专利名称：：一种恒化器连续培养装置及其筛选琥珀酸突变菌的方法
技术领域：
：本发明属于工业生物化工领域，具体涉及一种恒化器连续培养装置，还涉及应用该装置筛选微生物的方法。
背景技术：
：琥珀酸(又称丁二酸)作为重要的碳四平台化合物，被广泛应用于医药、食品行业，农业生产以及化学工业等领域中。目前处于研究与开发阶段的以丁二酸为基础的中间化学制品主要包括l，4-丁二醇(BD0)、^_丁内酯、四氢呋喃、^甲基吡咯烷酮(NMP)、己二酸、苹果酸以及新型的生物降解塑料产品聚丁二酸丁二醇酯(PBS)。传统生产方法采用丁烷经顺丁烯二酸酐通过电解生产，污染大，成本高，严重抑制了琥珀酸的发展潜力。生物法制备琥珀酸，原料成本低廉，生产过程绿色环保，实现了资源的循环利用，对缓解当今社会能源短缺和环境污染具有重大战略意义(A卯lMicrobialBiotechnol，51:525545，1999)。目前，生物法生产琥珀酸和它大多数衍生物的合成还处在进一步研究和开发阶段。生物法制备琥珀酸的微生物主要有从牛瘤胃中筛选出的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)禾口基因工程构建的大肠杆菌(Esherichiacoli)，提高微生物发酵琥珀酸的产量、降低琥珀酸发酵成本并最终实现发酵法大工业生产琥珀酸，除了优化发酵工艺之外，关键在于对产琥珀酸微生物进行改良，以期获得能够利用多种可再生碳源、廉价无机氮源、易培养、高转化率、高生产强度的突变菌株(MetabEng，8(3):209226,2006)。恒化器即通过控制某一种营养物浓度(如碳、氮源、生长因子等)，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行连续生长繁殖。当多种微生物在同一反应器中混合连续培养时，各种微生物竞争利用限制性基质，从而具有优势的微生物得以保留，不具优势者则被洗掉而淘汰。当某一种微生物在连续培养时发生变异，则原出发菌与变异菌之间发生竞争。若变异菌较原出发菌具有优势，则反应器中最终保留变异菌。于是在反应器中提供某一特定的生长环境，通过连续长时间的不断驯化培养则有可能筛选到在该特定条件下生长的某目的突变菌。虽然可实现连续培养的设备很多，但是当利用连续培养法筛选微生物时，则对连续培养装置有着特殊的苛刻要求，如需要长时间的无染菌连续操作。现有文献报道多采用常规发酵罐(AppiMicrobiolBiotechnol，16:119122，1982;Currgenet，21:191196，1992;ApplMicrobiolBiotechno1，67:827837，2005)，或者需要经过特殊烧制的反应器(过程工程学报，2(5):415420，2002)进行连续培养驯化。由于一般需要长时间的连续培养，不仅有设备占用期长，耗电大，耗气多等缺点，且有设备昂贵、特殊、不易应用和操作易染菌等问题，严重阻碍了该技术的深入发展和应用。
发明内容本发明的技术目的在于提供一种筛菌用的恒化器连续培养装置，该装置器材简单，不需额外的特殊设备，不需搅拌装置，组装容易，使用方便，且设备小，耗电少，耗气少，密封性能好不易染菌；本发明还提供基于该装置筛选产琥珀酸突变菌的方法，该方法不仅操作简单，持续稳定，且可实现长时间的连续培养。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案是—种恒化器连续培养装置，包括酸碱pH调控系统、补料系统、反应系统、出料及取样系统和进气系统，反应系统设置有反应池，它分别与酸碱pH调控系统、补料系统、出料及取样系统和进气系统通过连接管相通，且反应池的瓶口采用的是密封装置。