专利名称：检查芯片、检测装置以及被检物质的检测方法
技术领域：
本发明涉及使用通过修饰被检物质的修饰物质的光激励而发生的电流来检测被
检物质的检查芯片、检测装置以及被检物质的检测方法。
背景技术：
在疾病的临床检查及诊断中，用遗传因子检测法、免疫学的检测法来检测生物体 样品中所包含的疾病由来的遗传因子及蛋白质等。具体而言可列举免疫胶体金层析法 (Imm皿ochromato)、乳胶凝集法(Latex Agglutination)、酵素免疫法、化学发光免疫法以 及遗传因子增幅PCR法等。 但是，这些检测方法从简易性、快速性、以及成本的任一观点来看都有改善的余 地。 因而，在国际公开第2007/037341号小册子中提出了将通过增感色素的光激励而 产生的电流利用于被检物质检测的方法。在这一方法中，首先在电极上形成半导体层，并在 此半导体层上固定可以与被检物质结合的探针。接着，在利用探针物质捕捉到用增感色素 修饰过的被检物质以后，对正在修饰被检物质的增感色素照射使增感色素激励的光。其结 果，就从正在修饰被检物质的增感色素发生电子，通过所发生的电子被半导体层所接纳，而 产生电流。对所产生的电流进行检测。这里使用硅烷偶联剂等架桥剂，在半导体层上固定 探针。但是，由于硅烷偶联剂其导电性较低从而使电流的检测效率降低，所以就有被检物质 的检测灵敏度较低之类的问题点。
发明内容
亦即、本发明提供以下技术方案 (1) —种检查芯片，用来检测利用通过光激励而产生电子的修饰物质修饰后的被 检物质，包括 具备被形成在半导体层上的金属层的半导体电极部；
捕捉被检物质的被固定在上述金属层上的探针；以及
具备导电层的对极部。 (2)在技术方案(1)所记载的检查芯片中，上述金属层由通过电解液而溶解的金 属组成。
(3)在技术方案(2)所记载的检查芯片中，上述电解液包含碘或者碘化物。
(4)在技术方案(1) (3)中任意一项所记载的检查芯片中，上述金属层由与上述 探针进行化学吸附的金属组成。 (5)在技术方案(4)所记载的检查芯片中，与上述探针进行化学吸附的金属是金。
(6)在技术方案(4)所记载的检查芯片中，上述探针具有硫醇基作为与上述金属 层进行化学吸附的结合基。
(7) —种检测装置，用来检测用通过光激励而产生电子的修饰物质经过修饰的被检物质，包括 以可受纳检查芯片的方式而构成的检查芯片受纳部，其中该检查芯片包括具备 被形成在半导体层上的金属层的半导体电极部；捕捉被检物质的被固定在上述金属层上的 探针；和具备导电层的对极部； 对修饰物质进行光激励的光源，该修饰物质对上述检查芯片受纳部上所插入的上 述检查芯片内的被检物质进行修饰；以及 电流测定部，测定通过上述光源的光激励而从正在对被检物质进行修饰的修饰物 质流出的电流。 (8)在技术方案(7)所记载的检测装置中，上述光源发出激励正在对被检物质进 行修饰的修饰物质的波长的光。 (9) —种检测方法，用来检测用通过光激励而产生电子的修饰物质经过修饰的被 检物质，包括以下步骤 在包括具备被形成在半导体层上的金属层的半导体电极部；捕捉被检物质的被固
定在上述金属层上的探针；和具备导电层的对极部的检查芯片上应用包含被检物质的样
品，由此用被固定在上述金属层上的上述探针来捕捉被检物质； 将修饰物质导入被检物质； 照射对修饰物质进行激励的光；以及 检测从经过激励的修饰物质所产生的电流。 (10)在技术方案(9)所记载的检测方法中，还包括在上述半导体电极部和上述 对极部之间添加用于流过电流的电解质媒体。
图1是作为本发明的一个实施方式的检测装置1的立体图。 图2是检测装置1的框图。 图3是在检测装置1上使用的检查芯片4的立体图。 图4是表示具有检查芯片4的半导体电极部15的上部板极的立体图。 图5是表示具有检查芯片4的对极部16的下部板极的立体图。 图6是将上基板13卸下时的检查芯片4的立体图。 图7是表示检查芯片4之结构的截面图。 图8是表示检查芯片4的半导体电极部15以及对极部18之结构的示意图。 图9是表示由用户进行的将检体注入到检查芯片4的方法的流程图。 图10是表示检测装置1的检测动作过程的流程图。 图11是杂交反应时和电解液添加时的半导体电极部15的示意图。 图12是表示通过实施例1以及比较例1的测定所获得的光电流值的图表。 图13是在实施例2以及比较例2中所检测出的光电流值的图表。 图14是表示在实施例2以及比较例2中所获得的数据之中、来源于修饰物质的电
流值的图表。 图15是在实施例3、比较例3以及比较例4中所检测出的光电流值的图表。 图16是在实施例4、比较例5以及比较例6中所检测出的光电流值的图表。
图17是在实施例5中所检测出的各膜厚下的S/N比的图表。
具体实施例方式
