专利名称：一种高效生产l-缬氨酸的发酵工艺的制作方法
一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺技术领域：
本发明涉及一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺，属于发酵法生产氨 基酸的技术领域。背景技术：
L_缬氨酸(L-valine)属于分支链氨基酸，是人体必需氨基酸之一。 近年来，由于氨基酸在食品、医药、饲料、农业和日用化工等方面有极其广泛的用途，尤其随 着抗癌药物制剂、氨基酸输液制剂及甜味二肽生产的飞速发展，对原料氨基酸的需求量日 益增长，市场需求量不断增加。最近，人们发现L-缬氨酸是合成一种免疫抗生素的重要中 间体，其年消耗量猛增到数千吨，现在世界L-缬氨酸年产量已达到10000吨以上。在整个 氨基酸生产工业中，随着氨基酸输液需求的不断增长，L-缬氨酸的需求也将增长，其生产已 占有重要的地位。另外，缬氨酸在食品、化妆品和饲料工业上也有着广泛的应用。缬氨酸发 酵是典型的代谢控制发酵。国内虽有天然蛋白质水解液分离提取L-缬氨酸的产品，但产量 很低，质量不佳，纯度不高，无法实现大规模工业化生产。利用微生物发酵法生产L-缬氨酸 具有原料成本低，反应条件温和及易实现大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法。 但是，以微生物发酵法生产L-缬氨酸，国内大多数菌株的产酸水平不高，特别是L-缬氨酸 的生产水平和产量远不能满足国内市场的需求。因此，开展发酵法生产L-缬氨酸的研究具 有极其重要的意义。而且，随着近年来原材料价格的不断上涨和市场竞争的愈加激烈，为了在提高缬 氨酸产量和转化率的同时能够降低生产成本，仍有大量关于缬氨酸发酵方面的研究报道， 主要集中在诱变选育缬氨酸高产菌株、发酵过程控制与优化和新原料的开发等方面。缬氨酸生产菌属于营养缺陷型突变株，能在胞外大量积累缬氨酸是由于菌体的代 谢处于异常状态，对环境条件非常敏感。发酵条件如碳源、氮源、无机盐、生物素、PH、温度及 溶氧等对缬氨酸的合成都具有重要影响。其中，底物(如葡萄糖)浓度是控制菌体代谢过 程的一个重要参数，主要通过控制相关酶的合成或活性影响菌体的代谢途径。葡萄糖可通 过“葡萄糖效应”阻遏、抑制多种酶的合成，如氨基酸合成酶等，这种阻遏作用主要是其分解 代谢物引起的。在以葡萄糖为碳源的缬氨酸发酵中，葡萄糖的分解代谢物阻遏会引起多种 副产物如乳酸的积累，从而影响糖酸转化率。此外，溶氧也是一个至关重要的因素，杂酸的 产生和碳架的浪费与溶解氧浓度密切相关。因此在发酵过程中必须控制恰当的溶氧值，以 优化代谢流分布，增大L-缬氨酸产率，减少杂酸的生成。目前，我国L-缬氨酸在生产工业上主要采用分批发酵模式。在这种生产模式中， 维持一定的底物(如葡萄糖)浓度对于缬氨酸的发酵非常重要。为达到经济技术的要求， 要提高单批次发酵过程中的缬氨酸产量就要提高初始培养基中的底物(如葡萄糖)浓度， 但底物浓度过高会引起渗透压过大，影响菌体的正常代谢及缬氨酸的产量。反之，初始葡萄 糖浓度较低有利于菌体的生长，但后期发酵液中的残糖迅速耗尽，其生产能力不能得到最 大限度的发挥。与此同时，在目前的生产模式中，溶氧浓度往往不能得到很好的控制，溶氧 水平浮动很大，不能长时间稳定的维持在一个恰当的水平上。在缬氨酸发酵过程中，由于 L-缬氨酸合成不是经由三羧酸循环，而是由丙酮酸为前提物合成，当供氧不足时，葡萄糖降 解通过TCA循环的氧化受到抑制，细胞内丙酮酸库水平提高，有利于前体物增加，从而导致L-缬氨酸产量增加。而溶氧过高时，乙酰乳酸合成酶酶活明显降低，且TCA循环流量加大， 造成碳流损失；但溶氧过低时，TCA循环代谢流量减小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，从而 刺激了乳酸脱氢酶的酶活，使代谢流转向乳酸生成，造成乳酸积累。这两种情况均不利于缬 氨酸生成。此外，现有的很多L-缬氨酸发酵培养基配方都不能很好的最大限度去满足其相 应生产菌株的生长代谢和产酸要求。
发明内容本发明的目的在于克服现有的缬氨酸生产方法发酵产酸量较低、糖 酸转化率低等缺陷，提供一种高效发酵生产L-缬氨酸的方法。在不增加额外设备和人力投 入的情况下，实现了整个发酵周期的缩短和L-缬氨酸产量和转化率的大幅提高，适合于工 业化生产。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供的一种高效发酵生产 L-缬氨酸的方法，包括种子培养和进行发酵产酸，其特征是发酵过程中，通过调节发酵罐 搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平上，整个发酵过程既不产生较多乳酸等杂酸副 酸，也不导致由于TCA循环流量加大而造成碳源大量流失，通过流加液氨控制pH，通过流加 适量泡敌消泡，并通过流加一定较高浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在一定水平，使整个发 酵过程中既不产生葡萄糖抑制，也不构成底物限制，发酵至60h停止。