专利名称：：一种绿僵菌的固体培养方法
技术领域：
：本发明涉及生物发酵方法
技术领域：
，具体是指绿僵菌(AfetoA&'Mmflm'《op//ae)的一种固体培养方法。
背景技术：
：绿僵菌是广谱性寄生真菌，可感染200余种昆虫，对蝗虫及地下害虫等有特效，无残毒，无公害，使用安全，对害虫天敌亦有保护作用。是一种可持续、低消耗的害虫防治制剂，可代替大量化学农药的使用，减轻环境污染，在生物防治中具有重要应用价值。绿僵菌的大量培养是满足田间应用需求的基础。目前国内外绿僵菌固体培养一般采用框架式或塑料袋法培养，其培养过程中不仅设备复杂，污染率高和对湿度要求条件高，而且发酵周期长，相对生产效率低。
发明内容本发明的目的是提供一种绿僵菌固体培养方法，将框架式与塑料袋法培养结合起来，可有效减少培养过程中的污染机率和后期对湿度的要求，并可明显改善培养基的通气性能，其发酵工艺简单，不需要复杂设备，发酵周期短，生产效率高，生产成本低，有较高的经济效益和社会效益。本发明的主要技术方案是一种绿僵菌的固体培养方法，包括液体菌种的制备及固体培养，其特征在于固体培养前期采用框架式培养，后期采用塑料袋法培养，固体培养基中具有营养原料麦麸和作为原料载体的玉米秸秆粉。所述的固体培养基中具有以下组份及重量配比的固体基质为佳，麦麸玉米秸秆粉=60-90份5-40份。所述的固体培养基中添加无机盐的较佳组份及重量配比为，按其固体基质成分总量为100g，添加葡萄糖0.8-1.5g、硫酸铵1.5-2.5g、磷酸二氢钾0.6-1.8g;将这些成分溶于70-200ml水后再与固体基质搅拌均匀，蒸汽灭菌。所述的固体培养前期框架式培养接种时液体菌种量为固体培养基总重量的5-20%为佳。所述的框架式培养2-3天长满白色菌丝时，将菌种轻轻捣碎，再装入灭菌的聚丙烯塑料袋中进行塑料袋法培养3-4天。所述的液体菌种制备的方法用的斜面培养基具有如下组份及重量配比较佳马铃薯80120g、蔗糖1624g、酵母膏46g、KH2P04l4g、MgS041.21.8g、琼脂15g、水1L。所述的液体菌种制备的方法用的液体培养基具有如下组分及重量配比为佳葡萄糖3248g、酵母膏46g、蛋白胨812g、KH2P0438g、MgS040.40.6g、水1L。本发明的积极效果是将框架式与塑料袋法培养结合起来，可有效减少培养过程中的污染机率和后期对湿度的要求，并可明显改善培养基的通气性能，其发酵工艺简单，不需要复杂设备，.发酵周期短，生产效率高，生产成本低，有较高的经济效益和社会效益。与现有技术相比，本发明利用液体培养快速生长的大量菌丝体，转接到固体营养基质上产生气生分生孢子，从而縮短菌丝生长周期，提高产率，避免前期污染；其次，本发明前期釆用框架式培养，后期塑料袋法培养，生产工艺简单，显著减少了培养过程中的污染机率，縮短了发酵时间，而且不需要复杂设备，对湿度的要求降低；第三，原料主要为农副产品麦麸、玉米秸秆粉，来源广泛、充足，成本低廉，易调控，成功率高；第四，在培养原料中添加部分玉米秸秆粉，不仅可以使农业废弃物得到有效利用，而且明显改善了培养基的粘度、空隙率和疏松度，培养过程中不用额外通气。因此，本发明的实现，不仅对农业废弃物的利用、促进农业可持续发展、保护生态环境方面意义重大，而且有着切实的经济效益和广阔的应用前景。以下结合实例作详述，但不作为对本发明的限定。具体实施方式生产工艺(1)液体菌种的制备，包括如下步骤菌种金龟子绿僵菌M105-32(或用其他的绿僵菌亦可)，河北省生物研究所保存，为公知公用菌种。斜面菌种预先将绿僵菌菌种用试管斜面在25。C传代培养、活4化，当斜面长满绿色孢子时即可；液体培养基每个250ml三角瓶中放入60ml培养基，115。