以下，基于附图所示的实施方式来记述本发明。此外，本次所公开的实施方式应当 被认为在所有方面都是示例而不是限制性的。本发明的范围并非上述实施方式的说明而是 由权利要求的范围所表示、进而还包含与权利要求的范围均等的意味以及在其范围内的所 有变更。〔检测装置之结构〕 图1是表示本发明的一个实施方式所涉及的检测装置的立体图。此检测装置是检 测从生物体细胞所采取的或者以人工方式所合成的核酸、蛋白质、肽等具有特异结合性的 被检物质的装置。此检测装置1例如能够从检体样品中检测出作为子宫颈癌的原因病毒的 人类乳头状瘤病毒(以下称之为HPV)的mRNA。 本实施方式的检测装置1具备插入检查芯片4的芯片受纳部3和显示检测结果的 显示器2。另外，检查芯片4还具备样品注入口 11。 此检查芯片4是一次性的HPV检测用的芯片，被插入到检测装置1的芯片受纳部 3。检查芯片4具有如下功能，即通过从样品注入口 ll注入检体样品，来捕捉用借助于光激 励而产生电子的修饰物质修饰过的HPV的mRNA。 图2是表示检测装置1之结构的框图。检测装置1具备光源5、电流计6、电源32、 A/D变换部7、控制部8和显示器2。 光源5将光照射到对用检查芯片4所捕捉到的HPV的mRNA进行了修饰的修饰物 质，以使修饰物质激励。电流计6测定起因于从被激励的修饰物质所产生的电子而流过的 电流。电源32对设置于检查芯片4上的电极施加规定的电位。A/D变换部7对电流计6所 测定的电流值进行数字变换。控制部8由CPU、 ROM以及RAM等所构成，对光源5、电流计6 以及显示器2的动作进行控制。另外，控制部8根据用A/D变换部7经过数字变换的电流 值，基于预先所作成的表示电流值与HPV量之关系的检量线来估算检体样品中的HPV量。显 示器2显示用控制部8估算后的检体样品中的HPV量。
〔检查芯片4之结构〕 使用图3 图8就检测装置1上所使用的检查芯片4之结构进行说明。
图3是检查芯片4的立体图。检查芯片4具备下基板16、设置于下基板16上方 的上基板13、被夹在下基板16和上基板13中的硅橡胶12。另外在上基板13上还设置有 通往内部的样品注入口 11。 图4是使图3的检查芯片4在水平方向向右旋转90度，并在垂直方向上旋转180 度的状态下的上基板13的立体图。在此上基板13的表面上形成有半导体电极部15和被 连接到半导体电极部15的电极引线14。上基板13由二氧化硅(Si02)而形成，电极引线 14由氧化铟锡(IT0)和掺杂锑氧化锡(AT0)两层而形成。关于半导体电极部15使用图8 在后面叙述。 图5是使图3的检查芯片4在水平方向向右旋转90度的状态下的下基板16的立 体图。在下基板16的表面上分别形成有对极部18、被连接到对极部18的电极引线17、参 考电极31 、被连接到参考电极31的电极引线30。
下基板16用以二氧化硅(Si02)为主体的玻璃而形成，对极部18、电极引线17、参 考电极部31以及电极引线30分别用铂而形成。 图6是将图3的检查芯片4的上基板13在上方卸下时的检查芯片4的立体图。 硅橡胶12如图6所示那样以包围对极部18以及参考电极部31的方式被配置在下基板16 上。连接到对极部18的电极引线17以及连接到参考电极部31的电极引线30从硅橡胶12 的框内延伸到框外。这一延伸到框外的电极引线17以及电极引线30与电源32连接起来。
设置于上基板13的样品注入口 11是贯通上基板13的孔。检体样品以及后述的 电解液从这一样品注入口 11被注入到硅橡胶12的框内。 图7是表示图3的检查芯片4的A-A截面结构的截面图。如图7所示那样，检查 芯片4上所包含的上基板13和下基板16隔着硅橡胶12而配置。在上基板13和下基板16 之间形成有空间25。隔着此空间25，被形成在上基板13上的半导体电极部15和被形成在 下基板16上的对极部18以及参考电极部31 (未图示)相对置。在此空间25上经由样品 注入口 11而注入检体样品以及后述的电解液。 如图7所示那样，连接到半导体电极部15的电极引线14沿着上基板13延伸到空 间25之夕卜，连接到对极部18上的电极引线17以及连接到参考电极部31的电极引线30(未 图示)沿着下基板16延伸到空间25之外。这一电极引线14被连接到电流计6，电极引线 17以及电极引线30被连接到电源32。 此外，在本实施方式中，在上基板13的表面形成半导体电极部15，在下基板16的 表面形成对极部18和参考电极部31，但半导体电极部15、对极部18、参考电极部31的配置 关系只要是各电极与其他电极不接触地配置在硅橡胶12的框内则并不特别进行限制。例 如，还可以在同一基板上配置半导体电极部15、对极部18和参考电极部31。
这里，就图4所示的半导体电极部15进一步进行详细的说明。图8是表示半导体 电极部15以及对极部18之结构的示意图。 半导体电极部15具备形成在上基板13上的导电层21、形成在导电层21上的半 导体层20、形成在半导体层20上的金属层19。对极部18形成在下基板16上。
在半导体电极部15中所包含的金属层19上固定着捕捉用借助于光激励而产生电 子的修饰物质22修饰后的HPV的mRNA24用的探针23。这一修饰物质22是钌络化物，修饰 物质22通过与mRNA进行肽结合来修饰mRNA。 半导体电极部15上所连接的电极引线14被连接到电流计6，对极部18上所连接 的电极引线17以及参考电极部31上所连接的电极引线30被连接到电源32。电流计6与 电源32连接起来，用此电流计6来测定在半导体电极部15与对极部18之间流过的电流。
