一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法

专利名称：：一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属于生物制药领域,涉及-一种疫两及其制备方法，特别涉及-一种手足U病单、双价灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
：手足口病是由小RNA病毒科，肠道病毒属病毒引起的，现己成为危害婴幼儿健康和公共卫生安全的重要传染病。手足口病由柯萨奇病毒A4，A5，A9，Al.O，A16'B2，:B5和肠道病毒71等型别的肠道病毒引起，但主要由肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒16型(Cox.A1.6)引起。本病最普遍的特征是先颊粘膜出瘆，然后很快在手和足部出现。感染EV71和Cox.A16所引起的临床症状，如手足U病、疱疹性咽峡炎，在临床上难于区别。感染EV71常常并发严重的神经炎症，包括病毒性脑膜炎，脑炎，以及类似小儿麻痹的瘫痪，引起的肺水肿、肿出血经常导致婴幼儿的快速死亡。Cox.Ai6是引起心肌炎、心包炎、心肌病及其它严重疾病的重要病原。EV71病毒是1969年首次从美国加利福尼亚州患有中枢神经系统疾病的婴儿患者的粪便标木巾分离出来的。自1974年Schmidt，Lennette，Ho首次报道以来，EV71已在世界范围内引起十多次爆发与流行。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区猖獗，R本、新加坡、马来西亚均有大规模爆发的报道,不仅发病人数多，而且死亡病例多。1.998年屮国台湾地区EV71大爆发，发病129106例，旦:中，405例为严重的中枢神经系统感染，死T、-:78人。2000年，2001年台湾地区又接连爆发手足口病，其中2000年，发病80677例，死亡'11人。中国大陆地区于i98i年由上海首次报道手足口病，此后，北京、山东、广东等十几个省份均有本病暴发流行的报道。2()()7年山东临沂等地区发生手足口病流行，发病39606例，死亡14例。2007年，中国内地共报告手足口病病例83344例，死亡17例。2008年3月安徽阜阳等地区开始爆发手足口病，至5月已发病6049例，353例重症病例，死亡22例，同时，自2008年5月2R起，卫生部将手足口病纳入丙类法定传染病管理。2008年全年，中国内地共报告手足n病病例4.88955例，死亡126例。2009年手足n病疫情仍在屮国大陆不断蔓延。流行病学资料显示，Cox,A16—般和EV71相伴流行，在流行过程中，考虑到Cox,M6多导致无症状感染，nj能在流行中所占实际比例更高。台湾地区1998，1999，2000年肠道病毒感染中EV7丄所占的比例分别为44.4%，2,0%，20,5%，Cox,Ai6所占的比例分别为18.2%，1.7%，18%。2()()8年安徽阜阳手足口病疫情发生后，中闺疾病预防控制中心在全国范围内病例标本的实验室检测结果显示，在582个手足口病病例阳性标本中，EV71占54,5%,Cox,A16占17,4%。监测数据显示，EV71和Cox,A16传播流行模式均是人规模爆发后随之几年静止期。由EV71或Cox.A16引起的手足n病反复爆发可能是新的某因型在世界范围内传播所致。对1970-2004年全球EV71分离株的分子流行病学分析显示，EV71病毒分为3个基因型，即A，B，C型，8个基因亚型，即B1-B'l和C1-01亚型。EV71的基因亚型与分离地区和分离时间有---------定的关联。