本发明所述的反应池是四口烧瓶，其大口用来连接酸碱pH调控系统设置的pH调控装置，其小口A和B设置有三通，小口A三通中的一个连接口与酸碱pH调控系统设置的酸碱储液罐相通，由酸碱pH调控系统设置的反馈蠕动泵和pH调控装置控制，另一个连接口与补料系统连接；小口B三通中的两个连接口分别与出料及取样系统设置的废液池和封口碱液罐相通；小口C的底部与反应系统设置的气体导入管相连，上部与进气系统连接。本发明所述的恒化器连续培养装置，其特征在于所述的补料系统设置有蠕动泵，该蠕动泵与反应池小口A三通中的一个连接口连接，并与补料储液瓶相通。本发明所述的出料及取样系统还包括取样管，该取样管是连接在小口B三通上的软管，其前后口由止动阀夹住。本发明所述的连接管是通过经高压灭菌的不透气软管。本发明所述的反应池瓶口采用密封装置是经高压灭菌的塑料软塞。—种使用本发明所述的恒化器连续培养装置筛选产琥珀酸突变菌的方法，其步骤为(1)制备培养基A、B、C，其中培养基B为限制单一碳源，培养基C为平板培养基；(2)培养基A加料至反应池中，后将培养好的2X10X接种量的第二代种子液转接入到反应池，装液量100250mL，304(TC间隙发酵610h至对数末期后，开始由补料系统中的蠕动泵以0.010.5h—1流加补料新鲜培养基B，同时C02气体以0.11.0L/min由进气系统进入反应池底部，发酵液经反应池中液位控制管在气体压力下自动压出进入废液池。装液量在100250mL之间，气体经进气管至反应液底下能带动反应液的翻滚，从而减少了额外的搅拌系统，使得整个装置更加简单可行。培养基B中限制单一碳源葡萄糖的添加量，使其始终作为生长限制因子，以达到控制培养液流速保持不变的目的，并使微生物始终在低于其最高生长速率下连续生长繁殖，补料新鲜培养基B中其他成分都保持过量。(3)检测连续培养过程中，每1015h取样检测发酵液的各项参数，并每514d后无菌取样，稀释适当倍数后涂布到培养基C平板，厌氧培养15d，判断优良菌株；其中流加补料新鲜培养基B由反应液体系中生长限制因子的浓度和菌体生物量的变化综合考虑，不断调试稀释速率大小，直至反应体系达到拟稳定状态。拟稳定状态定义为每1015h取样检测发酵液的各项参数，连续三次取样参数基本一致时认为反应体系达到拟稳定状态。为了易于判断目的突变菌株的出现，生长限制因子并不是让其被完全耗掉，而是让其有所剩余并维持在一个较低的范围。在拟稳态连续培养中，当生长限制因子浓度下降说明菌体生长速率加快，暗示目的突变菌株有可能出现。(4)通过菌株生长的快慢，菌落形态的大小，以及产生的变色圈大小来判断是否为优良菌株，挑取优良菌株转接至发酵培养B，在100mL血清瓶，装液量3050mL，3040°C，摇床培养2040h，离心后取上清液做进一步发酵性能的检测，挑取发酵性能好，产琥珀酸高的菌株作遗传稳定性实验，最后冷冻保藏。本发明所述的方法包括筛选琥珀酸放线菌或琥珀酸大肠杆菌。本发明所述的培养基A:葡萄糖1020g/L，K2HP043H2015.531g/L，NaH2P042H209.619.2g/L，NaHC031020g/L，酵母膏510g/L，玉米桨510g/L，pH6.57.2;培养基B:葡萄糖1020g/L，乙酸钠l.362.72g/L，NaCl12g/L，CaCl20.20.4g/L，MgCl20.20.4g/L，Na2HP040.310.62g/L，NaH2P04l.63.2g/L，K2HP0436g/L，酵母膏010g/L，NH4HC03428g/L，C4H404Na20200g/L，CH3COONa3H200180g/L，pH7.09.0;培养基C:葡萄糖1020g/L，K2HP043H2015.531g/L，NaH2P042H209.619.2g/L，NaCl1.02g/L，玉米桨510g/L，酵母膏010g/L，NH4HC03824g/L，琼脂粉20g/L，溴百里香酚蓝0.050.2g/L，pH7.07.2;本发明所述的检测中的取样，是将取样管的管口伸入封口碱液罐的液面以下，取样时夹住出料口软管，打开取样口软管，将反应池整体向取样口方向倾斜一小角度，则有一定量发酵液被气体压入取样管。