半导体电极部15中所包含的导电层21由通过溅射而形成的氧化铟锡(ITO)的 层、和在此ITO层上通过溅射而形成的掺杂锑氧化锡(ATO)的层这两层组成。半导体层20 由通过溅射而形成的氧化钛(Ti02)的层组成。金属层19由通用蒸镀而形成的金(Au)的 层组成。对极部18由通过溅射而形成的铂的层组成。 探针23具有硫醇基，通过探针23的硫醇基与金属层19的金原子进行结合，探针 23被固定在金属层19上。这一固定通过使金属层19浸渍在使探针23分散的水溶液中来 进行。〔采用了 HPV检测装置的检测方法〕
参照图9 图11就采用了具有上述构成的检测装置1的检测方法进行说明。图9 是表示用户进行的将检体注入检查芯片4的方法的流程图。图10是表示检测装置1的检 测动作过程的流程图。图11是杂交(hybridization)时以及电解液添加时的半导体电极 部15的示意图。 根据图9的流程图，在步骤Sl用户将检体样品从检查芯片4的样品注入口 11进 行注入。此检体样品是从子宫颈部细胞中进行均质化以及提取处理并经过精制的mRNA。通 过此步骤Sl如图11所示那样，金属层19上的探针23通过杂交来捕捉检体样品中的HPV 的mRNA24。 在步骤S2，用户将检查芯片4内的溶液自样品注入口 ll排出，并用杂交洗涤液对 检查芯片4内进行洗涤。在步骤S3，用户从样品注入口 11注入包含能够与HPV的mRNA24结合的碱基配列 的修饰物质22。所注入的修饰物质22对用探针23所捕捉到的mRNA24进行修饰。
在步骤S4，用户将检查芯片4内的溶液自样品注入口 ll排出，并用洗涤用缓冲液 对检查芯片4内进行洗涤。 在步骤S5，用户从样品注入口 ll注入电解液。此电解液包含碘以作为电解质，包
含四丙基碘化铵以作为支持电解质，以及包含将乙腈和碳酸乙烯按体积比混合成6 : 4的
有机溶剂以作为溶剂。若添加电解液则包含在电解液中的碘就溶解金属层19。 使用图11就此金属层19的溶解进行说明。图11是杂交时和电解液添加时的半
导体电极部15的示意图。 探针23通过探针23具有的硫醇基(SH基)和金属层19的金原子进行共价结合， 而被固定在金属层19上。共价结合是坚固的结合。因此，能够防止在步骤S1使其杂交的 工序以及步骤S2的进行洗涤的工序之际，探针23从金属层19剥离。 若添加电解液则包含在电解液中的碘就使由金(Au)组成的金属层19溶解，探针 23被配置在半导体层20上。由此，从借助于光源5的光照射而得以激励的修饰物质22所 产生的电子就高效率地被供给到半导体层20。 图10是表示检测装置1的检测动作过程的流程图。在用户进行了图9的流程以 后，用户将检查芯片4插入到图1所示的检测装置1的芯片插入口 3，在显示器2上指示测 定开始。 在步骤S6，被插入到检测装置1的检查芯片4的电极引线14、17、31连接到电流计 6及电源32。然后，电源32以参考电极部31作为基准在半导体电极部15上施加0V电位。
在步骤S7，光源5将激光光照射到对HPV的mRNA24进行修饰的修饰物质22，以使 修饰物质22激励。被激励的修饰物质22发生电子，所发生的电子被输送到半导体层20。 其结果，就在半导体电极部15与对极部18之间流过电流。 在步骤S8，用电流计6测定起因于步骤S5的电子移动而在半导体电极部15与对 极部18之间流过的电流。由于电流计6所测定的电流值与修饰物质22的个数具有相关性， 所以能够基于所测定的电流值来进行HPV的定量测定。 在步骤S9，首先，通过A/D变换部7经过数字变换的电流值被输入到控制部8。接 着，控制部8基于预先所作成的表示电流值与HPV量之关系的检量线，根据经过数字变换的 电流值来估算检体样品中的HPV量。然后，控制部8创建用于在显示器2上显示所估算的HPV量的检测结果画面。 在步骤SIO，由控制部8所创建的检测结果画面被发送到显示器2上并显示在显示 器2。 此外，虽然在本实施方式中被检物质是HPV的mRNA24，但还能够采用从生物体细
胞所采取的或者以人工方式所合成的核酸、蛋白质或者肽等作为被检物质。此时，探针23
只要是能够捕捉被检物质的物质即可，例如能够采用核酸、蛋白质或者肽等。 而且，虽然在本实施方式中使用了钌络化物作为修饰物质22，但只要是借助于光
源5而激励并发生电子的物质则不特别进行限定。例如可列举金属络化物、有机色素以及
量子点等。具体而言可列举出金属酞花青、钌络化物、锇络化物、铁络化物、锌络化物、9_苯
氧杂蒽类色素、花青类色素、金属花青类色素、氧杂蒽类色素、三苯甲烷类色素、吖啶类色
素、噁嗪类色素、香豆素类色素、部花青类色素、若丹菁类色素、聚甲炔类色素、吓啉类色素、
酞花青类色素、若丹明类色素、氧杂蒽类色素、叶绿素类色素、曙红类色素、汞溴红类色素、
