专利名称：一种阿魏酸酯酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用未培养微生物提取mRNA，建立cDNA文库，进行阿魏酸酯酶基 因的克隆；构建含阿魏酸酯酶基因的重组载体在宿主(大肠杆菌)中表达的工程菌；利用工 程菌表达的阿魏酸酯酶及该酶的应用。
背景技术：
阿魏酸酯酶(E. C. 3. 1. 1. 73，又称肉桂酸酯酶)是水解植物细胞壁中羟基肉桂酸 和糖之间酯键的一类酶，是羧酸酯水解酶的一个亚类，也是一种胞外酶，是能水解阿魏酸 甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来的酶。阿魏酸酯酶在造纸、食品、制药及饲料工业有很广泛的应用空间。近年来，阿魏酸 酯酶在饲料消化中的作用日益引起人们的关注。秸秆和饲草干物质中约30%-80%为细胞壁 成分，因此，细胞壁成为秸秆和饲草利用的瓶颈因素。阿魏酸酯酶可以打开饲料细胞壁木质 素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从 空间上增加了微生物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测 认为是消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。目前，国内外对阿魏酸酯酶的研究，发现了有效分泌阿魏酸酯酶的微生物；研究 人员对该酶的酶学特性进行了详细研究，如酶的结构、最适温度、最适PH值及影响酶稳定 性的其他因素；探讨了阿魏酸酯酶与一些多糖降解酶的协同作用；指出了微生物产酶的影 响因素和酶的工业化分离方法。但是，文献表明阿魏酸酯酶虽然有着广阔的应用前景的一 种新型酶制剂，但目前还没有工业化产品。关于阿魏酸酯酶的研究，有很多问题需要解决，主要是目前筛选出的分泌阿魏酸 酯酶的微生物的分泌量仍然达不到工业化生产阿魏酸酯酶的要求；其次，阿魏酸酯酶提取 方法有待于改进，其工业化生产受到限制。研究表明，利用现代生物技术来改良微生物，使 阿魏酸酯酶的产量提高是解决这一问题的途径之一，目前已经有研究者定位了与阿魏酸酯 酶合成有关的基因，为进一步的研究奠定了基础；但目前还没有将酯酶进行提高阿魏酸酯 酶的活力及产量的研究。
发明内容
本发明提供一种优质的阿魏酸酯酶基因，能够构建成阿魏酸酯酶的工程菌。本发明提供了阿魏酸酯酶及其在生物化工、油脂加工、食品加工等领域中的用途。本发明公开了阿魏酸酯酶具有水解植物细胞壁的用途，能够单独或与其它酶联合 水解植物细胞壁，及其在生物质能源利用方面有广泛的应用价值。本发明公开的阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明阿魏酸酯酶工程菌的构建方法，包括从自然发霉的玉米皮及秸秆中钓取目 的基因、构建表达载体及将载体转化到宿主细胞中得到其工程菌，具体步骤如下
1)从未培养的微生物中提取mRNA ；2)载体为真核或原核表达载体；
3)宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。所述的构建方法中所使用的载体为pET_28a ( + )或pET_32a ( + )。所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21或BLP。本发明提供的阿魏酸酯酶，其特征在于
(1)在25-80°C，表现催化活力，其酶活力最适反应温度为40°C；
(2)能够有效地催化阿魏酸对硝基苯酚酯的水解；
(3)酶在pH5. 5-7. 0范围内稳定性较高，残余酶活力在60%以上。本发明所述阿魏酸酯酶的制备方法，包括将过夜培养的菌液离心(6000rpm， 20min)，弃沉淀，收集上清，透析10h，利用PEG浓缩100倍，加入适量硫酸铵，弃上清保留沉 淀，取沉淀利用25MmTris-HCl (pH8. 0)缓冲液溶解，得到初步纯化的酶液。以下实验表明阿魏酸酯酶具有水解植物细胞壁的用途。试验例
阿魏酸酯酶的水解活性 (1)水解反应
取2个锥形瓶，分别称取磨碎的玉米麸皮50g，加入250ml 0. 6%Na0H，在黑暗中浸泡 一小时，高压灭菌(12rC，30min)，降温至30°C后调节pH至5，分别加入30U纤维素酶液、 60U阿魏酸酯酶和30U纤维素酶液后放入摇床摇12h (45°C )，每隔Ih取Iml反应液，离心 (5500r，IOmin)取上清，蒽酮硫酸法测定上清中的总糖含量。(2)标准曲线制作及样品中总糖含量测定