对1983-2003年福岛地区(Fukush丄ma，Japan)EV7丄和Cox,A丄6分4离株的系统发生重建证实，EV71分离株在基因特征上可分为8个不同组群(Bl'B2-3,B4，Cl，C2，C3，B5,C4)，B1、C-U1、C-U2、C-2、:B-'1、C-'1、B-5分别与1984、1987、1990、1993、1997、2000、2003年与EV7i相关手足口病爆发有关；对Cox,Ai6分离株进行遗传重建显示，Cox,A16分离株形成了3个不同的遗传簇(A，B，C)，A、B、C组群分别和1984-1994年(1985和1991年爆发)，1987-1998(1988和1998年爆发)，1995-2003(1995和2002年爆发)流行相关，且在福岛地区每次手足口病爆发中分离到的EV71和Cox.A1.6病毒株与日木其它地区和其它国家同期分离到的EV71病毒株属于同--个组群。在中国台湾地区，1998年之前EV71主要流行Bl亚型，1998年大爆发期流行的主要亚型是C2亚型，1999-2003年主要流行B4亚型，2004年以后主要流行C'4亚型。对1999-2004年中国深圳地区EV71和Cox.A16分离株进行遗传重建分析，表明EV71病辨主要流行C4亚型，Cox,M6病辨主要流行C型。2008年从安徽阜阳轻症病例和重症病例标本中均分离到EV7i病毒C4亚型。从BV71感染到出现症状约为3-6天。第一个常见的症状为发烧。在发烧出现后的-^到两天，病人常在口中出现疮，手掌、脚底出现皮肤红疹。有些病例，1货是小T3岁的婴幼儿，会出现严重的并发症，短期(2-4天)发烧后突然恶化，并在第12到24小时内死亡。有报告指出猴子可在被EV71感染后14到20天内产生IgM抗体。报告指出病童的快速死亡,通常发生在第7天，是由于他们无法及时产生足够的屮和抗体。目前尚无有效的疫苗或药物可防治EV71感染。EV71和Cox,A16病毒同脊髓灰质炎病毒一样属f小RNA病辨科，肠道病T^J^。肠道病毒普遍具有很强的免疫原性，疫苗预防效果好。i954年和i956年脊髓灰质炎病毒灭活疫苗(Salk)和减毒活疫苗(Sabin)相继研究成功，在预防脊髓灰质炎方面取得巨大成就，是全球继消灭天花以后第2种被耍求消灭的病种。受到脊髓灰质炎病毒疫苗的启发和鼓舞，研制一种安全、有效的预防手足口病的疫苗是可行的。至今尚未阐明EV71和Cox.A16病毒的分子致病机制，使弱毒活疫苗的研制面临巨人挑战，人们寄希望于火活疫苗和基因工程疫苗的研制成功。综观国际上预防脊髓灰质炎的成功经验，用安全、高效、优质的—价(1、II、III型)灭活疫苗对易感人群进行预防接种是多血清型脊髓灰质炎综合防治中最有效的措施之--。在灭活疫苗的研制方面，国际上具有代表性的灭活疫苗标准制造技术己经被建立。我闺冃前还没有预防KV71和Cox.A16两种病毒的手足口病灭活疫苗。由于近年来亚太地区EV71和Cox,A16引起的手足口病大肆流行，研制出预防EV71和Cox,A16的安全、高效的手足口病疫苗是预防手足口病急需解决的问题。
发明内容本发明的目的在于公开一种可预防手足U病的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病fTA16型(Cox.A16)的手足口病单、双价灭活疫苗；本发明的目的还在f公开上述疫苗的制备力法。本发明冃的是通过如下技术方案实现的。本发明单价灭活疫苗由EV71抗原或Cox.A16抗原与Al(OH)3佐剂按下述重量百分比含^配制而成EV71抗原或Cox,A16抗原0,0015-0,002重量份Al(OH)3佐剂0.25-0.5重量份。本发明双价灭活疫苗山EV71抗原和Cox,M6抗原与Al(0H)3佐剂按K述重量百分比含量配制而成-KV71抗原和Cox.A16抗原().()()l5-().()()2重量份Al(OH)3佐剂0,25-0,5重量份；其巾EV71抗原和Cox.A16抗原的比例为1.:1。