靛蓝类色素或者硒化镉等。 另外，在本实施方式中，光源5只要是发出使修饰被检物质的物质进行激励的波 长的光的光源则不特别进行限定。例如可列举激光、发光二极管、无机场致发光元件、有机 场致发光元件、白色光源、具备光学滤波器的白色光源等。 在本实施方式中表示了在探针23捕捉到HPV的mRNA24以后，用修饰物质22对 HPV的mRNA24进行修饰的例子。也可以是用修饰物质22来修饰HPV的mRNA24，并通过探 针23捕捉HPV的mRNA24来进行HPV的mRNA24的检测。另外，在被检物质以及探针是核酸 时，还可以列举使修饰物质结合在捕捉到被检物质的探针和被检物质形成的双链核酸之间 的基于内插(Intercalation)的方法。 此外，虽然在本实施方式中使用了金作为金属层19，但金属层19只要是能够与探 针23结合的金属即可。最好是能够与探针23共价结合的金属。进而最好是能够与探针23 的硫醇基结合的金属。例如可例示金、钼、银、钯、镍、汞、铑、钌、铜或者它们的合金等。另外 虽然在本实施方式中使用了蒸镀作为使金属层19形成在半导体层20上的方法，但也能够 使用溅射、刻印、网板印刷、电镀处理或者溶胶凝胶法等来进行形成。 虽然在本实施方式中，半导体层20使用氧化钛(Ti02)，但半导体层20只要是可以 取得能够接受由修饰物质22的激励所产生的电子的能级的物质即可。例如，可列举硅、锗 等半导体、氧化钛(Ti02)、氧化铟(In203)、氧化锡(Sn02)、氧化锌(Zn0)、硒化镉(CdSe)、硫 化镉(CdS)、氮化镓(GaN)、氮化钛(TiN)等化合物半导体或者有机物半导体等。
而且虽然在本实施方式中，导电层21使用了用氧化铟锡(IT0)以及掺杂锑氧化锡 (AT0)所形成的导电层，但只要是导电性材料则不特别进行限定。例如能够列举铂、金、银、 铜等金属、导电性陶瓷或者金属氧化物等。另外，在半导体层20自身也作为导电性材料发 挥功能情况下，导电层21能够省略。 另外，虽然在本实施方式中，对极部18使用了用铂所形成的对极部，但只要是导 电性材料则不特别进行限定。例如可列举金、银、铜等金属、导电性陶瓷或者金属氧化物等。
虽然在上述本实施方式中，使用了碘作为使金属层19溶解的物质以及电解质，但 使金属层19溶解的物质和电解质也可以是不同的物质。 此外，虽然在本实施方式中探针23直接结合在金属层19上，但也可以在探针23与金属层19之间存在乙二硫醇等架桥剂。 另外，本实施方式中的检测装置l以及检查芯片4也可以按在金属层19上彼此分 离的多个区域逐个区分开来固定探针23，并对各区域单独地进行利用光源5的光照射。由 此，就可以用一个半导体电极部15测定多个样品。通过按每个区域固定多种探针，就能够 用一个检查芯片4进行多检体评价、多项目测定。 而且，虽然在本实施方式中，电源32以参考电极部31作为基准在半导体电极部15 上施加了 0V电位，但此参考电极部31可以省略。在此情况下，电源32就以对极部18作为 基准在半导体电极部15上施加0V电位。
实施例
实施例1 (针对半导体电极的金属层形成与否的研究)
〔半导体电极部的制作〕 半导体电极部是在基板上形成导电层、半导体层和金属层而制作出来。导电层是 在由二氧化硅(Si02)构成的基板上通过溅射而形成了 100nm厚度的氧化铟锡(IT0)以及 掺杂锑氧化锡(AT0)的层。半导体层是在导电层上通过溅射而形成了 10nm厚度的氧化钛 (Ti02)的层。金属层是在半导体层上通过蒸镀而形成了 10nm厚度的金薄膜的层。半导体 层通过采用包含钛或铬的半导体，使金属层与半导体层的粘合力提高。在此半导体电极部 上连接有用于与电流计进行连接的半导体电极引线。 [OO"]〔对极部的制作〕对极部是在由二氧化硅(Si02)构成的基板上通过溅射而形成了 200nm厚度的铂 薄膜来制作。在此对极部上连接有用于与电流计进行连接的对极弓|线。
〔探针的固定〕 首先，将半导体电极部浸渍在使探针分散的水溶液(探针浓度10iiM)18小时。此 探针是具有硫醇基的DNA(24base)。在进行了浸渍以后，用超纯水洗涤半导体电极部，并使 其干燥30分钟。其结果，通过探针具有的硫醇基与金属层的金原子的结合，探针就被固定 在金属层上。〔被检物质的制作〕 被检物质是使修饰物质结合于包含与探针相互补的碱基配列的DNA而制作出来。 修饰物质使用了增感色素即Pulsar650("' <才寸一 ，于夕乂 口 -一《- Y " >公司)。此 增感色素是钌络化物，使DNA肽结合于此钌络化物上。
〔被检物质与探针的杂交〕 首先，将半导体电极部的周围用硅橡胶(厚度O. 2mm)配置成为隔壁。在用此硅橡 胶所形成的空间注入10i!L杂交用溶液。此杂交用溶液使用了将利用修饰物质修饰后的 DNA(浓度10iiM)和杂交缓冲剂(Affymetrix公司)混合起来的溶液。
然后，在硅橡胶上盖上盖玻璃片，成为溶液不干燥的状态来进行杂交。此时，半导 体电极部上的探针捕捉用修饰物质修饰过的被检物质。杂交是以45t:、静置1小时使其进 行反应。杂交反应后，用洗涤用缓冲剂(WashbufferA、 Affymetrix公司)和超纯水来洗涤 半导体电极部，并用鼓风机使其干燥。
〔电解液的调制〕 电解液是将0. 6M的四丙基氯化铵(NPr4Cl)作为支持电解质盐，将0. 06M的碘作
9为电解质使其溶解在将乙腈(AN)和碳酸乙烯(EC)以体积比混合成6 : 4的溶剂中而调制。
〔光电流测定〕 将具有使被检物质和探针杂交的半导体电极部的基板周围用硅橡胶(厚度 0.2mm)配置成侧壁。在用此硅橡胶所形成的空间注入10i!L电解液。然后，从具有被填充 了电解液的半导体电极部的基板上方用具有对极部的基板进行密封。由此，就成为半导体 电极部和对极部接触于电解液的状态。 接着，将半导体电极引线和对极引线连接到电流计。然后从半导体电极部方向朝 向对极部自光源照射光。光源使用了波长473nm、强度13mW的激光光源。其结果，修饰物质 被激励，从经过激励的修饰物质所发生的电子被输送到半导体层，在半导体电极部与对极 部之间流过电流。对这一电流值进行了测定。
