增物在25μ1终体积中包括作为模板的1μ1各个一级PCR产物，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,IOpmol衔接头引物2(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA),50pmol引物Hins_FAE_GSP2_Rl或Hins_FAE_GSP2_Fl，IXADVANTAGEGC-MeltLA缓冲液(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)，和1.25单位ADVANTAGEGC基因组聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER.5333进行扩增，程序为在95°C预变性1分钟；5个循环，每个循环为在95°C变性25秒；在72°C退火并延伸5分钟；和20个循环，每个循环为在95°C变性25秒；在67°C退火并延伸5分钟；和在67°C最终延伸7分钟。在TBE缓冲液中通过1.O%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物。由5’末端PCR扩增，分析3个产物条带来自DraI文库的600bp产物条带，来自EcoRV文库的Ikb产物条带，和来自PvuII文库的2.5kb产物条带。从凝胶切除这3个产物条带，根据制造商的说明，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒纯化，并测序。由3’末端PCR扩增，分析3个产物条带来自EcoRV文库的650bp产物条带，来自PvuII文库的400bp产物条带，和来自StuI文库的1.3kb产物条带。从凝胶切除这3个产物条带，根据制造商的说明，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒纯化，并测序。使用染料-终止子化学(Giesecke等，1992，见上文)和引物步移策略，用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自动化DNA测序仪进行PCR片段的DNA测序。使用衔接头引物2、引物Hins_FAE_GSP2_Rl，引物Hins_FAE_GSP2_Fl，和引物SeqFAENtermanti(如下所示)测序。弓丨物SeqFAENtermanti5'-GCTTTACTGCCATCGCAGGGCATTCCA-3‘(SEQIDNO9)审核核苷酸序列数据的质量，并在PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)的协助下将所有序列互相比较。将PCR片段序列结果与如实施例3中所述获得的特异腐质霉的部分阿魏酸酯酶基因序列比较并比对。根据本实施例和实施例3中获得的基因片段构建基因模型，允许用其它同源阿魏酸酯酶确定基因的5’和3’末端。实施例5克隆特异腐质霉阿魏酸酯酶基因并构建黑曲霉表达载体设计如下所示的两个合成寡核苷酸引物以从实施例2中制备的基因组DNAPCR扩增特异腐质霉阿魏酸酯酶基因。使用InFusion克隆试剂盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)将片段直接克隆入表达载体pBM120a(W02006/078256)。HinsFAEBDsenseNCO5'-ACACAACTGGCCATGCGTTTCTCGACCATCCTCTCG-3'(SEQIDNO10)HinsFAEBInfantiPAC5'-CAGTCACCTCTAGTTATTAGATAAGCCTGAAGAACC-3'(SEQIDNO11)黑体字代表编码序列。其余序列与pBM120a的插入位点同源。在PCR反应物中各使用五十皮摩尔上述引物，所述PCR反应物在25μ1终体积中包括80ng特异腐质霉基因组DNA，IXADVANTAGEGC-MeltLA缓冲液，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,和1.25单位ADVANTAGEGC基因组聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER.5333进行扩增，程序为在94°C1分钟的1个循环；30个循环，每个循环为在94°C30秒，58°C30秒，和70°C90秒；和在70°C最终延伸5分钟。然后加热块进入4°C浸泡循环。在TBE缓冲液中通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切除约1.0-1.Ikb的产物条带，并且根据制造商的说明，使用QIAQUICK.凝胶提取试剂盒纯化。用NcoI和PacI消化质粒pBM120a，在TBE缓冲液中通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并根据制造商的说明，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒纯化。使用InFusion克隆试剂盒将基因片段和消化载体连接在一起，得到pMMarS(图2)，其中阿魏酸酯酶基因在黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶(NA2_tpi启动子)的启动子杂合体的控制下转录。