本发明单、双价疫苗的制备方法包括如下步骤a，选育手足n病疫苗株；b,建立并检定疫尚'株-:级种子批库；C,培养细胞；d，在细胞长成致密单层或微载休培养细胞成合适密度时，接种病毒；e,在细胞中增殖病毒；f,收集细胞所产生的病毒悬液，澄清过滤，去除细胞残渣；g，用灭活剂灭活病毒；h，超滤浓缩后的病毒悬液，通过凝胶过滤层析和离子交换层析纯化病毒液，或者通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒液,得纯化的病毒原液，即抗原；i,配制及检定单、双价灭活疫辨半成品及成品，测量疫两的安全性、心效性及稳定性。其中，b歩骤建立并检定疫苗株三级种子批库的方法为经过噬斑纯化的Vero细胞上的4代毒种原始种子批；验明原始种子批的记录、历史、来源和生物学特性；从原始种子批在Vcro细胞上传至第5代为主种子批；主种子批在Vcro细胞上继续传代总次数不超过12代制备工作种子批。c步骤中所用的细胞可以是从ATCC引进获得常规用于增殖肠道病毒的任何细胞，优选Vero细胞系的细胞，由工作Vero细胞库复苏，经传代扩增得到；细胞的培养方法为将用于疫两生产的Vero细胞系细胞在15L转瓶内以1:6比例分种,培养3天后接种肠道病毒；或者在发酵罐内或在WAVE生物反应器中进行，其中，在发酵罐内进行时要使用微载休，使用浓度为卜i0g/L，优选3g/L。d步骤中微载体培养细胞成合适密度是指细胞密度达到3Xl()7mi时接种病毒；以任何合适的感染复数接种病毒，优选感染复数(M0I)为0.001-0,01。e步骤巾增值病毒的用于细胞生长的培养基为常规培养基，如1.99，MEM:，可以购买；或者按照己公开的配方配制；优选无血清培养基或者培养基中应尽可能少地加入蛋白，例如血清浓度低于2%,人血清白蛋白浓度低于0.1%;接种病毒后，按照常规方式培养细胞，优选在含5%C02的培养箱中于34-351:培养细胞48-72小时。f步骤的具体方法为将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，收获病毒，通过滤器澄淸过滤，优选滤器孔径为0.45um。g步骤中灭活病毒可使用WHO规定的灭活剂和灭活条件采用甲醛作为灭活剂，优选使用浓度l:4000，灭活温度37"C，灭活时间为3天；或采用13-内内酯作为灭活剂，按1:4000在28。C灭活2天。h步骤中超滤浓缩时使用的超滤膜的截留分子量优选200-300KD，浓缩倍数优选50-100倍。h步骤中病毒液纯化的具体步骤为凝胶过滤层析和离子交换层析纯化进行凝胶过滤层析，介质采用合适的凝胶过滤介质，如德闺Merk公司生产的Hractolgel，T'衡液优选pH6.5-7.5的PBS;再进行离子交换S析，优选使用弱阴离子交换介质，例如Mcrck公司生产的FractogolEMDDEAE,缓冲盐溶液优选磷酸盐缓冲系统，平衡缓冲液优选盐浓度范闱0.05-0.l.M，p朋.5-7.5，含0,06-0,12M的氯化钠；洗脱缓冲液优选盐浓度0,05-0,1M,pII6,5-7,5，含0,2-0,4M的氯化钠；或蔗糖密度梯度离心纯化优选使用不连续蔗糖密度梯度为15%、30%和65%,30(K)0g超速离心3小时后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色条带；经过上述纯化后，细胞残余DM含量低于丄00pg/ml，残氽牛血淸含量低于50ng/'ml，得纯化的BV71灭活病毒原液或Cox.A16灭活病毒原液，即卜:V71抗原或Cox.A16抗原。i步骤中的疫苗半成品和成品是指将上述灭活病毒原液配制成药学接受的载体标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂，增溶剂；或配制成便于缓释的剂型，或添加铝盐吸附佐剂，或注射剂型；优选将上述纯化的EV71火活病毒原液或Cox.A16火活病毒原液，按常规比例混合制备成单价或双价的形式；或将由本发明制得的疫苗与本领域屮的一种或多种疫苗制成联合疫苗。