比较例1 比较例1除了在半导体层上形成金属层的工序以外，用与实施例1同样的方法进
行了测定。
〔结果〕 图12是表示通过实施例1以及比较例1的测定所获得的电流值的图表。在实施 例1的方法中获得了 229nA的电流值。相对于此在比较例1的方法则获得了 80nA的电流值。 根据这一事实可知通过在半导体层上形成金属层，取得约3倍的电流值，电流的 检测灵敏度提高了。 实施例2 (基于用修饰物质经过修饰的被检物质的电流测定的检测)〔半导体电极部的制作〕 用与实施例1同样的方法来制作。〔对极部的制作〕 用与实施例1同样的方法来制作。〔探针的固定〕 用与实施例1同样的方法来进行。
〔被检物质的调制〕 准备使修饰物质结合于包含与探针相互补的碱基配列的DNA的被检物质(被检物 质A)、和使修饰物质结合于不包含与探针相互补的碱基配列的DNA的被检物质(被检物质 B)作为被检物质。 修饰物质使用了作为增感色素的Pulsar650 ("、才寸 一 ，于夕乂 口 -一《- Y " >公司)。此增感色素是钌络化物，通过肽结合与DNA结合起来。
〔利用探针的被检物质的捕捉〕 用被检物质A或者被检物质B与金属层上的探针进行杂交反应。首先，将半导体 电极部的周围用硅橡胶(厚度O. 2mm)配置成隔壁。在用此硅橡胶所形成的空间注入10 ii L 杂交用溶液。此杂交用溶液使用了将利用修饰物质修饰后的DNA(浓度10iiM)和杂交缓冲 剂(Affymetrix公司)混合起来的溶液。 接着，在硅橡胶上盖上盖玻璃片，成为溶液不干燥的状态来进行杂交。杂交是以 45t:、静置1小时使其进行反应。杂交反应后，用洗涤用缓冲剂(WashbufferA、Affymetrix公司)和超纯水进行洗涤后，用鼓风机使其干燥。
〔电解液的调制〕
用与实施例1同样的方法来进行。
〔电流测定〕 将具有使被检物质A或者被检物质B与探针杂交的半导体电极部的基板周围用硅橡胶(厚度0. 2mm)配置成侧壁。在用此硅橡胶所形成的空间注入10 L电解液，并从具有填充了电解液的半导体电极部的基板上方用具有对极部的基板进行密封。由此，就成为半导体电极部和对极部接触于电解液的状态。 接着，将半导体电极引线和对极引线连接到电流计。从半导体电极部方向朝向对极部自光源照射光。此光源使用了波长473nm、强度13mW的激光光源。由此，修饰被检物质的修饰物质被激励，从经过激励的修饰物质所发生的电子被输送到半导体层，在半导体电极部与对极部之间流过电流。对这一 电流值进行了测定。 此外，为了测定来源于电极的电流值，不进行使被检物质与金属层上的探针杂交的工序地测定了电流。来源于电极的电流是指电极自身通过光照射而被激励所发生的电流。 比较例2 除了在半导体层上形成金属层的工序以外，与实施例2同样地进行被检物质的检
〔结果〕 图13是在实施例2以及比较例2所检测出的电流值的图表。 在实施例2中，在使用具有与探针相互补的碱基配列的DNA(被检物质A)进行了
杂交的情况下，所检测出的电流值是36. 3nA。 另外，在使用不具有与探针相互补的碱基配列的DNA(被检物质B)进行了杂交的情况下，电流值是24. 7nA。这一电流值与来源于电极的电流值24. 9nA同等。根据这一事实能够确认，在用被检物质A使其杂交的情况下所检测出的电流值不是通过被检物质向半导体电极部的非特异性吸附所产生的电流值，而是通过识别出配列的特异性检测所产生的电流值。 图14是表述在实施例2以及比较例2中所获得的数据之中、来源于修饰物质的电流值的图表。来源于修饰物质的电流值是指从在被检物质的测定所获得的电流值中扣除来源于电极的电流值的值。 可知来源于修饰物质的电流值，使用了包含金属层的半导体电极部的情况(实施例2) —方比使用了不包含金属层的半导体电极部(比较例2)的情况约大4. 5倍。
实施例3(使用了进行长波长激励的修饰物质的半导体电极的效果)
〔半导体电极部的制作〕 半导体电极部是在基板上形成导电层、半导体层和金属层而制作出来的。导电层是在由二氧化硅(Si02)构成的基板上通过溅射而形成了 100nm厚度的氧化铟锡(IT0)的层。半导体层是在导电层上通过溅射而形成了 10nm厚度的氧化铟(In203)的层。金属层是在半导体层上通过蒸镀而形成了 10nm厚度的金薄膜的层。在此半导体电极部上连接有用于与电流计进行连接的半导体电极引线。
接着，将所制作的半导体电极部在氧气氛中进行烧结(150°C )，以使金属层与半
导体层的粘合力提高。〔对极部的制作〕对极部是在由二氧化硅(Si02)组成的基板上通过溅射而形成了 200nm厚度的铂薄膜来制作。在此对极部上连接有用于与电流计进行连接的对极弓I线。
〔探针物质的固定〕 首先，将半导体电极部浸渍在使探针分散的水溶液(探针浓度10iiM)18小时。此探针是具有硫醇基的DNA(24base)。在进行了浸渍以后，用超纯水洗涤半导体电极部，并使其干燥30分钟。其结果，通过探针具有的硫醇基与金属层的金原子的结合，探针就被固定在金属层上。〔被检物质的制作〕 作为被检物质制作使修饰物质结合于包含与探针相互补的碱基配列的DNA的被检物质。修饰物质使用了作为有机色素的AlexaFluor750( < > e卜口 -工 >公司)。使DNA肽结合于此有机色素上。