配制0. lg/L葡萄糖溶液，分别精密移取0. 05,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 60,0. 80和 1.00 mL至8支试管中，然后将每支试管中溶液补足至1 mL，混勻，加入4. 00 mL蒽酮试剂 (2g/L蒽酮试剂溶解2 g蒽酮于浓硫酸中)，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后，浸于沸 水浴中煮沸10 min，取出，流水冷却，室温放置10 min左右，测620 nm处吸光度值，以蒸馏 水作为空白样品作为对照，以620 nm处吸光度值为纵坐标，葡萄糖质量为横坐标，绘制标准 曲线。实验结果如图1所示，不加任何酶液，12h中总糖含量从13. 12mg/ml增加到 13. 90mg/ml ；只加纤维素酶，12h总糖含量从15. 50mg/ml增加到18. 27 mg/ml ；同时加入阿 魏酸酯酶和纤维素酶，12h总糖含量从15. 07mg/ml增加到19. 22mg/ml。结果表明在加入 阿魏酸酯酶之后，纤维素酶的总糖的水解量提高了 5%。说明在阿魏酸酯酶有能辅助纤维素 酶水解植物细胞壁的作用。本发明的积极效果在于利用未培养微生物提取mRNA，建立cDNA文库，因此，利用 微生物学、分子生物学的方法，构建高效水解阿魏酸酯的酯酶工程菌，获得高活力的阿魏酸 酯酶工程菌，在发掘和利用自然界中阿魏酸酯酶编码基因资源方面具有科学价值，同时为 实现该酶的工业化生产奠定基础，在利用生物质生产的第二代生物质燃料和自然资源的有 效利用方面，也具有广泛的应用前景。
图1.复合酶水解细胞壁时间-总糖曲线；图2.重组表达载体示意图； 图3.纯化得到阿魏酸酯酶的电泳图谱； 图4.阿魏酸酯酶的温度-活力曲线； 图5.阿魏酸酯酶的pH-活力曲线。
具体实施例方式实施例1
阿魏酸酯酶工程菌的构建及其表达 (1)阿魏酸酯酶mRNA的提取及CDNA文库构建
称取自然发霉的玉米皮及秸秆(吉林省)0. Ig,液氮研磨至粉末，加入500ul Trizol试剂，在室温下继续研磨至完全融化，转入1.5ml eppendorf管中，室温放置3min。4°C， 15000rpm离心lOmin，将上清转入新1. 5ml eppendorf管中，加入100ulCHCl3，用力振摇 30s，室温放置3min。4°C，15000rpm离心lOmin，取上层水相，加入冰上预冷的异丙醇250ul， 冰上放置lOmin。4°C，15000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀中加入lml4°C预冷的75%乙醇， 涡旋混合10s。4°C，15000rpm离心lOmin，弃上清，室温挥干乙醇，沉淀溶于50ulDEPC水中， 立即进行逆转录反应。逆转录反应在20ul体系中加入9. 5ul超纯水，Iul dNTP，0.5ul OligodT, 2ul RNA，65°C处理5min，立即冰浴冷却，瞬时离心IOs ；加入2ul DTT，4ul 5XRT buffer温和 混勻，42°C水浴中保温2min ；加入Iul逆转录酶混合均勻后，于42°C水浴中反应40min， 95°C反应 5 min。(2)引物设计及用PCR法钓取酶基因制备重组载体 该酶基因通过PCR方法从步骤(1)所得cDNA中扩增而得到。上游引物5，-TTCCCGGAATTCATGAAGCAATTCTC-3， 下游引物5’ -ATATTACCAAAGCTTAGCTCCGCTCGTCA-3’
两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET28a+ (或pET-32a ( + ))的Ecor I和Hind III相匹配，合适于在大肠杆菌中高效表达。PCR 反应在 25ul 反应体系中含有 0. 5ul DNA 聚合酶，2.5ul IOXPCR buffer, 1. 5ul dNTP( 10 mM)，0. 5ul 上游引物，0. 5ul 下游引物，0. 5ulcDNA，17. 5ul 超纯水。每循环 中94°C变性5min，48°C退火40s，72°C延伸lmin20s，最后一个循环延至lOmin，共30个循 环。用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量与预期的900bp —致。使用PCR产物纯 化试剂盒对扩增产物进行纯化。将纯化的PCR产物用限制性内切酶Ecor I和Hind III酶切，37°C下保温3h，酶切 完毕，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，应用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。应用类似的方法酶切pET28a+载体，在1%琼脂糖凝胶中检测线性并提纯酶切后的 载体。在16°C应用T4DNA聚合酶来连接酯酶基因片段和载体。将连接载体转入五co7iBL21 中，用含卡那霉素的琼脂糖平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。从挑取的菌落中提取载体， 用限制性内切酶Ecor I和Hind III作用载体，得到大小两个片段，其大小分别与酯酶基因 和pET28a+的片段大小一致。重组载体的构建过程如图2所示。核苷酸序列见SEQ ID NO. 1 序列表。