连接反应物(20μ1)包括1XInFusion缓冲液(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，1μ1InFusion酶(110稀释)(BDBiosciences,PaloAlto，CA，USA)，106ng用NcoI和PacI消化的pBM120a，和96ng纯化的特异腐质霉PCR产物。在室温温育反应物30分钟。根据制造商的说明，使用两微升反应物转化大肠杆菌XLlOS0L0PACK.Gold超感受态细胞(stratagene,LaJolla,CA,USA)。通过限制性消化检测包含pMMar8的大肠杆菌转化体，并使用BI0R0B0T9600(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)制备质粒DNA。使用染料-终止子化学(Giesecke等，1992，见上文)和引物步移策略，通过用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自动化DNA测序仪测序而确认pMMar8中的特异腐质霉阿魏酸酯酶基因插入。使用如下所示的引物996271Na2tpi正向启动子和引物996270AMG反向测序996271Na2tpi正向启动子5'-ACTCAATTTACCTCTATCCACACTT-3‘(SEQ.IDNO12)996270AMG反向5'-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3‘(SEQ.IDNO13)将包含pMMar8的克隆挑进补加100μg氨苄青霉素每ml的2X50mlLB培养基中，并在37°C在200rpm振荡在250ml玻璃烧杯中过夜生长。按照制造商的说明，使用QIAGEN小型试剂盒分离质粒pMMar8。用PmeI消化质粒pMMar8，在TBE缓冲液中用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并根据制造商的说明，在制备中使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒纯化包含阿魏酸酯酶基因的片段，用于转化黑曲霉Mbinl20原生质体。使用Τ0Ρ0TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将相同的1.0-1.IkbPCR片段克隆进pCR2.l-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)以产生pHinsFAEBl(图3)。通过DNA测序确认pHinsFAEBl中的特异腐质霉阿魏酸酯酶插入。于2007年11月20日将大肠杆菌pHinsFAEBl保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心，北区研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)。实施例6编码CEl家族阿魏酸酯酶的特异腐质霉基因组序列的表征审核核苷酸序列数据(实施例5)的质量，并在PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington,Seattle,WA，USA)的协助下将所有序列互相比较。核苷酸序列(SEQIDNO1)和推定的氨基酸序列(SEQIDNO2)如图1所示。基因组片段编码291个氨基酸的多肽，中间插入2个预测的内含子，分别为73和108个碱基对。全长编码序列和成熟编码序列的％G+C含量分别为62.9%和62.5%。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1-6)预测信号肽为18个残基。预测的成熟蛋白质包含273个氨基酸，分子量为31.9kDa。预测的多聚羟基丁酸解聚酶结合域出现在氨基酸36至248。基于推定的氨基酸序列，根据Coutinho和Henrissat，1999，见上文，阿魏酸酯酶落入糖酯酶家族CE1。使用如在EMBOSS的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)及缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EBL0SUM62矩阵来确定氨基酸序列的比较配对全局比对。比对显示，特异腐质霉家族CEl阿魏酸酯酶基因的成熟多肽的推定氨基酸序列与粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶B(UniProt登录号Q9HGR3)的推定氨基酸序列具有68.3%的同一性(缺口除外)。实施例7黑曲霉MBinl20中特异腐质霉家族CEl阿魏酸酯酶的转化和表达在黑曲霉MBinl20中表达特异腐质霉CEl家族阿魏酸酯酶基因。根据Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419_1422的方法制备黑曲霉MBinl20原生质体。使用三微克PmeI消化的pMMar8转化黑曲霉MBinl20。用由PmeI消化的pMMar8转化黑曲霉MBinl20得到13个转化体。将这些转化体分离到各个COVEA脲-乙酰胺+平板。从13个转化体的汇合COVEA脲-乙酰胺+平板剪切两个3mm2琼脂块，并单独接种到125ml塑料摇瓶中的25mlM410培养基中，并在34°C在250rpm振荡温育。