专利名称：鱼肉制品中安康鱼种源的检测方法
技术领域：
本发明属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中安康鱼的快速检测方法。
背景技术：
海洋捕捞的海洋大型鱼类一直是世界各国人民喜爱的食品，也是国际贸易的重要商品种类。海洋大型鱼类在贸易中常常包括加工成鱼肉片或者鱼肉块，更包括一些鱼的内脏或者其他深加工的产品。这些产品从外观上已经不能看出用来加工的原料鱼种类，因此需要不受外观和加工工艺的限制来确认商品的真伪。基于DNA的检测方法可以从基因水平进行物种鉴定。实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为基因检测和鉴定的重要工具。目前国内外还没有对安康鱼物种的鉴定方法公开，本发明可弥补上述缺陷，完成鱼肉制品中安康鱼种源的鉴定。
发明内容
本发明属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中安康鱼的快速检测方法。克服基于形态学的检测方法在鱼类产品加工过程中带来的鉴定困难，为确定安康鱼的种源提供技术手段，从而确保食品标签的一致性。本发明的主要原理为针对保守序列设计一组引物上游引物AnkangFlOe 5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3 ；下游引物 AnkangR106 5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3 利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA ；以提取的DNA为模板进行PCR扩增；测定熔解曲线时，在反应体系中加入荧光染料Eva Green，染料与DNA双链结合并发出荧光，由于反应中存在少量的非特异聚合体(如引物二聚体等)，能引起干扰，但非特异聚合体的熔解温度较特异性结合低，当扩增结束后，再缓慢加温，当DNA变性后，染料被释放， 荧光减少，而非特异性结合先于特异性结合减少，对熔解过程进行连续动态监测可得熔解曲线，通过曲线将非特异性讯号和特异性讯号区分出来，同时对特异性讯号区，荧光减少的快慢与浓度的对数成正比，以此可以确定是否有引物特异性扩增产物。本发明涉及的安康鱼种源快速检测方法，其中的试剂包括如下(I)PCR扩增反应液包括10\ 0 反应缓冲液、0.1-0.4讓01/1dNTP、2_4mmol/L硫酸镁、1-2U Taq 酶、 0. 2-0. 6ymol/L上游引物、0. 2-0. 6 μ mol/L下游引物、1. 25 μ L 20XEva Green染料(美国 Biotum 公司)；其中10XPCR反应缓冲液含有lOOmmol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、 500mmol/L氯化钾和1 %曲拉通X-100 ；上游弓丨物AnkangF 106 5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3 ；下游引物 AnkangR106 5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。其中上游引物、下游引物体积比为1 1 ；
使用上述试剂盒检测食品中安康鱼种源的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)(1)待检样品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。DNA提取质量使用 OD260和OD28tl的光吸收来衡量，或者使用其他方法衡量。(2)安康鱼种源的实时荧光PCR扩增A.在装有MyL PCR扩增反应液A的反应管中加入1 μ L待检样品DNA，混勻。B.检测过程中分别设阳性对照、空白对照。使用具有溯源性的阳性标准物质作为阳性对照，用已知不含鱼类成分的样品作阴性对照，用等体积的水代替模板DNA作空白对照。C.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增94-95 "C 2_4min，l 个循环；94-950C 30s，65°C 30s，75°C 30s，共 45 个循环；950C 15s，60°C 15s，20min 内升温至 95°C，95°C 15s。(3)使用熔解曲线分析PCR扩增结果。非安康鱼样品熔解曲线在81 士 0.5°C无单一峰；安康鱼样品熔解曲线在 81 士0. 5°C有单一峰。本发明建立了安康鱼种源的实时荧光PCR检测方法及检测方法。本发明采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的鱼肉制品中安康鱼种源的检测。
图1是实施例1中安康鱼样品PCR产物的熔解曲线图。图中的单一峰分别为安康鱼阳性标准品和待检样品的熔解曲线。没有出峰的线是空白对照。
图2是实施例2中安康鱼样品PCR产物的熔解曲线图。图中的单一峰分别为安康鱼阳性标准品的熔解曲线。没有出峰的线是待检样品和空白对照。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1按下述方法检测市售安康鱼包括10XPCR 反应缓冲液、0. 2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸镁 1. 5U Taq 酶、 0. 4 μ mol/L 上游引物 AnkangF 106 5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3 ；下游引物 AnkangR106 5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。其中10XPCR反应缓冲液含有lOOmmol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、 500mmol/L氯化钾和1 %曲拉通X-100 ；按照以下程序进行检测(1)待测鱼肉样品DNA的提取A.称取0.5g鱼肉，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入500 μ L抽提裂解缓冲液 (0.05Μ Tris-HCL (三羟基甲基氨基甲烷-盐酸)、0. IM EDTA(乙二胺四乙酸)、0. 2Μ氯化钠、pH值7. 6灭菌双蒸水)，充分振荡；B.加入蛋白酶K 60 yL,10% SDS 2 μ L，颠倒混勻。57°C水浴IOh至原料消化为清液，4000rpm离心2min，取上清；C.加入500 μ L等体积的Tris-酚，颠倒混勻IOmin, 12000rpm离心IOmin,取上清；D.