专利名称：筛选具有抗氧化作用的细菌的方法
技术领域：
本发明属于筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法的领域。
背景技术：
所有活体都在其细胞内保持还原环境。然而，由于线粒体的需氧代谢以及其他因素，产生了诸如过氧化物和氧自由基的活性氧源性物质。还原环境由诸如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的酶维持。如果正常的氧化还原状态遭到破坏，活性氧物质可破坏包括蛋白质、脂质且尤其是DNA在内的所有细胞组分。活性氧物质的产生和去除活性中间体毒性或修复由活性氧物质引起的 损害 的能力之间的这种失衡，称为氧化应激。在人体内，氧化应激是衰老以及与衰老有关的退行性疾病(例如癌症、关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、卢伽雷氏症、帕金森氏病、心脏衰竭、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病)的重要因素。衰老的自由基理论认为，生物体衰老是由于细胞随时间累积了由活性氧物质引起的损害。为了阻止氧化应激的有害作用，需要筛选具有抗氧化性质的膳食组分。特别地，食品级细菌，尤其是乳酸细菌是合适的抗氧化膳食组分，原因是它们的使用通过肠道定殖而有利地导致对抗氧化作用的长期作用。US 6，884，415专利公开了通过使含具有超氧化物歧化酶(SOD)样活性和过氧化氢酶(CAT)活性的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)的食品在含猛的天然物质存在下发酵而生产的抗氧化食品。然而，已知包括乳酸细菌在内的食品级细菌可以具有不依赖于过氧化氢酶或SOD活性的抗氧化性质。国际申请WO 03/002131公开了发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株作为抗氧化益生菌。该菌株的抗氧化性质通过体外的酶促试验和通过测定谷胱甘肽还原/氧化电位而表征。WO 00/20013国际申请公开了乳酸杆菌属(Lactobacillus)或丙酸杆菌属(Propionibacterium)菌株,其在哺乳动物的肠内产生数量提高的丙酸,用于制造降低诸如IL-6、活性氧物质和粘附分子的氧化应激因子的药物。秀丽隐杆线虫(C. elegans)是自由生长的透明线虫(线虫类)，其生长在温和的土壤环境中。秀丽隐杆线虫以细菌，尤其是大肠杆菌(Escherichia coli)0P50菌株为食，其由于多种原因而已被广泛用作模型生物。秀丽隐杆线虫株廉价，易于培养，并可以冷冻，且在随后被解冻时仍保持存活而便于长期储存，其具有短且可再生的寿命。秀丽隐杆线虫具有作为足够简单的多细胞真核生物而进行非常细致的研究的优势。该类线虫在整个基因组中具有接近40%的人垂直同源基因，这使得其成为与人类状况相关的生物。秀丽隐杆线虫已经用作评价氧化损伤和对衰老的影响的动物模型系统(Larsen, 1993, PNAS 90:8905-8909)。该研究利用与其亲本株相比对氧化应激具有高度抗性的突变株展开。此外，Ikeda等人(2007，AEM 73:6404-6409)已经研究了乳酸细菌对秀丽隐杆线虫寿命及其沙门氏菌属(Salmonella)抗性的影响。作者认为，秀丽隐杆线虫可能是用于筛选益生菌菌株(当摄入足量时对人的健康产生有益作用)或膳食性抗衰老物质的合适模型。然而，在该研究中并没有评价对氧化应激的抗性。还已知，秀丽隐杆线虫的寿命提高与胰岛素通路有关，且与人体内涉及胰岛素样生长因子和糖尿病的垂直同源基因有关(Glenn等人，2004，J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 59:1251-1260)。
发明内容
本发明的发明人发现，秀丽隐杆线虫动物模型系统是用于筛选食品级细菌对抗氧化应激损害作用的能力的合适模型。所述筛选试验可以在其中加入了细菌的含液体培养基的微滴定平板中进行，也可以在具有所饲喂的细菌菌苔的琼脂平板上进行。特别地，可以利用秀丽隐杆线虫测试这些食品级细菌对氧化应激、尤其是氧化活性物质形式的氧化应激引起的损害的预防作用。发现对秀丽隐杆线虫施加氧化应激的合适方式是加入过氧化氢。本发明的筛选方法相对简单，然而所获得的结果与人类状况有关。最 后，有利的是，所述方法可以筛选具有整体抗氧化应激作用的食品级细菌菌株，而不像现有技术那样受到抗氧化作用涉及的特定机制，例如特定酶的存在(例如CAT、S0D)或特定因子的释放的选择的限制。