该方法的具体步骤如下(1)培养种子配制种子培养基[葡萄糖2.5%、酵母粉0.4%、玉米浆1.5%、豆饼 水解液 1%、ΚΗ2Ρ04 ·3Η20 0. 1 MgSO4 ·7Η20 0· 04%、MnSO4 ·H2O 0. 001%,VB1 0. 00003%, VH 0.00002%、尿素0.05% ]，121°C灭菌15min ；将菌种接入种子培养基中，接种量一般为 10% ；在适宜的温度、pH和溶氧条件下于5L自动控制发酵罐中培养至对数期。(2)低氧发酵将步骤(1)制得的种液以10% 20%接种量接种发酵，控制发酵 液温度为32°C;通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧0 18h 为20%左右，18h以后为5% 10% ；通过自动流加25%的液氨控制pH在6. 7 7. 0 ；通 过流加适量泡敌消泡；并通过流加浓度为600 900g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0. 5 2.0%，发酵至60h停止。本发明的优点和积极效果与现有工艺相比，本发明的方法具有以下特点1、本发明通过适当流加较高浓度的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在恰当水平，使整 个发酵过程中既不因葡萄糖浓度过高而引起渗透压过大且产生“葡萄糖效应”阻遏分解代 谢物，也不因葡萄糖浓度过低而构成底物限制，使发酵液中的残糖迅速耗尽，导致菌种生产 能力不能得到最大限度的发挥；2、本发明通过适当调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧浓度控制在恰当的水平上， 使整个发酵过程中既不因溶氧浓度过低导致TCA循环代谢流量减小，不足以平衡葡萄糖酵 解速率，从而刺激了乳酸脱氢酶的酶活，使代谢流转向乳酸生成，造成乳酸积累，也不因溶 氧浓度过高导致TCA循环流量加大生成大量C02而造成碳源的大量流失，而且引起乙酰乳 酸合成酶酶活明显降低，致使L-缬氨酸产量下降；3、本发明在与现有生产工艺相比不增加任何额外设备和人力投入的情况下，缩短 了整个发酵周期，种子培养缩短至7 9h，并大幅提高了 L-缬氨酸的产量(55g/L以上)和 转化率(25%以上)，整个工艺过程操作简便，生产成本较低，经济效益显著，十分适合于工业化生产。
具体实施方式实施例1 使用的微生物菌种为现有缬氨酸生产菌。用上述菌株进行高效发酵，所用培养基 有两种(1)种子培养基葡萄糖2.5%、酵母粉0.4%、玉米浆1.5%、豆饼水解液1%、 KH2PO4 0.1%, MgSO4 ‘ 7Η20 0. 04%、MnSO4 · H2O 0. 001 %、VBJOOug/L、VH 200ug/L、尿素 0. 05%。用 NaOH 和盐酸调 pH 至 6. 7 7. 0，121°C灭菌 15min。(2)发酵培养基葡萄糖6%、玉米浆2.5%、豆饼水解液2.5%、KH2PO4O. 05%、 MgSO4 · 7H20 0. 02 %, MnSO4 · H2O 0. 001 Met 0. 05 lie 0. 006 Leu 0. 02 VB10. 00001%, VH 0. 000008% ο 用 NaOH 和盐酸调 pH 至 6. 7 7. 0，115°C灭菌 20min。将菌种接入种子培养基中，接种量为10% ；在32°C、pH为7.0和溶氧为20%条 件下于5L自动控制发酵罐中培养8h至对数期，按10%的接种量接入含有发酵培养基的 5L自动控制发酵罐中，控制发酵液温度为32°C，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分 阶段供氧模式控制溶氧0 18h为20%，18 60h为5%，通过自动流加液氨控制pH在
6.7 7. 0，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为600g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在 0. 5%，发酵至60h停止。L-缬氨酸的产量为56g/L，糖酸转化率为25. 5%。实施例2:使用的微生物菌种为现有缬氨酸生产菌。用上述菌株进行高效发酵，所用培养基 有两种(1)种子培养基同实施例1。(2)发酵培养基葡萄糖10%、玉米浆1.5%、豆饼水解液3.5%、KH2PO4O. 1%、 MgSO4 ·7Η20 0. 03%,MnSO4 0. 001%,Met 0. 05%,Ile 0· 006%、LeuO. 02%、VB1 0. 00002%, VH 0. 000015% ο 用 NaOH 和盐酸调 pH 至 6. 7 7. 0，115°C灭菌 20min。将菌种接入种子培养基中，接种量为10% ；在32°C、pH为7. 0和溶氧为20%条件 下于5L自动控制发酵罐中培养8h至对数期，按10%的接种量接入含有发酵培养基的5L自 动控制发酵罐中，控制发酵液温度为32°C，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段 供氧模式控制溶氧0 18h为20 %，18 60h为5 %，通过自动流加液氨控制pH在6. 7