其中，本发明疫苗的使llj剂t^为单价:-一人份为0,5ml，含已灭活的EV7丄抗原或Cox,A丄6抗原丄，5-2ug，Al(OH)3佐剂().25-0.5mg;双价:.'人份为0,5ml，含已灭活的EV71抗原和Cox,A16抗原共1,5-2ug,其中EV71抗原禾nCox,A1.6抗原的比例为1:1，M—卿3佐齐IJ0,25-0,5mg。图1:病毒EV71以MOI=0.1感染vero细胞的生长动力学；图2:病毒Cox,A16以■=0,1感染vero细胞的生K动力学;图3:病毒EV7i以MOI=0.i感染Vero细胞的牛长稳定性分析；图4:病毒Cox.A16以M()i=().1感染VeTO细胞的生长稳定性分析;图5:手足口病病毒噬斑形态，左图为中性红，右图为结晶紫染色结果(400X)。下述实验例或实施例进一步说明但不限于木发明。具体实施例方式实施例1:制备本发明手足U病灭活疫尚'1、肠道病毒EV71和Cox,A16錄株检定(丄)病毒效价(V丄ralt丄traL丄on)测定采用Reed&Muench方法进行测定，以能造成超过5()%的Vero细胞株呈现典型肠道病毒细胞病变现象的最高病毒稀释倍数作为病毒效价值(TCID5。)以不含胎牛血清之199培养基为稀释液，对待测病毒株作-----卜倍连续稀释，所得不同稀释倍数a-101(>)的病毒株每种稀释倍数接种96孔组织培养板中单层Vero细胞株7(2X1(^细胞/孔)8个复L并接种同样体积的199培养基为阴性对照。于含:"2%胎牛血清的199培养基、5%C()2及37E培养环境K共同培养。培养后，以显微镜观察Vero细胞株于感染病毒株后所呈现典型肠道病毒细胞病变现象的结果，培养至细胞培养板中Vero细胞株产生之典型肠道病毒细胞病变现象不再增加时，采用Reed&Muetich方法，计算病毒效价值。.'般共M培养到第7天，判定EV71的TCIDs。效价二10"，Cox,A16效价二107'5。(2)病毒生长分析将单层Vero细胞株培养于含有2%胎牛血清的199培养基的24孔组织培养板中(l()5细胞/孔)，分别以().1M()I:之病毒株在37ITF共同培养1小时。以500uL含仃2%胎牛血清的新鲜199培养基替换培养板中原培养基，之后在5%C()2、37°CK共同培养。在生K曲线中每个测定的时间点，收集孔中所有内含物。2000g离心6分钟，收集上淸中病毒，存放于-7(TC，测定病毒效价，为胞外病毒效价。将沉淀加入原始培养基相M体积的培养基悬浮，冻结-融化三次，2000g离心6分钟，收集k清中病毒，存放于-70°C，测定病毒效价，为胞内病毒效价。所冇的病毒效价测定均在同--批次中测定，结果见附图1和附图2。(3)病毒传代稳定性分析选用病毒株在Vero细胞上第10代，第2r'"A—'A—'—'《病毒，分析其在Vero细胞上生K时的基因稳定性(V:P1)和表现型的稳定性(i力学分析)，见附图3和附图4。EV7i和Cox,A丄6疫苗株第i0代，第20代，第30代病毒的VP丄基因同源性与原代病毒比较均超过99.9%，基因比较稳定。通过附图3和附图4可以看出，病毒生长比较稳定，BV71的病毒效价峰值稳定在TCID5。效价10"左右，Cox.A16的病毒效价峰值稳定在TCID5。效价1(f'5左右。(4)病毒噬斑纯化采用单伝法对已经进行病毒分离和初步鉴定的病毒进行纯化，将已经长成Vero细胞单层的6孔细胞培养板用不含血清的细胞维持液37。C浸泡1小时后倾弃，接种10倍倍比稀释的病毒f细胞培养板中，感作1小时后用不含血清的细胞维持液洗涤1次，加40-42°C的含中性红的营养琼脂糖，厚度约2mm，凝固后f隊斑出现，或者约3-5天用结晶紫染色。挑斑后增殖病毒再作2轮纯化，为纯化的病iij.见图5。2、手足口病灭活疫苗病毒株的选育分离手足口病病人临床病料获得手足口病病毒株，候选病毒株具有完整的记录、历史、来源。