专利名称：一种利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激酶的方法
技术领域：
本发明涉及治疗血栓病的纳豆激酶的分离提取方法技术领域。
背景技术：
随着人们生活水平的提高和环境激素的影响，心脑血管病已经跃居
人类死亡疾病的前列，死亡率仅排在恶性肿瘤之后列第二位，预计到2020 年因心血管疾病死亡的人数将占到全部死亡人数的36%，成为威胁人类健 康的第一大杀手。血栓和栓塞性血管阻塞在冠心病、中风等临床重病的 发病机制中起着主要作用，目前的治疗主要依靠溶栓剂，包括尿激酶 (UK)、链激酶(SK)、组织型纤维酶原激活剂(t-PA)或躬l激酶(LC)等， 普遍存在半衰期短、副作用大、来源紧缺或价格昂贵等缺点。
当前正在研发的纳豆激酶不仅具有体内外溶解血栓的活性，作用迅 速，而且疗效时间长。跟传统的一些溶栓剂相比，具有安全性好、成本 低、没出血倾向和口服有效等优点，可以采用液体深层发酵工艺，易于 规模化生产，是当前最有开发前景的溶栓生物药物之一。 '
纳豆激酶的分离提取技术是制约其应用及市场开发的瓶颈问题，一 般的蛋白提取方法包括膜过滤、盐析、离子交换层析、凝胶分子筛和疏 水层析等，都存在步骤多、层析介质价格昂贵、工业生产困难和目标酶 的收率低等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激 酶的方法，选用处理的大豆颗粒直接作为层析介质，只要将纳豆激酶发 酵除菌液一步亲和层析就可以得到电泳纯的纳豆激酶，该方法简单独特， 收率高，成本低，易于进行规模化放大，具有较好的经济效益和社会效
、产，
nrf 。
本发明的主要技术方案是 一种利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化 纳豆激酶的方法，特征在于具有如下步骤 (1)准备或制取纳豆激酶发酵液；(2)准备或制备亲和层析介质，即处理的大豆颗粒备用； (2)亲和层析
a. 将处理好的大豆颗粒作为层析介质装入层析柱，用磷酸缓冲液平 衡，利用紫外蛋白检测仪进行色谱在线监测；
b. 待基线平稳后，用蠕动泵加入纳豆激酶发酵除菌液，即粗酶液， 上样完毕后，继续用磷酸缓冲液平衡淋洗，出现杂蛋白淋洗峰，收集杂 蛋白峰；
c. 待杂蛋白峰过后，回到基线，换用磷酸缓冲液配制的NaCl溶液线 性梯度洗脱，出现目标蛋白洗脱峰，收集该洗脱峰;对磷酸缓冲液透析， 冷冻干燥，即得纯化后的纳豆激酶。
所述的亲和层析时，层析柱为玻璃材质为佳，底部为烧结玻璃，柱 长22 28厘米，内直径1.6 2.4厘米。层析柱也可用其它材质。
所述的亲和层析时，亲和层析过程均在环境温度15"C以下进行为佳。 所述亲和层析时，较佳的操作方法为
a. 将处理好的大豆颗粒作为层析介质装入层析柱，在室温下，用 pH7. 0的0. 01mol/L磷酸缓冲液平衡，利用紫外蛋白检测仪进行色谱在线 监测，流速为0. 2 0. 8ml/min;
b. 待基线平稳在后，用蠕动泵加入纳豆激酶发酵除菌液(粗酶液) 5ml，上样完毕后，继续用pH7.0的0. 01mol/L磷酸缓冲液平衡淋洗，出 现杂蛋白淋洗峰，收集杂蛋白峰，采用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活 力； -
c. 待杂蛋白峰过后，回到基线，换用0 lmol/L的NaCl溶液(均用 pH7. 0的0. 01mol/L磷酸缓冲液配制)线性梯度洗脱，在达到0. 4mol/L 的NaCl溶液时出现洗脱峰，收集洗脱峰，采用纤维蛋白平板法测定纳豆 激酶活力；对PH7. 0的0. 01mol/L磷酸缓冲液透析，冷冻干燥后得到纯 化后的纳豆激酶，采用纤维蛋白平板法测定酶活力。 .