(3)重组载体在宿主菌中的表达
重组载体可转化到五coli BL21或五coli BLp宿主细胞中，在五co7iBL21中表达的
酯酶含量最高。大肠杆菌感受态细胞制备及其载体转化方法挑取阳性转化菌，置5ml含卡那霉 素的培养液中37°C培养过夜，次日接种到IOOml新鲜LB培养基中，37°C继续培养4h。将 初步方法的种子液以1%的比例接入2L的培养液中，在空气摇床振荡培养(37°C，120rpm/ min)。待菌体生长到A600为0. 6 1. 0时，加入IOOmM的异丙基硫代- β -D-半乳糖苷 (IPTG)至终浓度为ImM，降低培养温度至25°C，对菌体进行诱导使其产生大量目的蛋白，培 养4小时后收获菌体，得到本发明所述工程菌。将过夜培养的菌液离心(6000rpm，20min),弃沉淀，收集上清，透析10h，利用PEG 浓缩100倍，加入适量硫酸铵，弃上清保留沉淀，取沉淀利用25MmTris-HCl (pH8. 0)缓冲 液溶解，得到初步纯化的酶液。应用SDS-PAGE(12%)电泳检测重组蛋白的纯度，可见在 40000Da附近可见一电泳条带，即为阿魏酸酯酶，如图3所示(Lane 1，透析，硫酸铵处理的 重组蛋白(pET28a+FAE) ； Lane 2，全菌蛋白(pET28a+)；)。以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版， 科学出版社，2002年)
试验例
阿魏酸酯酶的特性 (1)最适反应温度
反应温度是影响酶催化活力的重要因素，此酶来源于环境微生物，因此设定该酶 催化活力检测的温度范围为25-80°C。以阿魏酸对硝基苯酚酯作为反应底物，在25-80°C的温度范围内测定阿魏酸酯酶 活力。由图4可见，其活力在25-40°C温度范围内随温度的升高而提高，在45°C以上，活力 下降，最适温度为40°C。阿魏酸酯酶活力测定以阿魏酸对硝基苯酚酯作为反应底物，反应体系为1ml， 缓冲体系为25mmol/L的磷酸缓冲液，阿魏酸对硝基苯酚酯的终浓度为0. lmmol/L,加入 0. 224mg的酶，用DB-2401型紫外分光光度分析仪测定405nm的吸光度值。1个酶活力单位 是Imin水解底物生成IuM对硝基苯酚所需要的酶量。(2)最适 pH
环境PH值会影响酶分子中带电氨基酸的解离状态和酶的构象，进而影响酶的催化活 力。以阿魏酸对硝基苯酚酯作为底物，在40°C下测定阿魏酸酯酶在pH 3-8范围内的比活 CpH 5. 8-8. 0磷酸缓冲液，pH3-4. 8柠檬酸缓冲液)，实验结果如图5所示，在pH值6-6. 4之 间能够有效地催化阿魏酸对硝基苯酚酯的水解，且表明本发明酶的最适pH为6. 4。
权利要求
1.一种阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根据权利1所述基因构建阿魏酸酯酶工程菌的方法，包括从自然发霉的玉米皮及秸 秆中钓取目的基因、构建表达载体及将载体转化到宿主细胞中3个步骤1)从未培养的微生物中提取mRNA；2)载体为真核或原核表达载体；3)宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。
3.根据权利2所述的构建方法，其特征在于所使用的载体为pET-28a( + )或pET_32a(+ )。
4.根据权利2所述的构建方法，其特征在于所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21或BLP。
5.具有权利1所述基因的阿魏酸酯酶，其特征在于(1)在25-80°C，表现催化活力，其酶活力最适反应温度为40°C；(2)能够有效地催化阿魏酸对硝基苯酚酯的水解；(3)酶在pH5. 5-7. 0范围内稳定性较高，残余酶活力在60%以上。
6.权利要求5所述阿魏酸酯酶的制备方法，包括把过夜培养的菌液离心后除去菌体， 收集上清，透析10h，PEG浓缩100倍，加入适量硫酸铵沉淀，用pH8. 0的25MmTris-HCl缓冲 液溶解，得到酶液。
7.权利要求5所述的阿魏酸酯酶，在生物化工，油脂加工、食品加工领域中的应用。
8.权利要求5所述的阿魏酸酯酶具有水解植物细胞壁的用途，及其在生物质能源方面 的利用。
全文摘要
本发明公开一种阿魏酸酯酶及其编码基因与应用，利用未培养微生物提取mRNA，建立cDNA文库，因此，利用微生物学、分子生物学的方法，构建高效水解阿魏酸酯的酯酶工程菌，获得高活力的阿魏酸酯酶工程菌，在发掘和利用自然界中阿魏酸酯酶编码基因资源方面具有科学价值，同时为实现该酶的工业化生产奠定基础，在利用生物质生产的第二代生物质燃料和自然资源的有效利用方面，也具有广泛的应用前景。
文档编号C12N1/21GK102002508SQ20101052390
公开日2011年4月6日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者张桂荣, 权宇彤, 王贞佐, 程瑛琨, 蒋振彦, 高贵 申请人:吉林大学