由此每次取样都是来自反应池的及时样液且取样体积基本一定，取样口不存在被堵住的问题并解决了需要事先放液的麻烦进而保证了反应体积的恒定。本发明提供的利用恒化器连续培养筛选产琥珀酸突变菌的方法，其中长时间的连续培养，需要频繁地更换补料瓶，常规方法是在酒精火焰上方有效区域中更换补料瓶，但是这在实际操作中并不容易且存在很大的偶然性，一不小心就会染上杂菌。本发明中改为在20%50%的氢氧化钠强碱溶液中操作，则染菌几率大为减少。本发明的有益效果1、本发明装置中的所有构成部分都来自于常规实验器材，无需特别的设备，组装容易，操作简单。2、本发明装置设备小，耗电小，耗气少，密封性能好不易染菌。3、本发明装置出料由气体压力自动压出，保证反应体系体积恒定的同时节省了蠕动泵的使用，使得整个装置更加简单。4、本发明装置取样系统保证了取样料液新鲜及时且每次取样体积适当，从而维持了反应体系的稳定。5、利用本发明装置及方法筛选到耐铵型突变菌，在高浓度铵离子培养基(添加28g/LNH4HC03)中琥珀酸产量达33g/L，对初始葡萄糖收率达73%。6、利用本发明装置连续培养筛选到不依赖于有机氮源酵母膏，可利用无机氮源铵盐的突变菌，在以NH4HC03做唯一氮源培养基中发酵，琥珀酸产量达31g/L，对初始葡萄糖收率达69%。7、利用本发明装置连续培养筛选到耐有机酸的产琥珀酸突变菌，在高浓度有机酸培养基中发酵，琥珀酸产量达32.49g/L，对初始葡萄糖收率达72.2%。图1本发明的恒化器连续培养装置结构示意图其中，1-酸碱pH调控系统，2-补料系统，3-反应系统，4-出料及取样系统，5_进气系统，6_蠕动泵，7_补料储液瓶，S-反应池，9_进气导入管，10-液位控制管，11-封口碱液罐，12-废液池，13-止动阀，14-橡胶软塞，15-玻璃三通，16-pH调控装置，17-酸碱液储罐。具体实施例方式—种恒化器连续培养装置，它包括酸碱pH调控系统1、补料系统2、反应系统3、出料及取样系统4和进气系统5，反应系统3设置的反应池8，它分别与酸碱pH调控系统1、补料系统2、出料及取样系统4和进气系统5通过连接管相通，且反应池8的瓶口采用密封装置，连接管是通过经高压灭菌的不透气软管。反应池8是四口烧瓶，瓶口采用密封装置是经高压灭菌的塑料软塞，其大口用来连接酸碱pH调控系统1设置的pH调控装置16，其小口A和B都设置有三通，小口A三通中的一个连接口与酸碱pH调控系统1设置的酸碱储液罐17相通，由酸碱pH调控系统1设置的PH反馈蠕动泵和pH调控装置16在线控制，另一个连接口与补料系统2设置的补料储液瓶7连接，由补料系统2设置的蠕动泵6控制；小口B三通中的两个连接口分别与出料及取样系统4设置的废液池12和封口碱液罐11相通，出料及取样系统4还包括取样管，该取样管是一软管连接小口B的三通上，其前后口由止动阀13夹住；小口C的底部与反应系统3设置的气体导入管9相连，上部与进气系统5连接。以下实施例的HPLC的条件为高效液相(Ultimate3000，Dionex，America;Alltech反相Prevail有机酸色谱柱；流动相25mmol/LKH2P04;pH:2.5;流动相流速lmL/min;紫外检测波长:215nm;进样量20yL;柱温为25°C)。