测定候选病毒的生物学特性，火活疫苗候选病毒株应该具备病毒产量高、诱导免疫保护的能力强、交叉保护谱广、稳定的生物学特性，并依据流行病学和分子流行病学调査资料选择的、当前和今后fl.仃;''泛流行潜力的野生株。噬斑纯化经过筛选的候选病毒株，制备三级种了批库，获得工作种了批ft力。湖淀临床感染康复病人血清的中和工作种了批病毒的能力。将工作种子批病毒免疫动物，分离血淸后，测定血淸中和其他手足口病病毒毒株的能力，筛选保护谱广、诱导保护能力强的病毒作为灭活疫苗病毒株。3、病毒种子批的建立和检定疫苗生产用毒种应以病毒种子批系统为基础进行三级管理，即原始种子批、主种子批和工作种子批。原始种子批为Vero上的4代毒种。原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性。从原始种子批在Vero细胞上传至第5代为主种子批,进行全面检定,主种了批在Vero细胞....匕继续传代制备工作种了批，在Vero细胞....匕传代总次数不得超过12代。毒种保存在60°C以下。种子批检定包括鉴别试验、无菌试验、病毒滴定、病毒外源因子检査、免疫原性检査等项目，检定合格后方可使用。4、疫苗生产工艺流程细胞凍用非洲绿猴肾传代细胞系(Vero细胞系)。该细胞由日木学者于1963年从非洲绿猴肾分离得到。第112代被送至美国典型培养物保藏中心(ATCC)。军事医学科学院于1.998年10月从美国ATCC获得1.20代Vero细胞,贮存和制备了原始种子库、主细胞库、丁作细胞库，经检定，均符合《中国药典(第3版)》及《中国生物制品规程》关于动物细胞制备生物制品规程的要求。病毒制各EV7i和Cox,Ai6原始种子批、主种子批和工作种子批三级库，。细胞培养复苏工作库细胞，将一只安瓶的细胞复苏到一个151..转瓶中，培养4-6天后，按照l:6的分种比例传出6个转瓶，如此传代扩增至50至200个15L转瓶。细胞培养也可以在发酵罐内或者在WAVE生物反应器中进行。在发酵罐内可以使用微载体，例如，Pharmacia公司的Cytodexl11，使用浓度为优选3g/L。该微载体适合于Vero细胞牛长，维持时间可达28天。在细胞密度达到3X1()7m]时抟种病毒，例如对培养3天的细胞ftiY病毒接种细胞培养3天后，弃去细胞踏)F上清，接种工作种子批病毒。病毒接种量为0,1M()I:，培养温度37t:，培养时间30-'l()小时，病毒维持液为无血清或含0,1%人血清白蛋白的i99培养基。收获病毒当细胞出现明显病变时,通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，由此收获病毒。澄清过滤用0,45Pm的滤器过滤所有收获i:清。火活病毒病毒液釆用P-丙内酯作为火活剂，按1:4000在28°C火活2天，然后37"C水解2h。超滤浓縮病毒用截留分子量200KD超滤膜，浓縮倍数100倍。凝胶过滤层析用p:H6,5-7,5的P:BS平衡S印harose6FpTM介质进行病毒纯化，收集外水休积流穿峰。杂蛋白去除可达95%以上。离子交换层析采用S印harose卜十'TM介质，平衡液为pH6.5-7.5、含有0,05-0,15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、p朋.5-7.5的PBS。未进行病毒灭活步骤的疫苗生产过程中纯化及除茼过滤结果见表l。表1未进行病毒火活步骤的EV71和Cox,A16规模纯化及除菌过滤结果批号B1T20081M51EV2O0810201CA加0810251病毒收获液糊(L)350300380*度(1gCCIDb)8,07,77,8澄清体积(L)3402恥360滴度(lgCCID-)8,257,88,13.浓缩体积(L)1』l.