温育5天后，根据制造商的说明，在CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝胶上用CRITERION细胞(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)分析各个培养物的6μ1上清。用ΒΙΟ-SAFE考马斯染料将得到的凝胶染色。培养物的SDS-PAGE谱显示，3个转化体具有约30kDa的条带。进行第二次转化得到另外15个转化体。通过相同的过程分析这些转化体，并且，一个转化体，即黑曲霉MMar206，显示约30kDa的家族CEl阿魏酸酯酶基因的表达。黑曲霉MMar206在COVEA脲-乙酰胺+平板上在34°C生长至汇合。将五个3mm2琼脂块放在2.8升摇瓶中的包含2%葡萄糖的4X500mlYP中，在34°C以250rpm振荡生长，并在4天后收获。在3000Xg离心全部培养液以去除生物质。将上清无菌过滤并在5至10°C保存。实施例8特异腐质霉家族CEl阿魏酸酯酶(FAEB)的纯化首先将在黑曲霉MBinl20宿主中表达重组特异腐质霉阿魏酸酯酶的摇瓶培养液上清(实施例7)缓冲液交换入20mMTris-HClpH8中，并使用PallFiltron切线流过滤系统浓缩，所述系统包括UltrapumpII，ULTRARESERVOIR5L，和截留分子量为5000Da的ULTRASETTE5KOmega切线流滤膜(PallCorporation,EastHills，NY，USA)。然后使用以20mMTris-HClpH8平衡的20mlMEPHYPERCEL树脂(PallCorporation,EastHills,NY,USA)通过用IOOmM乙酸钠pH4.5洗脱来纯化所得的缓冲液交换材料(129ml)。收集用IOOmM乙酸钠pH4.5洗脱的级分，并汇集在280nm有UV吸光度的级分(45ml)。然后根据制造商建议的条件，使用CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝胶分离7.5μ1汇集的部分。使用PRECISIONPLUSI3ROTEINtm标准品作为分子量标记物。用INSTANTBLUE考马斯蓝蛋白质染料(ExpedeonProteinSolutions,Cambridge,UK)将凝胶染色。在28kDa和30kDa可见两条条带，对应于纯化的特异腐质霉阿魏酸酯酶蛋白质。根据制造商建议的条件，用PNGaseF(NewEnglandBiolabs,Ipswich,ΜΑ,USA)将特异腐质霉阿魏酸酯酶的3μ1等分试样去糖基化。根据制造商建议的条件，使用CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝胶分离得到的材料和对照，对照中用水代替PNGaseF。使用PRECISIONPLUSPROTEIN标准品作为分子量标记物。用考马斯蓝G250蛋白质染料将凝胶染色。对照显示28kDa和30kDa的条带，而用PNGaseF去糖基化的样品表现出27kDa的单条带。还使用对硝基苯基阿魏酸(InstituteofChemistry,SlovakAcademyofSciences,Bratislava,Slovakia)作为底物，测试了包含纯化的特异腐质霉阿魏酸酯酶蛋白的合并级分的酶活性。在96孔COSTAR微量滴定板(ComingInc.，Corning,NY,USA)中进行活性实验。首先在DMSO中制备IOOmM对硝基苯基阿魏酸溶液，然后在包含0.01%TWEEN20的50mM乙酸钠pH5.0中稀释至ImM悬浮液。然后通过向ImM对硝基苯基阿魏酸悬浮液加入纯化的特异腐质霉阿魏酸酯酶材料的等分试样，使最终的底物浓度为0.5mM对硝基酚阿魏酸酯酶，启动酶反应。允许反应在25°C继续进行30分钟，此时加入IMTris-HClpH8.0，并且使用SPECTRAMAX340PC读板仪(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA),通过405nm吸光度的增加确定释放的对硝基酚盐阴离子的量，所述读板仪修正了不溶底物材料在540nm的背景吸光度。使用微板BCA蛋白质实验试剂盒确定纯化的特异腐质霉阿魏酸酯酶的蛋白浓度。一个单位的阿魏酸酯酶活性定义为在PH5，25°C能每分钟释放1微摩尔对硝基酚盐阴离子的酶量。测定特异腐质霉阿魏酸酯酶的活性为5.8单位每mg纯化蛋白。实施例9特异腐质霉阿魏酸酯酶的底物特异性如实施例8中所述的特异腐质霉阿魏酸酯酶分别与四种甲酯底物中的每一种一起温育，所述底物包括4_羟基肉桂酸甲酯(对-香豆酸甲酯)，3，4_二羟基肉桂酸甲酯(咖啡酸甲酯)，4-羟基-3-甲氧基肉桂酸甲酯(阿魏酸甲酯)，和3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸甲酯(芥子酸甲酯)(ApinChemicalsLTD，Abingdon，Oxon，UK)。反应物(270μ1)包括250或265μ120mMMESpH6;20或5μ1纯化的特异腐质霉阿魏酸酯酶；和Img甲酯39底物。在环境条件(25°C)下在暗处温育反应物22.5小时。温育后，通过薄层层析评价反应物的酯水解。使用2.5x7.5cm硅胶60F254平板，250μm厚(EMDChemicals,Darmstadt,Germany)通过在平板上印迹1μ1，用11乙酸乙酯庚烷加冰醋酸(1滴/4ml)，并用MINERALIGHT灯(UVPInc.，SanGabriel,CA,USA)在254nm的紫外光下使其可见，由此进行薄层层析。