实施例1本实施例以产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)NJ113，保藏号CGMCC1716为出发菌株，在本发明所述恒化器中连续培养筛选耐受高浓度铵离子的突变菌为例培养基A(g/L):葡萄糖10，K2HP043H2015.5，NaH2P042H209.6，NaHC03lO，酵母膏5，玉米浆5，pH7.2。培养基B(g/L):葡萄糖20(生长限制因子)，乙酸钠1.36，NaCl1，CaCl20.2，MgCl20.2，Na2HP040.31，NaH2P04l.6，1(21^043，酵母膏10，NH4HC034、8、16、24、28，C4H404Na20，CH3C00Na3H200，pH9.0。培养基C(固体平板培养基)(g/L):葡萄糖10，K2HP043H2015.5，NaH2P042H209.6，NaCl1.0，玉米桨5，酵母膏5，NH4HC0324，琼脂粉20，溴百里香酚蓝0.1(p朋.07.6黄变蓝)，pH7.0。采用本发明装置，连续培养产琥珀酸放线杆菌，筛选耐受高浓度铵离子的突变菌株，发酵参数为装液量250mL，二代种子液接种量2%，间歇发酵6h后，流加补料新鲜培养基，种子培养基、间歇培养基采用培养基A，pH7.0，补料培养基采用培养基B，pH9.0，其中逐渐提高朋4110)3浓度，充无菌100%0)2，流速1.0L/min，温度40。C，20XNaOH在线调控p朋.8。稀释率在0.08610.5h—1之间按实际情况调节，残糖减少且生物量0D66。相应增大则提高稀释率，残糖增多且0D66。减少则降低稀释率，直至达到拟稳态平衡，平衡判断标准每隔10h取样一次，当连续三次取样葡萄糖和0D66。数值基本不变时可认为达到拟稳态平衡。当培养基B中NH4HC03浓度提高到20g/L以上后，菌株仍生长良好(残糖减少，0D,增大)则认为有可能产生耐受高浓度铵离子的突变菌，每8d无菌取样稀释适当倍数后涂布固体平板培养基，厌氧(K:h2:co2=8:i:i)培养id，从中挑取生长旺盛，变色圈大的菌落接种于培养基B(添加20-28g/LNH4HC03，pH7.0)于lOOmL血清瓶，装液量30mL，40°C，200rpm摇床培养40h，8000r/min离心lOmin后取上清液HPLC检测菌株发酵产琥珀酸性能。挑取到的部分优良突变菌株和出发菌株产酸性能比较见表1。表1部分突变菌株与A.succinogenesNJ113产酸情况比较a<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>a-在含28g/LNH4HC03和初糖45g/L发酵培养基中培养40h发酵结果，各数据为三个平行实验的平均值.b-在相同条件下，出发菌株NJ113不能生长，产物未进行HPLC分析检测。由表1数据可以看出，与出发菌株相比，突变菌株对铵离子的耐受性得到极大的提高，四个突变菌株在含高浓度铵离子培养基中生长和产琥珀酸均不受抑制，其中以突变菌株YZ0819效果最为突出。最后甘油冷冻保藏YZ0819作为后续研究用菌株。实施例2本实施例的实施步骤和实施例1相同，改变相关参数条件，以产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1716为出发菌株，在本发明所述恒化器中连续培养筛选能够利用无机氮源的突变菌为例培养基A:葡萄糖20g/L，K2HP043H2031g/L，NaH2P042H2019.2g/L，NaHC0320g/L，酵母膏10g/L，玉米浆10g/L，pH6.5;培养基B:葡萄糖10g/L，乙酸钠2.72g/L，NaCl2g/L，CaCl20.4g/L，MgCl20.4g/L，Na2HP040.62g/L，NaH2P043.2g/L，K2HP046g/L，酵母膏5，2.5，Og/L，NH4HC034、8g/L，C4H404Na2100，CH