胡0,9滴度(lgCCID-)10,49,肪10,59凝胶过滤体积(L)0,620.610,62滴魔(lgCCIDa》'9,259,6259,625离子交换体积a)0,820,830,83滴魔(igccin)9,259,6259,5除菌过滤体积化)0,90,9O,袋滴度agcan)9,1259,59,5配制纯化后的EV71和Cox,A16火活病毒原液混合，配制注射剂，两种火活病毒原液的配制比例为l:l(配制注射剂时是否需要加入佐剂？)。5、疫^纯度分析根据《中国药典(第3版)》及《中国生物制品规程》关f《传代细胞作为生物制品细胞基质规程》的要求，测定疫苗的外观、无菌试验、DNA含量、蛋白质含量、牛血淸蛋白残留量、pH值、支原体检査、病毒外源因子检査等。结果见表2。表2疫苗成品检定结果项目EVCA20瞧腿01EVCA幼081i20(M外观遭明液#邇明液体无菌试驗阴性H性鉴變』试驗抓1CcmlA16EWl+Cox,A16鹏含s<卿溪/剂"00pg/翻内毒蕭含量《咖HJ/剂<咖,』效力试鼈舰舰异常毒性试验通过邇过总s白含量《120g/#』《l加wg/湘牛血清蛋白残留量《50ng/割'《50n接/拥支尿体检査Ji过邇过病毒外澳因子检査邇过通过PH7,137,136、疫苗效力分析采用:Reed&Muench法测定血清屮和效价。将待测抗血清56°C30分钟灭活，以不含牛血清的199踏)'「基稀释1-2n倍。将稀释后样品加入含有IOOTC:[Dm病毒(64-16()TCI:D5。/(),lm:l:,)，2%胎牛血清，相同体积的199培养基中4T孵育i2小时。将孵育后的混合液加入单层Verx)细胞的96孔组织培养板中(2Xl()4细胞/孔)，37"C孵育1小时。移除培养板巾培养基，加入100U1」2%胎牛血清的新鲜1.99培养基，5%C()2，37"C培养。以显微镜观察，当培养至板屮Vero细胞病变不增加时(第7天)，采)1JReed&Muench法计算抗血清中和效价。将本发明以上述方法制备的疫^免疫SPF小鼠和猴体，每只小鼠每次0,1mL，每只猴了每次0,5mL,间隔1'1天，免疫3次，末次免疫后15大采血，分离血清。免疫恒河猴后血淸于56°C30分钟灭活进行中和试验，测定血淸中和效价，结果见表3。表3疫苗成品免疫恒河猴产生的血清对肠道病毒临床分离株的中和抗体效价<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>7、安全性分析按照中国生物制品规程，使用清洁级标准的小鼠和豚鼠对制备的灭活疫苗进行异常毒性试验，结果见表4。表4疫苗成品异常毒性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>取体軍:18-22g小鼠，注射前称取每只小鼠体軍:。每批样品用5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL测试疫W，观察14天。取体重250-350g豚鼠,注射前称取每只豚鼠体重。每批样品用5只豚鼠，每只豚鼠腹腔汴射5.OmL测试疫苗，观察i4天。进行过敏原性试验，以牛血清为过敏试验的阳性对照，生理盐水为阴性对照。每组5只豚鼠，分别T腹部皮下注射0.5mL。隔|.....I-^次，共3次，第3次注射后24天，耳静脉给予相同物质0.5mL,立即观察注射后反应，结果见表5。表5疫苗成品过敏原性试验结果錄论g苗合格，无致敏黡8、疫苗稳定性分析将疫W成品放于41:，室温(20-25°C),37°C6个月，观察效力稳定性、抗原稳定性、pH稳定性、外观稳定性。试验结果表明疫苗在4。CK存放稳定。手足口病灭活疫苗4。C的效力稳定性试验，结果见表6。