所述的亲和层析时，较佳的操作方法为将蛋白紫外检测仪与色谱 在线软件共同使用，可以随时在计算机上监测到层析柱流出液体中蛋白 的含量，及时收集蛋白峰。
所述的制备亲和层析介质，包括以下步骤为佳
a、将大豆冲洗干净，用水充分浸泡膨胀；
4b、将之蒸熟；
C、在研钵内加入无菌水，将熟大豆捣碎；
d、 用无菌水冲洗截取，得到大豆颗粒；
e、 将大豆颗粒用盐酸、水、NaOH、水、NaCl、水清洗顺序处理，在 2 5"C低温保存备用；
所述的制备亲和层析介质时，较佳的操作方法为在研钵内加入熟
大豆重量1/10的无菌水，将步骤b的熟大豆捣碎，用无菌水冲洗过20 目筛，再用60目筛截取，得到大豆颗粒。将大豆颗粒用lmol/L的盐酸、 水、lmol/L的NaOH、水、lmol/L的NaCl、水顺序清洗处理后，在2 5 'C低温保存。 . 所述的制取纳豆激酶发酵液的较佳方法为
a. 将保存的纳豆芽孢杆菌转接到细菌琼脂培养基试管中，培养活化;
b. 将活化的菌苔接入摇瓶种子培养液中，培养液为PB培养基，制 备种子液；
c. 在发酵罐中装入发酵培养基，蒸汽灭菌，降温冷却到4(TC，将种 子液接入发酵罐，制备纳豆激酶发酵液；
d. 用0. 22微米膜错流过滤除去菌体，得到透明的棕色液体，即纳 豆激酶发酵除菌液。
上述的细菌琼脂培养基重量组份配比较佳为蛋白胨牛肉膏NaCl =0. 8 1.2份0. 4 0. 6份0.4 0. 6份，灭菌前pH7. 2 7. 5。 ' 所述的发酵培养基的重量组份配比较佳为葡萄糖豆饼粉KH2P04 :
K2HP04'3H20 : MgS(WH20 : CaCl2=0. 4 0. 6份1.6 2.4份0.16 0.24份0.21 0. 31份:0.08 0. 12份0. 16 0. 24份，灭菌前pH7. 2 7.5。 '
本发明的积极效果是选用处理的大豆颗粒直接作为层析介质，只 要将纳豆激酶发酵除菌液一步亲和层析，就可以得到电泳纯的纳豆激酶， 舍弃传统的蛋白提取工艺中的盐析、离心等步骤；代替了亲和层析常用 的昂贵的琼脂糖、纤维素等材料，原料易处理、价格低廉；并且该步骤 将大部分色素和杂蛋白均除去，目标酶的收率可达80%以上。该方法具有 简单独特、收率高、成本低、易于进行规模化放大的特点，具有较好的 经济效益和社会效益。以下结合实例作详述，但不作为对本发明的限定。
具体实施方式
实施例1:
(1) 将发酵好的纳豆激酶发酵液，过滤除菌处理。
(2) 亲和层析介质的制备
a. 将200g大豆冲洗干净，用水充分浸泡、膨胀，约重500g。
b. 放入高压锅内蒸熟，12(TC保持20分钟。
c. 在研钵内加入50ml无菌水，将熟大豆捣碎，。
d. 用无菌水冲洗过20目筛后再用60目筛截取，得到约50g大豆颗粒。
e. 将大豆颗粒用lmol/L的盐酸、水、lmol/L的NaOH、水、lmol/L 的NaCl、水顺序清洗处理后，在2-5t:低温保存。
(3) 亲和层析 '
a. 将处理好的大豆颗粒20g(湿重)作为层析介质装入层析柱，介质 高8厘米，内直径2厘米。待介质沉降稳定后，用pH7. 0的0. 01mol/L 磷酸缓冲液平衡，流出液接到紫外蛋白检测仪(提前预热20-30min)的 入口，进行色谱在线监测。控制蠕动泵流速为0. 3ml/min。
b. 待基线平稳到2mv后，约100min开始上样，采用蠕动泵流加纳豆 激酶发酵除菌液(粗酶液)5ml，约16-17min后上样完毕，继续用pH7. 0 的0. 01mol/L磷酸缓冲液平衡淋洗，保持流速不变。约在180min开始出 现杂蛋白淋洗峰，峰高14-15mv,用三角瓶收集淋洗峰，共计76.4ml， 期间用冰袋包围降温。
c. 约400min时杂蛋白峰过完层析柱，继续用缓冲液淋洗10-20min， 色谱指示回到基线，将0和lmol/L的NaCl溶液(均用pH7. 0的0. 01mol/L 磷酸缓冲液配制)各100ml加入梯度搅拌仪中，共计200ml 。在440min 开始梯度洗脱，约在700min出现洗脱峰，收集洗脱峰(冰袋包围降温) 共计62.4ml。酶活力测定结果如表1。洗脱峰冷冻干燥后，与发酵除菌 液、盐析处理后的冻干粉样品一起进行SDS-PAGE电泳测定，结果显示采 用该层析工艺提取的纳豆激酶样品，分子量约27-28KD，只有一条带。表1
纳豆激酶发酵除菌 液(粗酶液)杂蛋白峰收集液洗脱峰收集液
体积(ml)576. 462.4
纳豆激酶活力 (U/ml)2450. 10160.9
收率一_82.0% .