C蒸汽灭菌30分钟；接种从固体斜面中挑出一小块菌苔接入液体摇瓶；培养25士rC摇床振荡培养36-42小时，长成白色粘稠菌丝体即可向固体培养基中接种。(2)固体培养a.固体培养基麦麸60-90%、玉米秸秆粉5-40%(上两种为100);以下为占上两种的百分数葡萄糖O.8-1.5g、硫酸铵1.5-2.5g、磷酸二氢钾0.6-1.8g;将这些成分溶于70-200ml水后再与固体基质搅拌均匀，pH自然，115"C蒸汽灭菌50分钟；b.接种按5-20%接种量，将液体种倒入固体培养基中，搅拌均匀，放入下铺灭菌报纸的浅盘中培养(厚度3-4cm)，浅盘底为尼龙网，通气性好，注意各环节均需无菌操作；c.培养方法培养室温度为25士rC，湿度30-70%,培养2-3天，长满白色菌丝时，轻轻捣碎，装入可蒸汽灭菌的聚丙烯塑料袋中，袋子两端塞入灭菌棉花，再用细绳捆住继续培养3-4天(装入袋后室内无湿度要求)，内外均长出绿色孢子即可，从袋中倒出，在阴凉通风处晾干即为粗品(或在35'C烘24h，含水率《12%)。实施例1:(1)液体菌种的制备a.斜面菌种预先将金龟子绿僵菌M105-32菌种用试管斜面培养基在25"C传代培养、活化，当斜面长满绿色孢子时即可；b.液体培养基配制0.5L液体培养基，每个250ml三角瓶中放入60ml培养基，115。C蒸汽灭菌30分钟；c.接种从固体斜面中挑出一小块菌苔接入液体摇瓶，一只斜面可接6-8个瓶子；d.培养25土rC摇床振荡培养36-42小时，长成白色粘稠菌丝体即可向固体培养基中接种。(2)固体培养a.固体培养基麦麸4.2kg玉米秸秆粉0.8kg、葡萄糖60g、硫酸铵90g、磷酸二氢钾55g、自来水为6L，先用水将葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾溶解，再倒入固体培养基中搅拌均匀，pH自然，分装成几个小布袋，放入髙压灭菌锅内115"蒸汽灭菌50分钟；b.接种将液体种倒入固体培养基中，搅拌均匀，放入下铺灭菌报纸的浅盘中培养(厚度3-4cm)，浅盘底为尼龙网，通气性好，几个盘子可以叠放，最上层再盖层塑料布(保湿)，注意各环节均需无菌操作；c.培养方法培养室预先消毒，温度25士rC，湿度30-70%，培养2-3天，长满白色菌丝时，轻轻捣碎，装入可蒸汽灭菌的聚丙烯塑料袋中，袋宽15cm，袋长35-40cm，袋子两端塞入灭菌棉花，再用细绳捆住继续培养3-4天(装入袋后室内无湿度要求)，内外均长出绿色孢子，从袋中倒出，放在阴凉通风处晾干即为粗品(或在35。C烘24h，含水率《12%)。血球计数板计数L31Xl(T孢子/克粗品，平板计数1.15X10l包子/克粗品。固体斜面培养基具有如下组份及重量配比较佳马铃薯80120g、蔗糖1624g、酵母膏46g、KH2P04l4g、MgS041.21.8g、琼脂15g、水1L。(例2同)液体菌种制备的方法用的液体培养基具有如下组份及配比为佳葡萄糖3248g、酵母膏46g、蛋白胨812g、KH2P0438g、MgSOd0.40.6g、水1L。(例2同)实施例2:(1)液体菌种的制备a.斜面菌种预先将金龟子绿僵菌M105-32菌种用试管斜面培养基在25'C传代培养、活化，当斜面长满绿色孢子时即可；b.液体培养基配制1.7L液体培养基，每个250ml三角瓶中放入60ml培养基，115。C蒸汽灭菌30分钟；c.接种从固体斜面中挑出一小块菌苔接入液体摇瓶，一只斜面可接6-8个瓶子；d.培养25土rC摇床振荡培养36-42小时，长成白色粘稠菌丝体即可向固体培养基中接种。(2)固体培养a.固体培养基..麦麸12.Okg、玉米秸秆粉3.Okg、葡萄糖120g、硫酸铵280g、磷酸二氢钾140g、自来水为13L，先用水将葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾溶解，再倒入固体培养基中搅拌均匀，pH自然，分装成几个小布袋，放入高压灭菌锅内115"蒸汽灭菌50分钟；b.