7.0，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在2%左 右，发酵至60h停止。L-缬氨酸的产量为57g/L，糖酸转化率为26%。实施例3 使用的微生物菌种为现有缬氨酸生产菌。用上述菌株进行高效发酵，所用培养基 有两种(1)种子培养基同实施例1。(2)发酵培养基葡萄糖8%、玉米浆0. 5%、豆饼水解液4. 5%、KH2PO4O. 1%, MgSO4 ·7Η20 0. 04%,MnSO4 0. 001%,Met 0. 05%,Ile 0· 006%、LeuO. 02%、VB1 0. 00002%, VH 0. 000015% ο 用 NaOH 和盐酸调 pH 至 6. 7 7. 0，115°C灭菌 20min。将菌种接入种子培养基中，接种量为10% ；在32°C、pH为7. 0和溶氧为20%条件下于5L自动控制发酵罐中培养8h至对数期，按10%的接种量接入含有发酵培养基的5L自 动控制发酵罐中，控制发酵液温度为32°C，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段 供氧模式控制溶氧0 18h为20 %，18 60h为5 %，通过自动流加液氨控制pH在6. 7 7. 0，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为900g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在1 1. 5%，发酵至60h停止。L-缬氨酸的产量为59g/L，糖酸转化率为27%。
权利要求
一种高效生产L 缬氨酸的发酵工艺，包括种子培养和进行低氧控制发酵，其特征是发酵过程中，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平上，使整个发酵过程既不产生较多乳酸，也不导致由于TCA循环流量加大生成大量CO2而造成碳源大量流失，通过流加液氨控制pH，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在较低水平，使整个发酵过程中既不产生葡萄糖抑制，也不构成底物限制，发酵至60h停止。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是发酵过程中流加糖浓度为600 900g/L，残 糖控制在0.5 2.0%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的发酵液的溶氧浓度为分阶段控制 0 18h 为 10-30%, 18h 以后为 5~15% 0
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵液中各组分占总量的百分比为 接种量10 20%，葡萄糖6 10%，玉米浆0.5 2.5%，豆饼水解液2. 5 4.5%， MgSO4 ·7Η20 0. 02 0. 04%,MnSO4 · H2O 0. 0005 0. 001 %，MetO. 05%、Ile 0. 006%,Leu 0. 02%, Vbi 0. 00001 0. 00002%, VH0. 000008% 0. 000015%。
全文摘要
一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺。解决现有生产工艺产酸量较低且糖酸转化率低等问题。本发明包括以营养缺陷型和缬氨酸渗漏型菌株为生产菌株，以一些营养组分按一定比例配制成营养丰富且均衡的培养基作为发酵培养基，发酵过程中，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平上，通过流加液氨控制pH，并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在较低水平，发酵至60h停止。本发明在不增加任何额外设备和人力投入的情况下，缩短了整个发酵周期，并大幅提高了L-缬氨酸的产量(55g/L以上)和转化率(25％以上)，整个工艺过程操作简便，生产成本较低，十分适合于工业化生产。
文档编号C12P13/08GK101962664SQ20101052743
公开日2011年2月2日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日 公开号201010527435.发明者冯宁, 刘淑云, 徐庆阳, 谢希贤, 陈宁 申请人:天津科技大学