3C00Na3H2080，pH7.0;培养基C:葡萄糖20g/L，K2HP043H2031g/L，NaH2P042H2019.2g/L，NaCl2g/L，玉米浆10g/L，酵母膏10g/L，NH4HC0316g/L，琼脂粉20g/L，溴百里香酚蓝0.05g/L，pH7.2;采用本发明装置，连续培养产琥珀酸放线杆菌，筛选耐受高浓度铵离子的突变菌株，发酵参数为装液量lOOmL，二代种子液接种量10%，间歇发酵10h后，流加补料新鲜培养基，种子培养基、间歇培养基采用培养基A，补料培养基采用培养基B，pH7.0，其中逐渐减少有机氮源酵母膏的量直至0g/L，同时相应提高无机氮源NH4HC03浓度至8g/L，充无菌100%0)2，流速0.5L/min，温度30°C，50%NaOH在线调控pH6.8。稀释率在0.010.223h—1之间按实际情况调节，残糖减少余且生物量0D66。相应增大则提高稀释率，残糖增多且0D66。减少则降低稀释率，直至达到拟稳态平衡，平衡判断标准每隔15h取样一次，当连续三次取样葡萄糖和0D66。数值基本不变时可认为达到拟稳态平衡。当培养基B中有机氮源酵母膏的量减少到Og/L，主要氮源为无机氮源后，菌株仍生长良好(无葡萄糖积累，OD,大)则认为产生能够利用无机氮源的突变菌，每14d无菌取样稀释适当倍数后涂布固体平板培养基，厌氧(K:h2:co2=8:i:i)培养5d，从中挑取生长旺盛，变色圈大的菌落接种于培养基B(0g/L酵母膏，8g/LNH4HC03，pH7.0)于100mL血清瓶，装液量50mL，30°C，150rpm摇床培养20h，10000r/min离心15min后取上清液HPLC检测菌株发酵产琥珀酸性能。挑取到的部分优良突变菌株和出发菌株产酸性能比较见表2。表2部分突变菌株与A.succinogenesNJ113产酸情况比较a菌株编号生物量浓度乙酸琥珀酸琥珀酸对初糖收率(gdrywt/L)(g/L)(g/L)(%)NJU3b0.085---YZ063,4158.8330.2167.1YZ123.7510.7531.2469.4YZ283.2149.5227.6161.4a-在以8g/LNH4HC03做唯一氮源，初糖45g/L发酵培养基中培养20h发酵结果，各数据为三个平行实验的平均值.b-在相同条件下，出发菌株NJ113不能生长，产物未进行HPLC分析检测。由表2数据可以看出，与出发菌株相比，突变菌株能够在以NH4HC03做唯一氮源发酵培养基中正常生长产酸，其中以突变菌株YZ12效果最为突出。最后甘油冷冻保藏YZ12作为后续研究用菌株。实施例3本实施例以E.coliNZN111(F-Apfl::Cam，ldhA::Kan)/pTrc99a-sfcA为出发菌株，在本发明所述恒化器中连续培养筛选耐受有机酸的突变菌为例培养基A(g/L):葡萄糖15，K2HP043H2023.5，NaH2P042H2014.6，腿〇0315，酵母膏8，玉米浆7，pH6.8。培养基B(g/L):葡萄糖15(生长限制因子)，乙酸钠2.13，NaCl1.5，CaCl20.3，MgCl20.3，Na2HP040.45，NaH2P042.8，K2HP045，酵母膏5，NH4HC038，C4H404Na2200，CH3C00Na*3H20180，pH8.0。培养基C(固体平板培养基)(g/L):葡萄糖15，K2HP043H2023.2，NaH2P042H2014.6，NaCl1.5，玉米桨7，酵母膏8，NH4HC0320，琼脂粉20，溴百里香酚蓝0.15(p朋.07.6黄变蓝)，pH7.1。