接种将培养好的液体种倒入灭菌固体培养基中，搅拌均匀，放入下铺灭菌报纸的浅盘中(厚度3-4cm)，浅盘底为尼龙网，通气性好，几个盘子可以叠放，最上层再盖层塑料布(保湿)，注意各环节均需无菌操作；c.培养方法培养室预先消毒，温度25土rC，湿度30-70%,培养2-3天，长满白色菌丝时，轻轻捣碎，装入可蒸汽灭菌的聚丙烯塑料袋中，袋宽15cm，袋长35-40cm，袋子两端塞入灭菌棉花，再用细绳捆住继续培养3-4天(装入袋后室内无湿度要求)，内外均长出绿色孢子，从袋中倒出，放在阴凉通风处晾干即为粗品(或在35t:烘24h，含水率《12%)。血球计数板计数1.16X10"孢子/克粗品，平板计数1.05Xl(T孢子/克粗品。其他实施例，方法同上，配比如下表l。其他实施例配比<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>效果发酵周期由同类技术的12-14天缩短到6-7天，发酵水平》U)0亿/克粗品。不仅明显縮短了发酵周期，而且不需要复杂设备，对湿度的要求降低。权利要求1、一种绿僵菌的固体培养方法，包括液体菌种的制备及固体培养，其特征在于固体培养前期采用框架式培养，固体培养的后期采用塑料袋法培养，固体培养基中具有营养原料麦麸和作为原料载体的玉米秸秆粉。2、根据权利要求1所述的绿僵菌的固体培养方法，其特征在于所述的固体培养基中具有以下组分及重量配比的固体基质，麦麸玉米秸秆粉二60-90份:5-40份。3、根据权利要求2所述的绿僵菌的固体培养方法，其特征在于所述的固体培养基中添加无机盐的组分及重量配比为，按其固体基质成分总量为100g，添加葡萄糖0.8-1.5g、硫酸铵1.5-2.5g、磷酸二氢钾0.6-1.8g;将这些成分溶于70-200ml水后再与固体基质搅拌均匀，蒸汽灭菌。4、根据权利要求1所述的绿僵菌的固体培养方法，其特征在于所述的固体培养前期框架式培养接种时液体菌种量为固体培养基总重量的5-20%。5、根据权利要求4所述的绿僵菌的固体培养方法，其特征在于所述的框架式培养2-3天长满白色菌丝时，将菌种轻轻捣碎，再装入灭菌的聚丙烯塑料袋中进行塑料袋法培养3-4天。6、根据权利要求l、2、3、4或5所述的绿僵菌的固体培养方法，其特征在于所述的液体菌种制备的方法用的固体斜面培养基具有如下组分及重量配比马铃薯80120g、蔗糖1624g、酵母膏46g、KH2P04l4g、MgS041.21.8g、琼脂15g、水1L。7、根据权利要求6所述的绿僵菌的固体培养方法，其特征在于所述的液体菌种制备的方法用的所述的液体菌种制备的方法用的液体培养基具有如下组分及重量配比葡萄糖3248g、酵母膏46g、蛋白胨812g、KH2P0438g、MgS040.40.6g、水1L。全文摘要本发明涉及一种绿僵菌的固体培养方法，涉及生物发酵方法
技术领域：
。包括液体菌种的制备及固体培养，其特征在于固体培养前期采用框架式培养，后期采用塑料袋法培养，固体培养基中具有营养原料麦麸和作为原料载体的玉米秸秆粉。本发明的积极效果是将框架式与塑料袋法培养结合起来，可有效减少培养过程中的污染机率和后期对湿度的要求，并可明显改善培养基的通气性能，其发酵工艺简单，不需要复杂设备，发酵周期短，生产效率高，生产成本低，有较高的经济效益和社会效益。文档编号C12R1/645GK101525577SQ200910073840公开日2009年9月9日申请日期2009年3月2日优先权日2009年3月2日发明者史延茂,尹淑丽,崔冠慧,张丽萍,张根伟,李书生,段普凡,程辉彩,超董,黄亚丽申请人:河北省生物研究所