〔被检物质与探针的杂交〕 首先，将半导体电极部的周围用硅橡胶(厚度O. 2mm)配置成为隔壁。在用此硅橡胶所形成的空间注入10i!L杂交用溶液。此杂交用溶液使用了将利用修饰物质修饰后的DNA(浓度10iiM)和杂交缓冲剂(Affymetrix公司)混合起来的溶液。
然后，在硅橡胶上盖上盖玻璃片，成为溶液不干燥的状态来进行杂交。此时，半导体电极部上的探针捕捉用修饰物质修饰后的被检物质。杂交是以45t:、静置1小时使其进行反应。杂交反应后，用洗涤用缓冲剂(WashbufferA、 Affymetrix公司)和超纯水来洗涤半导体电极部，并用鼓风机使其干燥。
〔电解液的调制〕 电解液是将0. 6M的四丙基氯化铵(NPr4Cl)作为支持电解质盐，将0. 06M的碘作为电解质使其溶解在将乙腈(AN)和碳酸乙烯(EC)以体积比混合成6 : 4的溶剂中而调制。
〔光电流测定〕 将具有使被检物质和探针杂交的半导体电极部的基板周围用硅橡胶(厚度0.2mm)以包围的方式进行配置。在用此硅橡胶所形成的空间注入10i!L电解液。然后，从具有被填充了电解液的半导体电极部的基板上方用具有对极部的基板进行密封。由此，就成为半导体电极部、对极部以及参考电极部接触于电解液的状态。 接着，在半导体电极上以参考电极的电位作为基准施加OV电位。然后从半导体电极部方向朝向对极部自光源照射光。在此光源上使用了波长785nm、强度13mW的激光光源(Cube785、^ t ^ >卜公司)。由此，修饰物质被激励，从经过激励的修饰物质所发生的电子被输送到半导体层，在半导体电极部与对极部之间流过电流。对这一电流值进行了测定。
此外，为了测定来源于电极的电流值，不进行使被检物质与金属层上的探针杂交的工序地测定了电流。来源于电极的电流是指电极自身通过光照射而激励所发生的电流。
比较例3 比较例3除了在半导体层上形成金属层的工序以外，通过与实施例3同样的操作进行了测定。
比较例4 比较例4使用硅烷偶联剂(氨丙基三乙氧基硅烷APTES)对探针DNA进行了固定。
〔半导体电极部的制作〕 半导体电极部是在基板上形成导电层、半导体层和硅烷偶联剂的薄膜层而制作出来。导电层是在由二氧化硅(Si02)组成的基板上通过溅射而形成了 100nm厚度的氧化铟锡(IT0)的层。半导体层是在导电层上通过溅射而形成了 10nm厚度的氧化铟(In203)的层。硅烷偶联剂的薄膜层是在半导体层上通过在将硅烷偶联剂(氨丙基三乙氧基硅烷APTES)以1 %的浓度溶解于甲苯的溶液中，浸渍在基板上形成了导电层和半导体层的电极而形成的层。然后在以ll(TC对电极进行了加热以后，在甲苯中反复进行三次超音波洗涤(5分钟)，通过用脱水乙醇进行洗涤将尚未结合在半导体电极表面的硅烷偶联剂除掉。这样，半导体电极部被制作出来。在此半导体电极部上连接有用于与电流计进行连接的半导体电极引线。〔对极部的制作〕 用与实施例3同样的方法来制作。〔探针物质的固定〕 使由DNA(24base)构成的探针固定在半导体层上。首先，将使探针分散的水溶液
(探针浓度100uM)禾口UV交联用的试剂(Microarraycrosslinking reaget D，Amersham)以
1 : 9的混合比进行了混合的溶液在半导体电极上滴下6iiL。之后，用UV交联剂(FS-1500、
7于- * )照射UV光(160mJ)，用超纯水进行洗涤并使其干燥10分钟。其结果，UV交联用
试剂就成为DNA与硅烷偶联剂的架桥剂，探针被固定在半导体层上。〔被检物质的调制〕 用与实施例3同样的方法来调制。〔被检物质与探针的杂交〕 用与实施例3同样的方法来进行。〔电解液的调制〕 用与实施例3同样的方法来调制。〔光电流测定〕 用与实施例3同样的方法来进行。
〔结果〕 图15是表示在实施例3、比较例3以及比较例4中所检测出的光电流值的图表。
在实施例3中，在使用具有与探针相互补的碱基配列的DNA进行了杂交反应的情况下，所检测出的光电流值是158nA。另外在仅固定了探针DNA的情况下，所检测出的光电流值是0. 082nA。据此S/N = 158/0. 082 = 1930。 在比较例3中，在使用具有与探针相互补的碱基配列的DNA进行了杂交反应的情况下，所检测出的光电流值是O. 24nA。另外在仅固定了探针DNA的情况下，所检测出的光电流值是0. 028nA。据此S/N = 0. 24/0. 028 = 8. 6。若与前述实施例3进行比较可知通过使用金属层来源于修饰物质的光电流值提高660倍，S/N比提高220倍。
此外，在比较例4中，在使用具有与探针相互补的碱基配列的DNA进行了杂交反应的情况下，所检测出的光电流值是19nA。另外在仅固定了探针DNA的情况下，所检测出的光电流值是0.021nA。据此S/N = 19/0.021 = 900。若与上述实施例3相比较，通过使用金属层来源于修饰物质的光电流值提高8倍、S/N提高2倍。在比较例4中也同样地发现来源于修饰物质的光电流值的提高和S/N的提高。 根据以上说明，若使金属层形成在半导体电极部，电流的检测灵敏度将会提高。作为电流值的检测灵敏度提高的要因，可以认为因形成金属层而使(l)DNA固定量增加(2)导电性提高(3)金属层中的等离子体激励所引起的光电变换效率的提高等。