具体实施例方式
_2] 使用秀丽隐杆线虫的筛选方法本发明的一个实施方式涉及筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法，所述方法包括a.使秀丽隐杆线虫的生长同步的步骤；b.用待测试的食品级细菌饲养所述秀丽隐杆线虫的步骤；c.在氧化应激存在下温育所述秀丽隐杆线虫的步骤；d.测定在氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力的步骤；以及e.选择在氧化应激存在下产生所述秀丽隐杆线虫的最高存活率的食品级细菌的步骤。本发明的另一个实施方式涉及秀丽隐杆线虫在筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法中的应用。使秀丽隐杆线虫的生长同步化，原因是本发明的方法有利地在处于相同生长状态的线虫上进行。培养秀丽隐杆线虫以及使之同步化的方法为本领域已知(ff. B. Wood(编辑)“The nematode Caenorhabditis elegans” Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York,第 587-606 页；Chen 等人，2008，J. CellCommun. Signal. 2:81-92)。实现同步化生长的合适方式是从妊娠成虫收集虫卵并开始孵化这些虫卵。孵化虫卵的合适方式是在加入了 5iig/ml胆固醇的M9培养基(10%vol MRS(DeMan, Rogosa, Sharpe培养基)，氟代脱氧尿苷100 ii g/ml)中过夜温育这些虫卵。随后，可以分离L1期线虫并按照本领域已知方法进行培养(W.B. Wood(编辑)“The nematodeCaenorhabditis elegans”；上文引用)。优选地，将线虫培养在微滴定平板的孔内。优选地，将线虫在没有振荡下在25。C和80-85%相对湿度下培养三天。
在本发明方法的优选实施方式中，使用了秀丽隐杆线虫突变株BA17fem_l(hcl7)(Nelson等人，1978，Dev. Biol. 66:386-409)。有利的是，该秀丽隐杆线虫突变株在25° C的繁殖力受到限制，从而更易于控制其生长和繁殖。在本发明方法的步骤b的优选实施方式中，使用大肠杆菌，优选大肠杆菌0P50 (其是秀丽隐杆线虫的常规食物源)作为对照食物。除了对照食物外，可在待测定的食品级细菌存在下培养线虫。优选地，为了找到不同条件之间的相关差异，每个测试条件至少有50只线虫(存在或不存在氧化应激)。当线虫达到成虫期时，优选在3天培养之后，可以在氧化应激存在下温育这些线虫。采用氧化应激的合适方式是通过加入过氧化氢，优选加入浓度在ImM至20mM之间的终浓度，更优选在2mM至IOmM之间的终浓度，甚至更优选在2mM至5mM之间的终浓度的过氧 化氢。5mM过氧化氢是最佳浓度。优选地,作为对照，不加入H2O2。在本发明方法的步骤c的优选实施方式中，秀丽隐杆线虫在氧化应激存在下温育5分钟至48小时，更优选I小时至10小时。5小时是用于该温育步骤的合适时间。实施在氧化应激存在下的温育步骤的一个方式是在液体培养基中，例如在微滴定平板的孔中。该方法的优势是，可以同时测试多个条件。或者，所述方法可以在固体培养基，例如琼脂平板上进行。该方法与微滴定测试法相比更费力耗时，但优势是可以排除食品级细菌对氧化应激诱导剂(例如过氧化氢)的直接作用。在本发明方法的步骤c的实施方式中，作为对照，秀丽隐杆线虫还可以在无氧化应激存在下进行温育。在本发明方法的步骤d的优选实施方式中，抗氧化抗性的评价作为存活力读取。这可以通过显微镜观察。如果线虫麻痹或者没有观察到活动，则认为线虫死亡。在本发明方法的步骤d的实施方式中，当具有在步骤c无氧化应激存在下作为对照温育的秀丽隐杆线虫时，将在氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力与在无氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力进行比较。本发明方法的最后步骤e可以通过选择赋予秀丽隐杆线虫在氧化应激存在下的高存活率的食品级细菌而进行。在所述步骤e的优选实施方式中，同时评价秀丽隐杆线虫在无氧化应激存在下的存活率并将其设为100%。在所述步骤e的另一个实施方式中，对食品级细菌和对照食物(例如大肠杆菌)对秀丽隐杆线虫的存活率(或者存活力)的影响进行比较。