表6手足口病灭活疫苗4"C的效力稳定性试验结果疫苗批号存放时间(月)調定中靡效价的病毒123458株W711:10241:20481:20481:;加481:10241:1024《Beijin驟08-1)EWA2加8110501Cox,A16(Shandong08-1》1:20481:M241:20481::1024l:加481:1024EVCA2008112001.EV71(Be复jin富08-1)l:20幼l:幼幼1:2048:10241:20481:1024C饥A161:20幼l:加48l':加幼1:'10241:20481:2048(Shand加g08-1》试验分组露鼠号加分钟内表现3天结果噱醺抓耳抽癱休寬死亡s蹄蹄蹄蹄蹄蹄权利要求一种预防手足口病的单、双价灭活疫苗，其特征在于该单价灭活疫苗由EV71抗原或Cox.A16抗原与Al(OH)3佐剂按下述重量百分比含量配制而成EV71抗原或Cox.A16抗原0.0015-0.002重量份Al(OH)3佐剂0.25-0.5重量份；该双价灭活疫苗由EV71抗原和Cox.A16抗原与Al(OH)3佐剂按下述重量百分比含量配制而成EV71抗原和Cox.A16抗原0.0015-0.002重量份Al(OH)3佐剂0.25-0.5重量份；其中EV71抗原和Cox.A16抗原的比例为1∶1。2.如权利要求1所述的申.、双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤a，选育手足n病疫苗株；b,建立并检定疫^株—级种子批库；C，培养细胞；d，在细胞长成致密单层或微载休培养细胞成合适密度时，接种病毒；e,在细胞中增殖病毒；f，收集细胞所产生的病毒悬液，澄清过滤，去除细胞残渣；g，用灭活剂灭活病毒；h，超滤浓缩后的病毒悬液，通过凝胶过滤层析和离子交换层析纯化病毒液，或者通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒液，得纯化的病毒原液，即抗原；i，配制及检定单、双价灭活疫W半成品及成品，测量疫两的安全性、W效性及稳定性。3.如权利要求2所述的单、双价灭活疫苗的制备方法，其特征在f:其中b歩骤建立并检定疫苗株三级种子批库的方法为经过噬斑纯化的Vero细胞上的4代毒种原始种子批；验明原始种子批的记录、历史、来源和生物学特性；从原始种子批在VGro细胞上传至第5代为主种子批；主种子批在Vcro细胞上继续传代总次数不超过12代制备工作种子批。4.如权利要求2或3所述的单、双价火活疫苗的制备方法，其特征在于其屮c步骤屮所用的细胞是从ATCC引进获得常规JI:j于增殖肠道病毒的任何细胞，主要指Vero细胞系的细胞，由丁作Vero细胞库复苏，经传代扩增得到；细胞的培养方法为将用f疫苗生产的Vero细胞系细胞在15L转瓶内以1:6比例分种，培养3大后接种肠道病毒；或者在发酵罐内或在WAVE牛物反应器中进行，其中，在发酵罐内进行时要使用微载休，使用浓度为卜l()g/L，主要指3g/L。5.如权利嬰求2-4任--所述的单、双价灭活疫苗的制备方法,其特征在孓其中d步骤巾微载体培养细胞成合适密度是指细胞密度达到3X1.06/ml时接种病毒；以任何合适的感染复数接种病毒，主要指感染复数(M0I)为0,001-0,01。6.如权利要求2-5任一所述的单、双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中e歩骤中增值病毒的用于细胞生长的培养基为常规培养基；或者按照己公开的配方配制；或者无血清培养基或者培养基中应尽可能少地加入蛋白，例如血清浓度低f2%，人血清0蛋0浓度低于0.1%;接种病毒后，按照常规方式培养细胞，在含5%C02的培养箱中f34-35。C培养细胞48-72小时。7.如权利要求2-6仟--所述的单、双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中f步骤的具体方法为将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集,冻融3次,离心去除细胞沉渣，收获病毒，通过滤器澄淸过滤,滤器孔径为0,45um。