采用本发明装置，连续培养E.coliNZNlll，筛选耐受有机酸的突变菌株，发酵参数为装液量150mL，二代种子液接种量6%，间歇发酵8h后，流加补料新鲜培养基，种子培养基、间歇培养基采用培养基A，pH7.0，补料培养基采用培养基B，pH8.5，其中逐渐提高C4H404Na2和CH3C00Na*31120浓度，充无菌100%0)2，流速0.1L/min，温度37°C，25%NaOH在线调控p朋.8。稀释率在0.18610.353h—1之间按实际情况调节，残糖减少且生物量0D66。相应增大则提高稀释率，残糖增多且0D66。减少则降低稀释率，直至达到拟稳态平衡，平衡判断标准每隔12h取样一次，当连续三次取样葡萄糖和0D66。数值基本不变时可认为达到拟稳态平衡。当培养基B中C4H404Na^PCH3C00Na*31120浓度分别提高到90g/L和60g/L以上后，菌株仍生长良好(残糖减少，OD,增大)则认为有可能产生耐受高浓度有机酸的突变菌，每5d无菌取样稀释适当倍数后涂布固体平板培养基，厌氧(n2:h2:co2=8:i:i)培养3d，从中挑取生长旺盛，变色圈大的菌落接种于培养基B于lOOmL血清瓶，装液量40mL，37°C，200rpm摇床培养32h，8000r/min离心lOmin后取上清液HPLC检测菌株发酵产琥珀酸性能。挑取到的部分优良突变菌株和出发菌株产酸性能比较见表3。表3部分突变菌株与E.coliNZN111产酸情况比较a齒株编号生物量浓度S琥珀酸琥珀酸对初糖收率(gdiywt/L)(g/L)(g/L)(%)￡co/'-NZNlllb1.1824.7910.2722.8YZ11-093.558.4732.4972.2YZ11-813.7810.8532.2671.7YZ11-563.49811.1529.7866.2a-在含90g/LC4H404Na2、80g/LCH3C00Na3H20和初糖45g/L发酵培养基中培养32h发酵结果，各数据为三个平行实验的平均值.b-在相同条件下，出发菌株E.coliNZNlll不能生长，产物未进行HPLC分析检测。由表3数据可以看出，与出发菌株相比，突变菌株对丁二酸和乙酸的耐受性得到极大的提高，三个突变菌株在含高浓度有机酸培养基中生长和产琥珀酸均不受抑制，其中以突变菌株YZ11-09效果最为突出。最后甘油冷冻保藏YZ11-09作为后续研究用菌株。权利要求一种恒化器连续培养装置，其特征在于包括酸碱pH调控系统(1)、补料系统(2)、反应系统(3)、出料及取样系统(4)和进气系统(5)，所述的反应系统(3)设置的反应池(8)，分别与酸碱pH调控系统(1)、补料系统(2)、出料及取样系统(4)和进气系统(5)通过连接管相通，且反应池(8)的瓶口采用密封装置。2.根据权利要求1所述的恒化器连续培养装置，其特征在于所述的反应池(8)是四口烧瓶，其大口用来连接酸碱pH调控系统(1)设置的pH调控装置(16)，其小口A和B设置有三通，小口A三通中的一个连接口与酸碱pH调控系统(1)设置的酸碱储液罐(17)相通，由酸碱pH调控系统(1)设置的pH反馈蠕动泵和pH调控装置(16)在线控制，另一个连接口与补料系统(2)设置的补料储液瓶(7)连接，由补料系统(2)设置的蠕动泵(6)控制；小口B三通中的两个连接口分别与出料及取样系统(4)设置的废液池(12)和封口碱液罐(11)相通；小口C的底部与反应系统(3)设置的气体导入管(9)相连，上部与进气系统(5)连接。3.根据权利要求1或2所述的恒化器连续培养装置，其特征在于所述的补料系统(2)设置有蠕动泵(6)，蠕动泵(6)与小口A三通中的一个连接口连接，并与补料储液瓶(7)相通。4.根据权利要求1或2所述的恒化器连续培养装置，其特征在于所述的出料及取样系统(4)还包括取样管，该取样管是连接小口B三通上的软管，其前后口由止动阀(13)夹住。5.根据权利要求1或2所述的恒化器连续培养装置，其特征在于所述的连接管是经高压灭菌的不透气软管。