食品级细菌本发明的食品级细菌涉及选自以下的细菌双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳酸杆菌属(Iactobacillus)、乳球菌属(Iactococcus)、链球菌属(streptococcus)、足球菌属(pediococcus)、明串珠菌属(Ieuconostoc)、酒球菌属(oenococcus)、肠球菌属(enterococcus)、气球菌属(aerococcus)、肉食杆菌属(carnobacterium)、魏斯氏菌属(weisella)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、杆菌属(bacillus)、芽孢乳酸杆菌属(sporolactobacillus)、棒状杆菌属(corynebacterium)和短杆菌属(brevibacterium)。优选地，所述食品级细菌为乳酸细菌(LAB)。本发明的乳酸细菌涉及选自以下的细菌双歧杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、足球菌属、明串珠菌属、酒球菌属、肠球菌属、气球菌属、肉食杆菌属和魏斯氏菌属。更优选地，所述食品级细菌选自乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属和双歧杆菌属。所测试的食品级菌株可以按照本领域已知方法进行培养。通过示例的方式，属于双歧杆菌属、乳酸杆菌属和链球菌属的菌株分别培养在具有半胱氨酸的MRS、MRS和Elliker培养基中。在本发明方法的优选实施方式中，对于微滴定平板测试法，所测试的食品级细菌是有存活力的。在本发明方法的另一个优选实施方式中，对所述食品级细菌进行预培养并在对数期收集。
在本发明方法的另一个优选实施方式中，将不同的食品级细菌的培养物加入到含秀丽隐杆线虫的液体培养基中，终浓度为IxlO5个细胞/ml至IxlO8个细胞/ml，更优选IxlO6个细胞/ml至IxlO7细胞个/ml。4xl07cfu/ml是用于液体培养基中的测试的优选浓度。或者，当在琼脂平板上测试秀丽隐杆线虫时，待测试的食品级细菌可以以菌落的形式或者菌苔的形式存在于琼脂平板上。在本发明方法的另一个优选实施方式中，在抑制食品级细菌的进一步生长的抗生素存在下将所述食品级细菌加入至秀丽隐杆线虫生长培养基中。此外，必须存在在实验过程中抑制所述细菌进一步生长的抗生素。优选地，在抗生素，更优选卡那霉素，甚至更优选10至IOOil g/ml浓度的卡那霉素存在下，培养并温育线虫。有利的是，卡那霉素还抑制对照食物埃希氏大肠杆菌的生长。抑制乳酸杆菌的一些菌株的其他合适的抗生素为万古霉素、新霉素和红霉素。应思本发明的方法优选用以筛选抵御氧化应激和/或防止氧化应激施加的损害的食品级细菌的菌株。这些食品级细菌随后可用于药物组合物、营养补充剂和/或食物组合物广品的制造。此类组合物适于遭受氧化应激的人。特别地，老年人是合适的目标人群，原因是老化的肠道和免疫衰老往往对氧化应激和ROS的产生的抗性效力较低。实施例I :在微滴定平板中基于在具有或没有氧化应激下秀丽隐杆线虫存活率筛选乳酸细菌测试属于双歧杆菌属、乳酸杆菌属和链球菌属的100株食品级菌株的抗氧化性质。将这些菌属分别培养在具有半胱氨酸的MRS、MRS和Elliker培养基中。由于体内抗氧化活性的生物测试法利用不同乳酸细菌的活细胞样品进行，在对数生长期收集细菌。在分析生长曲线后，细胞收集的最佳时间为培养15小时后链球菌属、乳酸杆菌属和双歧杆菌属的D06°°分别为1、1. 5和I. 7。将按照上述获得的不同乳酸细菌的培养物添加至混合物中，终浓度为4xl06个细胞/ml。随后，对100个细菌菌株对避免大肠杆菌生长而使用的抗生素卡那霉素的敏感性进行分析。必须存在该抗生素以防止所述细菌在测试中的进一步生长。发现浓度为30iig/ml的卡那霉素足以抑制大肠杆菌0P50的生长,属于双歧杆菌属和乳酸杆菌属的20%的细菌菌株不受该抗生素的抑制。然而，由于双歧杆菌属不能在需氧条件下增殖，不必要存在抗生素。抑制一些乳酸杆菌菌株的其他合适的抗生素为万古霉素(250ii g/ml)、新霉素(10-35 u g/ml)和红霉素(1-100 u g/ml)。使用秀丽隐杆线虫突变株BA17fem-l (hcl7)进行试验，该突变株在25。C的繁殖力受到抑制。通过在20° C从妊娠成虫分离虫卵并在加入了 5 ii g/ml胆固醇的M9培养基(10vol%MRS,氟代脱氧尿苷IlOii g/ml)中过夜孵化这些虫卵并在微滴定平板的孔中分离L1期线虫，而使BA17线虫同步化。将所述线虫在没有振荡下在25° C和80-85%相对湿度下培养3天。将这些幼虫转移至含加入了胆固醇的M9培养基的平板中，在25° C和80-85%相对湿度下培养3天，同时进行对照或实验培养。