冷冻干燥后酶活 (U/mg)136.804134.3
纯化倍数一—30.2
实施例2:
(1) 发酵液处理同实施例1。
(2) 亲和层析介质的制备
a. 将200g大豆冲洗干净，用水充分浸泡、膨胀,约重500g。
b. 放入高压锅内蒸熟，120'C保持20分钟。
c. 在研钵内加入50ml无菌水，将熟大豆捣碎，。 '
d. 用无菌水冲洗过20目筛后再用60目筛截取，得到约50g大豆颗粒。
e. 将大豆颗粒用lmol/L的盐酸、水、lmol/L的NaOH、水、lmol/L 的NaCl、水顺序清洗处理后，在2-5'C低温保存。
(3)亲和层析
a. 将处理好的大豆颗粒30g(湿重)作为层析介质装入层析柱，介质 高12厘米，内直径2厘米。待介质沉降稳定后，用pH7. 0的0. Olmol/L 磷酸缓冲液平衡，流出液接到紫外蛋白检测仪(提前预热20-30min)的 入口，进行色谱在线监测，基线应该为平稳直线。控制蠕动泵流速为 0. 8ml/min。
b. 待基线平稳到lmv后，第50miri上样，采用蠕动泵流加纳豆激酶 发酵除菌液(粗酶液)10ml，约12min后上样完毕，继续用pH7.0的 0. Olmol/L磷酸缓冲液平衡淋洗，保持流速不变。约50min后出杂蛋白淋
7洗峰，峰高24-25mv，用三角瓶收集淋洗峰，共计53. lml，期间用冰袋 包围降温。
c.待杂蛋白峰过后，继续用缓冲液淋洗10-20min,色谱指示回到基 线后，同例.l换梯度洗脱，约80-90min后出现洗脱峰，收集洗脱峰(冰 袋包围降温)，共计45.5 ml,测定酶活力，结果如表2。电泳测定结果 同实施例1。
表2
纳豆激酶发酵 除菌液(粗酶液)杂蛋白峰收集液洗脱峰收集液
体积(ml)1053. 145.5
纳豆激酶活力 (U/ml)2450. 10430.4
收率一一80. 2%
冷冻干燥后酶活 (U/mg)136. 803474. 7
纯化倍数——25.4
在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本 发明作改动或修改，如大豆颗粒的处理方法，可以蒸熟或生大豆粉 碎，也可以将截留目数縮小或扩大，这些相同原理的亲和材料处s 同样落于本发明的范围之内。
8
权利要求
1、一种利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激酶的方法，特征在于具有如下步骤(1)准备或制取纳豆激酶发酵液(2)准备或制备亲和层析介质，即大豆颗粒备用；(3)利用上述的大豆颗粒进行亲和层析。
2、 根据权利要求1所述的利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激 酶的方法，其特征在于亲和层析时a. 将处理好的备用大豆颗粒作为层析介质装入层析柱，用磷酸缓冲 液平衡，利用紫外蛋白检测仪进行色谱在线监测；b. 待基线平稳后，用蠕动泵加入纳豆激酶发酵液，即粗酶液，上样 完毕后，继续用磷酸缓冲液平衡淋洗，出现杂蛋白淋洗峰，收集杂蛋白 峰；c. 待杂蛋白峰过后，回到基线，换用NaCl溶液用磷酸缓冲液配制的 NaCl溶液线性梯度洗脱，在达NaCl溶液时出现洗脱峰，收集洗脱峰；对 水透析，冷冻干燥，即得纳豆激酶。 '
3、 根据权利要求1所述的利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激 酶的方法，其特征在于所述的制备亲和层析介质，包括以下步骤a、 将大豆冲洗干净，用水充分浸泡膨胀；b、 将之蒸熟；c、 在研钵内加入无菌水，将熟大豆捣碎；d、 用无菌水冲洗截取，得到大豆颗粒；e、 将大豆颗粒用盐酸、水、NaOH、水、NaCl、水清洗顺序处理，在 2 5t:低温保存备用；。
4、 根据权利要求6所述的利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激 酶的方法，其特征在于制备亲和层析介质时，在研钵内加入湿豆重量1/10 的无菌水，将步骤b的熟大豆捣碎；用无菌水冲洗过20目筛，再用60 目筛截取，得到大豆颗粒；将大豆颗粒用lmol/L的盐酸、水、lmol/L的 NaOH、水、lmol/L的NaCl、水清洗顺序处理，在2 5。C低温保存。
全文摘要
本发明涉及一种利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激酶的方法，涉及治疗血栓病的纳豆激酶的分离提取技术领域。主要有如下步骤(1)纳豆激酶的液体深层发酵；(2)发酵除菌液的盐析、脱色处理；(3)亲和层析介质的制备；(4)亲和层析，即得纳豆激酶。本发明选用处理的大豆颗粒直接作为层析介质，代替了亲和层析常用的昂贵的琼脂糖、纤维素等材料，收率可达80％以上，具有简单独特、收率高、成本低、可以进行规模化生产的特点，具有较好的经济效益和社会效益。
文档编号C12N9/54GK101508983SQ200910074020
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者史延茂, 张丽萍, 张根伟, 李书生, 明 杨, 程辉彩, 超 董, 马跃华 申请人:河北省生物研究所