实施例4(使用了一碱基多型(SNP)的非特异吸附的研究)
〔半导体电极部的制作〕 半导体电极部是在基板上形成导电层、半导体层和金属层而制作出来。导电层是在由二氧化硅(Si02)构成的基板上通过溅射而形成了 100nm厚度的氧化铟锡(ITO)的层。半导体层是在导电层上通过溅射而形成了 10nm厚度的氧化铟(In203)的层。金属层是在半导体层上通过蒸镀而形成了 2nm厚度的金薄膜的层。在此半导体电极部上连接有用于与电流计进行连接的半导体电极引线。
〔对极部的制作〕 对极部是在由二氧化硅(Si02)组成的基板上通过溅射而形成了 200nm厚度的铂薄膜来制作。在此对极部上连接有用于与电流计进行连接的对极弓|线。
〔探针物质的固定〕 首先，将半导体电极部浸渍在使探针分散的水溶液(探针浓度10iiM)16小时。此探针是具有硫醇基的DNA(24base)。在进行了浸渍以后，用超纯水洗涤半导体电极部，并使其干燥10分钟。其结果，通过探针具有的硫醇基与金属层的金原子的结合，探针就被固定在金属层上。〔被检物质的制作〕 作为被检物质制作使修饰物质结合于包含与探针不互补的碱基配列(仅1碱基不互补)的DNA的被检物质。修饰物质使用了作为有机色素的Alexa Fluor750 ( < > e卜口-工>公司)。使DNA肽结合于此有机色素上。
〔被检物质与探针的杂交〕 首先，将半导体电极部的周围用硅橡胶(厚度O. 2mm)配置成为隔壁。在用此硅橡胶所形成的空间注入10i!L杂交用溶液。此杂交用溶液使用了将利用修饰物质修饰后的DNA(浓度10iiM)和杂交缓冲剂(Affymetrix公司)混合起来的溶液。
然后，在硅橡胶上盖上盖玻璃片，成为溶液不干燥的状态来进行杂交。此时，半导体电极部上的探针捕捉用修饰物质修饰后的被检物质。杂交是以45t:、静置1小时使其进行反应。杂交反应后，用洗涤用缓冲剂(Wash bufferA、Affymetrix公司)和超纯水进行洗涤后，用鼓风机使其干燥。
〔电解液的调制〕 电解液是将0. 6M的四丙基氯化铵(NPr4Cl)作为支持电解质盐，将0. 06M的碘作为电解质使其溶解在将乙腈(AN)和碳酸乙烯(EC)以体积比混合成6 : 4的溶剂中而调制。
〔光电流测定〕 将具有使被检物质与探针杂交的半导体电极部的基板周围用硅橡胶(厚度0.2mm)以包围的方式进行配置。在用此硅橡胶所形成的空间注入10i!L电解液。然后，从具有被填充了电解液的半导体电极部的基板上方用具有对极部的基板进行密封。由此，就成为半导体电极部、对极部以及参考电极部接触于电解液的状态。 接着，在半导体电极上以参考电极的电位作为基准施加OV电位。然后从半导体电极部方向朝向对极部自光源照射光。在此光源上使用了波长785nm、强度13mW的激光光源(Cube785、^ t ^ >卜公司)。由此，修饰物质被激励，从经过激励的修饰物质所发生的电子被输送到半导体层，在半导体电极部与对极部之间流过电流。对这一电流值进行了测定。
此外，为了测定来源于电极的电流值，不进行使被检物质与金属层上的探针杂交的工序地测定了电流。来源于电极的电流是指电极自身通过光照射而激励所发生的电流。
比较例5 比较例5除了作为被检物质使用了与探针相互补的碱基配列的以外，通过与实施例4同样的操作进行了测定。
比较例6 比较例6除了不使被检物质杂交以外，通过与实施例4同样的操作进行了测定。
〔结果〕 图16是在实施例4、比较例5以及比较例6中所检测出的光电流值的图表。
在实施例4中，使用具有与探针不互补的碱基配列的DNA进行了杂交反应的情况下，所检测出的光电流值是1. 7nA。在比较例5中，使用具有与探针相互补的碱基配列的DNA进行了杂交反应的情况下，所检测出的光电流值是195nA。在比较例6中仅固定了探针DNA的情况下，所检测出的光电流值是O. 067nA。据此能够确认非特异地吸附在金薄膜上的DNA较少，能够配列特异地检测被检物质。
实施例5 (金薄膜的膜厚依赖性)
〔半导体电极部的制作〕 半导体电极部是在基板上形成导电层、半导体层和金属层而制作出来。导电层是在由二氧化硅(Si02)构成的基板上通过溅射而形成了 100nm厚度的氧化铟锡(ITO)的层。半导体层是在导电层上通过溅射而形成了 10nm厚度的氧化铟(In203)的层。金属层是在半导体层上通过蒸镀而形成了 0. 2nm厚度的金薄膜的层。在此半导体电极部上连接有用于与电流计进行连接的半导体电极引线。
〔对极部的制作〕 对极部是在由二氧化硅(Si02)构成的基板上通过溅射而形成了 200nm厚度的铂薄膜来制作。在此对极部上连接有用于与电流计进行连接的对极弓|线。
〔探针物质的固定〕 首先，将半导体电极部浸渍在使探针分散的水溶液(探针浓度10iiM)16小时。此探针是具有硫醇基的DNA(24base)。在进行了浸渍以后，用超纯水洗涤半导体电极部，并使其干燥10分钟。其结果，通过探针具有的硫醇基与金属层的金原子的结合，探针就被固定在金属层上。〔被检物质的制作〕 作为被检物质制作使修饰物质结合于包含与探针相互补的碱基配列的DNA的被检物质。修饰物质使用了作为有机色素的AlexaFluor750( < > e卜口 -工 >公司)。使DNA肽结合于此有机色素上。