6.根据权利要求1或2所述的恒化器连续培养装置，其特征在于所述的反应池(8)瓶口采用密封装置是经高压灭菌的塑料软塞。7.—种使用权利要求1所述的恒化器连续培养装置筛选产琥珀酸突变菌的方法，其步骤为(1)制备培养基A、B、C，其中培养基B为限制单一碳源，培养基C为平板培养基；(2)培养基A加料至反应池(8)中后将培养好的2%10%接种量的第二代种子液转接入到反应池(8)，装液量100250mL，3040°C间隙发酵610h至对数末期后，开始由补料系统中的蠕动泵以0.010.5h—1流加补料新鲜培养基B，同时C02气体以0.11.0L/min由进气系统(5)进入反应池(8)底部，发酵液经反应池(8)中液位控制管在气体压力下自动压出进入废液池(12);(3)连续培养过程中，每1015h取样检测发酵液的各项参数，并每514d后无菌取样，稀释适当倍数后涂布到平板培养基C，厌氧培养15d，判断优良菌株；(4)挑取优良菌株转接至发酵培养基B，在血清瓶，装液量3050mL，3040°C，摇床培养2040h，离心后，取上清液做进一步发酵性能的检测，挑取发酵性能好，产琥珀酸高的菌株作遗传稳定性实验，最后冷冻保藏。8.根据权利要求7所述的筛选产琥珀酸突变菌的方法，其特征在于所述的方法包括筛选琥珀酸放线菌或琥珀酸大肠杆菌。9.根据权利要求7所述的筛选产琥珀酸突变菌的方法，其特征在于所述的培养基A:葡萄糖1020g/L，K2HP043H2015.531g/L，NaH2P042H209.619.2g/L，NaHC031020g/L，酵母膏510g/L，玉米桨510g/L，pH6.57.2;培养基B:葡萄糖1020g/L，乙酸钠1.362.72g/L，NaCl12g/L，CaCl20.20.4g/L，MgCl20.20.4g/L，Na2HP040.310.62g/L，NaH2P041.63.2g/L，K2HP0436g/L，酵母膏010g/L，NH4HC03428g/L，C4H404Na20200g/L，CH3C00Na3H200180g/L，pH7.09.0;培养基C:葡萄糖1020g/L，K2HP04*3H2015.531g/L，NaH2P04*2H209.619.2g/L，NaCl1.02g/L，玉米桨510g/L，酵母膏010g/L，NH4HC03824g/L，琼脂粉20g/L，溴百里香酚蓝0.050.2g/L，pH7.07.2;10.根据权利要求7所述的筛选产琥珀酸突变菌的方法，其特征在于检测中的取样，是将取样管的管口伸入封口碱液罐(11)的液面以下，取样时夹住出料口软管，打开取样口软管，将反应池(8)整体向取样口方向倾斜一小角度，则有一定量发酵液被气体压入取样管。11.根据权利要求7所述的筛选产琥珀酸突变菌的方法，其特征在于补料瓶的所有操作都是在20%50%的氢氧化钠溶液里进行。全文摘要本发明涉及一种恒化器连续培养装置，其特征在于包括酸碱pH调控系统、补料系统、反应系统、出料及取样系统和进气系统，所述的反应系统包括反应池，它分别与酸碱pH调控系统、补料系统、出料及取样系统和进气系统通过连接管相通，且反应池的瓶口采用的是密封件。本发明还涉及一种使用本发明所述的恒化器连续培养装置筛选产琥珀酸突变菌的方法。本发明所述的装置器材简单，不需额外的特殊设备，不需搅拌装置，组装容易，使用方便，且设备小，耗电少，耗气少，密封性能好不易染菌；而本发明所述的方法不仅操作简单，持续稳定，且可实现长时间的连续培养。文档编号C12M1/00GK101709263SQ200910212709公开日2010年5月19日申请日期2009年10月30日优先权日2009年10月30日发明者叶贵子,姜岷,李建,欧阳平凯,陈可泉,韦萍,马江峰申请人:南京工业大学