根据在254nm的紫外光下酸水解产物与四种底物的真正标准品和相应的酸产物(全部获得自Apin，如所述，4-羟基-3-甲氧基肉桂酸除外，其获得自Sigma-Aldrich，SaintLouis,MO,USA)相比的相对可观察点强度，通过出现相应的酸水解产物定量评价酯水解。当实验中特异腐质霉阿魏酸酯酶的蛋白浓度为0.14mg蛋白质每ml时，对于4_羟基肉桂酸甲酯、3，4_二羟基肉桂酸甲酯和4-羟基-3-甲氧基肉桂酸甲酯，清楚观察到酯水解。对于3，5_二甲氧基-4-羟基肉桂酸甲酯，观察到少量水解。当实验中特异腐质霉阿魏酸酯酶的蛋白浓度为0.035mg蛋白质每ml时，对于4-羟基肉桂酸甲酯、3，4_二羟基肉桂酸甲酯和4-羟基-3-甲氧基肉桂酸甲酯，清楚观察到酯水解。对于3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸甲酯，在更低的酶加载量未观察到酯水解。结果表明阿魏酸酯酶具有水解所选择的肉桂酸衍生物的甲酯的能力，所述甲酯包括阿魏酸甲酯和相关化合物。实施例10特异腐质霉阿魏酸酯酶对于预处理的玉米纤维水解的作用评价了特异腐质霉阿魏酸酯酶对于预处理的玉米纤维水解的效果。玉米纤维是玉米粒湿磨产生的部分。玉米纤维是在去除淀粉和进一步处理之后留下的种皮和残余胚。通过在140°C高压灭菌150分钟而预处理玉米纤维。使用下述方法，将底物中阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的量确定为175、317和261g每kg干物质。使用稀盐酸通过糖水解确定阿拉伯糖和木糖。将预处理的玉米纤维转移至125ml锥形烧瓶并稀释以包含约10%干物质。在油浴中在100°C预处理玉米纤维样品。通过在100°C加入5ml2M盐酸2小时而开始水解。温育后，将摇瓶在冰上冷却，并用4M氢氧化钠中和。用MINISART10.2微米注射器式滤器(SartoriusAG,Goettingen,Germany)过滤样品，并在DIONEXBIOLC系统(DionexCorporation，Sunnyvale，CA，USA)上分析阿拉伯糖和木糖。通过将玉米纤维的预处理样品进行两部硫酸水解而确定葡萄糖。向压力管(AceGlass,Inc.，Vineland，NJ,USA)中约300mg干燥的玉米纤维加入3ml72%硫酸。混合样品并在30°C水浴60分钟。每隔5至10分钟搅拌样品。60分钟后，去除样品并加入84ml去离子水。将样品放在高压灭菌器中并在121°C加热1小时。冷却后，过滤样品以去除残余固体，并通过加入碳酸钙而中和。根据下述方法，用DIONEXBIOLC系统确定葡萄糖浓度。将样品(10μ1)载入如配备有与CARB0PACPAl保护柱(4x50mm)(DionexCorporation,Sunnyvale,CA,USA)组合的DIONEXCARB0PACPAl分析柱(4x250mm)的DIONEXBIOLC系统上。用IOmM氢氧化钾以Iml每分钟的流速等度分离单糖，并由脉冲电化学检测器以脉冲安培检测模式检测。电极电势程序为+0.1伏(t=0-0.4秒)至-2.0伏(t=0.41-0.42秒)至0.6伏(t=0.43秒)和最后-0.1伏(t=0.44-0.50秒)，同时从t=0.2-0.4秒将得到的信号积分。使用阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的混合物(各成分浓度0.0050-0.075g每升)为标准品。用里氏木霉纤维素分解蛋白组合物(里氏木霉培养液，包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热霉GH61多肽和米曲霉β-葡糖苷酶融合体；PCT/US2008/065417)和里氏木霉β-木糖苷酶进行预处理玉米纤维的水解。里氏木霉β-木糖苷酶如Rasmussen等，2006，BiotechnologyandBioengineering94:869_876所述使用米曲霉的标准培养技术通过在米曲霉中表达而重组获得。特异腐质霉阿魏酸酯酶如实施例8中所述获得。在温度50"C和pH5.0在2mlEPPENDORF管(EppendorfAG,Germany)中的50mM乙酸钠中进行预处理玉米纤维的水解。在可对每个样品进行恒定加热和混合的EPPENDORFTHERM0MIXERComfort(EppendorfAG,Germany)中温育样品。使用的底物量是2.5w/w%，总样品体积为2ml。在里氏木霉纤维素分解蛋白组合物和里氏木霉β-木糖苷酶的顶部以Img酶每g干物质的酶加载量加入来自特异腐质霉的阿魏酸酯酶。以5mg酶每g干物质的加载量加入里氏木霉纤维素分解蛋白组合物，并且以Img酶每g干物质的加载量加入里氏木霉β-木糖苷酶。24小时后通过在加热块(TechneInc.，BurlingtonNJ,USA)中在100°C将样品加热10分钟而终止水解。使用配备N0VA-PAKC18，4μm，3.9x150mm柱(WatersCorporation,Milford,ΜΑ,USA)的ICS-3000离子层析系统分析阿魏酸(Dionex，Sunnyvale,CA,USA)。在300nm波长检测阿魏酸。使用两种洗脱液洗脱液1是0.IM磷酸pH2.5+lmM三氟乙酸(TFA)，而洗脱液2是乙腈。用包含85%洗脱液1和15%洗脱液2的溶液以0.5ml每分钟的流量等度分析阿魏酸。使用下述公式，通过确定由底物释放的糖的量占开始加入量的百分比来计算转化率。