〔被检物质与探针的杂交〕 首先，将半导体电极部的周围用硅橡胶(厚度O. 2mm)配置成为隔壁。在用此硅橡胶所形成的空间注入lOyL杂交用溶液。此杂交用溶液使用了将利用修饰物质修饰后的DNA(浓度1 ii M)和杂交缓冲剂(Affymetrix公司)混合起来的溶液。 然后，在硅橡胶上盖上盖玻璃片，成为溶液不干燥的状态来进行杂交。此时，半导体电极部上的探针捕捉用修饰物质修饰后的被检物质。杂交是以45t:、静置1小时使其进行反应。杂交反应后，用洗涤用缓冲剂(WashbufferA、 Affymetrix公司)和超纯水进行洗涤后，用鼓风机使其干燥。
〔电解液的调制〕 电解液是将0. 6M的四丙基氯化铵(NPr4Cl)作为支持电解质盐，将0. 06M的碘作为电解质使其溶解在将乙腈(AN)和碳酸乙烯(EC)以体积比混合成6 : 4的溶剂中而调制。
〔光电流测定〕 将具有使被检物质与探针杂交的半导体电极部的基板周围用硅橡胶(厚度0.2mm)以包围的方式进行配置。在用此硅橡胶所形成的空间注入10i!L电解液。然后，从具有被填充了电解液的半导体电极部的基板上方用具有对极部的基板进行密封。由此，就成为半导体电极部、对极部以及参考电极部接触于电解液的状态。 接着，在半导体电极上以参考电极的电位作为基准施加OV电位。然后从半导体电极部方向朝向对极部自光源照射光。在此光源上使用了波长785nm、强度13mW的激光光源(Cube785、^ t ^ >卜公司)。由此，修饰物质被激励，从经过激励的修饰物质所发生的电子被输送到半导体层，在半导体电极部与对极部之间流过电流。对这一电流值进行了测定。
进而，在半导体电极部的制作中，关于金薄膜的厚度改变成lnm、2nm以及5nm时的电流值都与上述同样地进行了测定。 此外，为了测定来源于电极的电流值，不进行使被检物质与金属层上的探针杂交的工序地测定了电流。来源于电极的电流是指电极自身通过光照射而激励所发生的电流。
〔结果〕 图17是在实施例5中所检测出的各膜厚下的S/N比的图表。可知在金薄膜为lnm时，获得最好的S/N比。 另外，在金薄膜的厚度大于等于5nm时，金薄膜将会通过洗涤工序而从半导体层剥离。因此，在金薄膜的厚度大于等于5nm时，就需要使用包含钛或铬的半导体层(实施例1以及2)，或者使用进行了烧结处理的半导体层(实施例3)，以使金薄膜与半导体层的粘合力提高。
权利要求
一种检查芯片，用来检测利用通过光激励而产生电子的修饰物质修饰过的被检物质，其特征在于包括具备被形成在半导体层上的金属层的半导体电极部；捕捉被检物质的被固定在上述金属层上的探针；以及具备导电层的对极部。
2. 按照权利要求1所记载的检查芯片，其特征在于 上述金属层由通过电解液而溶解的金属组成。
3. 按照权利要求2所记载的检查芯片，其特征在于 上述电解液包含碘或者碘化物。
4. 按照权利要求1 3中任意一项所记载的检查芯片，其特征在于 上述金属层由与上述探针进行化学吸附的金属组成。
5. 按照权利要求4所记载的检查芯片，其特征在于 与上述探针进行化学吸附的金属是金。
6. 按照权利要求4所记载的检查芯片，其特征在于 上述探针具有硫醇基作为与上述金属层进行化学吸附的结合基。
7. —种检测装置，用来检测利用通过光激励而产生电子的修饰物质修饰过的被检物 质，其特征在于包括以可受纳检查芯片的方式而构成的检查芯片受纳部，其中该检查芯片包括具备被形 成在半导体层上的金属层的半导体电极部；捕捉被检物质的被固定在上述金属层上的探 针；和具备导电层的对极部；对修饰物质进行光激励的光源，该修饰物质对上述检查芯片受纳部中所插入的上述检 查芯片内的被检物质进行修饰；以及电流测定部，测定通过上述光源的光激励而从正在对被检物质进行修饰的修饰物质流 出的电流。
8. 按照权利要求7所记载的检测装置，其特征在于 上述光源发出对正在修饰被检物质的修饰物质进行激励的波长的光。
9. 一种检测方法，用来检测利用通过光激励而产生电子的修饰物质修饰过的被检物 质，其特征在于包括以下步骤在包括具备被形成在半导体层上的金属层的半导体电极部；捕捉被检物质的被固定在 上述金属层上的探针；和具备导电层的对极部的检查芯片上应用包含被检物质的样品，由 此用被固定在上述金属层上的上述探针来捕捉被检物质；将修饰物质导入到被检物质；照射对修饰物质进行激励的光；以及检测从激励后的修饰物质所产生的电流。
10. 按照权利要求9所记载的检测方法，其特征在于还包括 在上述半导体电极部和上述对极部之间添加用于使电流流过的电解质媒体。
全文摘要
本发明提供一种能够使被检物质的检测灵敏度提高的用于检测被检物质的检查芯片。该用于检测被检物质的检查芯片包括具备被形成在半导体层上的金属层的半导体电极部；捕捉被检物质的被固定在上述金属层上的探针；以及具备导电层的对极部。
文档编号C12Q1/68GK101726528SQ200910205180
公开日2010年6月9日 申请日期2009年10月16日 优先权日2008年10月31日
发明者岩永茂树, 桐村浩哉 申请人:希森美康株式会社