8.如权利要求2-7任一所述的申.、双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中g步骤中火活病毒可使用WIIO规定的火活剂和火活条件釆用甲醛作为火活剂，使用浓度l:4000，灭活温度37t:，灭活时间为3天；或采用丙内酯作为灭活剂，按1:4000在28。C灭活2天。9.如权利要求2-8任一所述的单、双价灭活疫苗的制备方法，其特征在f:其中h歩骤中超滤浓縮时使用的超滤膜的截留分子量为200-300KD，浓縮倍数为50-1()()倍。10.如权利耍求2-9任--所述的单、双价灭活疫苗的制备方法,其特征在孓其巾h步骤巾病毒液纯化的具体步骤为凝胶过滤层析和离子交换层析纯化进行凝胶过滤层析，介质釆用合适的凝胶过滤介质，平衡液为pH:6.5-7.5的PBS;再进行离子交换S析，使用弱阴离子交换介质，缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲系统，平衡缓冲液为盐浓度范围0.05-0.1M，p朋.5-7.5，含0.06-0.12M的氯化钠；洗脱缓冲液为盐浓度().05-0,1M，pH:6,5-7,5，含0,2-0,'1M的氯化钠;或蔗糖密度梯度离心纯化使用不连续蔗糖密度梯度为15%、30%和65X，30000g超速离心3小时后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色条带；经过上述纯化后，细胞残余DNA含量低丁'100pgZml，残余牛血淸含量低丁'50ng/ml，得纯化的EV71灭活病毒原液或Cox.A16灭活病毒原液，即EV71.抗原或Cox,A16抗原。11.如权利要求2-10任--所述的单、双价火活疫苗的制备方法，其特征在于其屮i步骤屮的疫苗半成品和成品是指将将纯化病毒原液配制成包括药学可接受的载体标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂，增溶剂；或配制成便于缓释的剂型，或添加铝盐吸附佐剂，或注射剂型；将上述纯化的EV7i灭活病毒原液和Cox.Ai6灭活病毒原液，按常规比例混合制各成单价或双价的形式；或将由本发明制得的疫苗与本领域中的一种或多种疫苗制成联合疫苗。12.如权利耍求卜11任-'所述的单、双价灭活疫苗在制备预防手足口病的药物中的应用。13.如权利要求12所述的应用，其特征在于该疫苗的使用剂量为单价一人份为0.5ml，含已灭活的EV71抗原或Cox,A16抗原1.5-2ug'，Al线佐剂0.25-0.5mg;双价一人份为0,5ml，含已灭活的EV71抗原和Cox,A16抗原共1,5-2ug,其中EV71抗原禾口Cox.A丄6抗原的比例为i:丄，Al(OH)3佐剂0.25-0,5mg。全文摘要本发明公开了一种可预防手足口病的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Cox.A16)的手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法，该疫苗首先选育了手足口病疫苗株；建立并检定疫苗株三级种子批库；培养细胞；接种并增殖病毒；收集病毒悬液；灭活病毒；超滤浓缩并纯化病毒悬液，得疫苗原液；最终配制成单、双价灭活疫苗。本发明单、双价灭活疫苗在预防手足口病方面具有较好的应用前景。文档编号C12N7/04GK101695570SQ20091023659公开日2010年4月21日申请日期2009年11月3日优先权日2009年11月3日发明者刘鑫,李敏,李晓楠,杨鹏辉,段越强,王希良,罗德炎,赵忠鹏,邢丽,高啸申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所;