用样品数据的双尾分布和等方差(equalvariance)进行T-检验。转化率(％)=(水解物中的糖量/加入的底物中的糖量)χ100以Img酶每克干物质的酶加载量加入来自特异腐质霉的阿魏酸酯酶，连同Img酶每g干物质的里氏木霉β“木糖苷酶和5mg酶每g干物质的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物，比较此时预处理玉米纤维的转化率和仅加入Img酶每g干物质的来自里氏木霉的β-木糖苷酶和5mg酶每g干物质的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物时的预处理玉米纤维的转化率，证明相对转化率从100.0显著(P<0.0047)增加至115.0(表1)。还实现了相对半纤维素转化率从100.0显著(P<0.0247)增加至115.8(表2)。表权利要求一种具有阿魏酸酯酶活性的分离的多肽，其选自下组(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75％同一性；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中高严紧条件下与以下杂交(i)SEQIDNO1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQIDNO1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。2.权利要求1的多肽，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有阿魏酸酯酶活性的片段，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有阿魏酸酯酶活性的片段组成。3.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其编码具有阿魏酸酯酶活性的片段的亚序列，或由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其编码具有阿魏酸酯酶活性的片段的亚序列组成。4.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含在大肠杆菌NRRLB-50077所含的质粒pHinsFAEBl中。5.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-4中任一项的多肽的核苷酸序列。6.核酸构建体，其包含权利要求5的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中产生。7.重组宿主细胞，其包含权利要求6的核酸构建体。8.用于产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。9.用于产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。10.用于产生亲本细胞的突变体的方法，所述方法包括破坏或缺失编码权利要求1-4中任一项的多肽的核苷酸序列，其导致突变体与亲本细胞相比产生较少的所述多肽。11.通过权利要求10的方法产生的突变细胞。12.用于产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。13.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用编码权利要求1-4中任一项的多肽的多核苷酸转化。14.双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包括权利要求5的多核苷酸的亚序列，其中可选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。15.抑制细胞中具有阿魏酸酯酶活性的多肽的表达的方法，其包括对细胞施用或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括权利要求5的多核苷酸的亚序列。16.核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至18或者由SEQIDNO2的氨基酸1至18组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。17.重组宿主细胞，其包含权利要求16的核酸构建体。18.用于产生蛋白质的方法，其包括(a)在有益于所述蛋白质产生的条件下培养权利要求17的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。19.用于降解含木聚糖材料的方法，其包括用权利要求1-4中任一项的具有阿魏酸酯酶活性的多肽处理所述含木聚糖材料。20.权利要求19的方法，其进一步包括用木聚糖降解酶处理所述含木聚糖材料。全文摘要本发明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于制备和使用所述多肽的方法。文档编号C12N15/82GK101939420SQ200880126491公开日2011年1月5日申请日期2008年12月3日优先权日2007年12月7日发明者米歇尔·马兰塔,金伯利·布朗申请人:诺维信公司