重复上步；E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和异戊醇(体积比为25 24 1)，颠倒混勻 lOmin，12000rpm 离心 lOmin，取上清；F.在上清液中加入氯仿和异戊醇(体积比为24 1)，颠倒混勻10min，12000rpm 离心lOmin，取上清；G.加入两倍体积无水乙醇，1/5体积的醋酸钠(4M)，颠倒混勻lOmin，沉淀DNA ； 12000rpm离心lOmin，弃上清；H.加入600 μ L乙醇(70% )洗涤DNA，离心弃上清，开盖，晾干；I.加入100 μ L灭菌双蒸水溶解DNA。J. DNA提取质量纯度OD260/OD280 = 1. 83，浓度为IOlng/ μ L。满足PCR反应的条件。(2)待测鱼片DNA的实时荧光PCR扩增Α.在PCR反应管中加入MyL PCR反应液A禾Π 1 μ L样品DNA,混勻。B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增94-95 "C 2_4min，1 个循环；94-950C 10_60s，65°C 10_60s，75°C 10_60s，共 45 个循环；950C 15s，60°C 15s，20min 内升温至 95°C，95°C 15s。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析熔解曲线结果。非安康鱼样品熔解曲线在81 士 0.5°C无单一峰；安康鱼样品熔解曲线在 81 士0. 5°C有单一峰。实施例2按下述方法检测市售鱼内脏是否为安康鱼来源包括IOXPCR 反应缓冲液、0. 2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸镁 1. 5U Taq 酶、 0. 4 μ mol/L 上游引物 AnkangF 106 5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3 ；下游引物 AnkangR106 5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。其中IOXPCR反应缓冲液含有lOOmmol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、 500mmol/L氯化钾和1 %曲拉通X-100 ；按照以下程序进行检测(1)待测鱼内脏样品DNA的提取A.称取0.5g鱼内脏，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入500 μ L抽提裂解缓冲液 (0.05Μ Tris-HCL (三羟基甲基氨基甲烷-盐酸)、0. IM EDTA(乙二胺四乙酸)、0. 2Μ氯化钠、pH值7. 6灭菌双蒸水)，充分振荡；B.加入蛋白酶K 60 μ L，10% SDS 2 μ L，颠倒混勻。57°C水浴IOh至原料消化为清液，4000rpm离心2min，取上清；
C.加入500 μ L等体积的Tris-酚，颠倒混勻IOmin, 12000rpm离心IOmin,取上清；D.重复上步；E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和异戊醇(体积比为25 24 1)，颠倒混勻 lOmin，12000rpm 离心 lOmin，取上清；F.在上清液中加入氯仿和异戊醇(体积比为M 1)，颠倒混勻10min，12000rpm 离心lOmin，取上清；G.加入两倍体积无水乙醇，1/5体积的醋酸钠(4M)，颠倒混勻lOmin，沉淀DNA ； 12000rpm离心lOmin，弃上清；H.加入600 μ L乙醇(70% )洗涤DNA，离心弃上清，开盖，晾干；I.加入100 μ L灭菌双蒸水溶解DNA。J. DNA提取质量纯度OD26Q/OD28Q = 1. 87，浓度为127ng/ μ L。满足PCR反应的条件。(2)待测鱼片DNA的实时荧光PCR扩增A.在PCR反应管中加入MyL PCR反应液A禾Π 1 μ L样品DNA,混勻。B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增94-95 "C 2_4min，1 个循环；94-950C 10_60s，65°C 10_60s，75°C 10_60s，共 45 个循环；950C 15s，60°C 15s，20min 内升温至 95°C，95°C 15s。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析熔解曲线结果。样品的熔解曲线在81 士0.5°C无单一峰；据此可判定该样品不是安康鱼来源。
权利要求
1.一种安康鱼物种鉴定的快速检测方法，其特征在于其中的引物 上游引物 AnkangF 106 5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3 ；下游引物 AnkangR106 :5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT_3。
2.一种使用权利要求一所述的快速鉴定安康鱼物种的检测方法，其特征是依次包括下列步骤(1)待检样品的DNA提取；(2)安康鱼COI基因的实时荧光PCR扩增在装有M μ L的PCR扩增反应液的反应管中加入1 μ L的待检样品DNA，混勻。按照下述步骤完成PCR扩增。94-950C 2-4min, 1 个循环；94-950C 10-60s，65°C 10_60s，75°C 10_60s，共 45 个循环； 950C 15s，60°C 15s，20min 内升温至 95°C，95°C 15s。(3)使用熔解曲线分析PCR产物。PCR产物的熔解曲线的单一熔解峰出现在81 士 0. 5 °C。
全文摘要
本发明属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中安康鱼的快速检测方法。方法包括PCR扩增反应液和上游引物AnkangF1065-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3、下游引物AnkangR1065-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3；安康鱼的快速检测方法包括鱼肉制品DNA的提取、安康鱼种属特异性基因的实时荧光PCR扩增和使用熔解曲线进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。
文档编号C12Q1/68GK102168127SQ20101011430
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者刘畅 申请人:刘畅