每孔至少有50只线虫。3天后，当线虫达到成虫期时,通过添加过氧化氢H202 (2mM、3mM和5mM)而施加氧化应激，或者没有H2O2 (无应激对照)。在该实验中使用两个对照，具有大肠杆菌而非乳酸细菌的孔作为细菌饲喂对照，具有大肠杆菌和2mM、3mM或5mM H2O2的孔作为氧化应激对照。发现浓度为5mM的H2O2最佳。抗氧化应激抗性作为存活力读取，在5小时后通过显微镜进行评价。将线虫温育在这些条件下5小时。为了对抗氧化能力评分，如果线虫麻痹，则认为 其死亡(受应激)。在与大肠杆菌一起温育的时间中在无氧化应激存在下，存活力在100%至约90%之间变化。在最初的测试中，乳酸细菌具有类似或更好的存活率，这表示类似的或提高的寿命。一些所筛选的菌株的影响的结果不于下表I中。表I :乳酸细菌食物对秀丽隐杆线虫寿命的影响
菌株存活力(％)^
S2A95 7
SlB98 0
S2B9471
SlC9475
SlD98 2
SlE100.0
SlF95.
SlG98 2
SlH9771
L2A90
L5A100
权利要求
1.筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法，所述方法包括 a.使秀丽隐杆线虫的生长同步的步骤； b.用待测试的食品级细菌饲养所述秀丽隐杆线虫的步骤； c.在氧化应激存在下温育所述秀丽隐杆线虫的步骤； d.测定在氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力的步骤；以及 e.选择在氧化应激存在下产生所述秀丽隐杆线虫的最高存活率的食品级细菌的步骤。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于， 步骤c进一步包括作为对照在无氧化应激存在下温育秀丽隐杆线虫的步骤；和 步骤d进一步包括比较在氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力与无氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力的步骤。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述秀丽隐杆线虫为秀丽隐杆线虫突变株 BA17fem-l(hcl7)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在微滴定平板的孔内培养所述秀丽隐杆线虫。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在琼脂平板上培养所述秀丽隐杆线虫。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，作为对照，一组线虫接受大肠杆菌饲喂、更优选大肠杆菌0P50饲喂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,在抗生素存在下培养和温育 所述线虫。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗生素是卡那霉素，优选浓度为10至100 μ g/ml的卡那霉素。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，通过添加过氧化氢(H2O2),施加所述氧化应激，优选地，过氧化氢的终浓度为I至20mM。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤C进行5分钟至48小时，优选I小时至10小时。
11.根据权利要求ι- ο中任一项所述的方法，其特征在于，所述食品级细菌是属于乳酸细菌的菌株。
12.秀丽隐杆线虫在筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述食品级细菌是乳酸细菌。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其特征在于，所述秀丽隐杆线虫为秀丽隐杆线虫突变株 BA17fem-l (hcl7)。
全文摘要
本发明涉及使用秀丽隐杆线虫筛选对氧化应激具有抵御作用的食品级细菌的方法。
文档编号C12Q1/02GK102858993SQ201080060930
公开日2013年1月2日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者詹弗兰科·格龙波内, 玛丽-克里斯蒂娜·德吉弗里, 丹尼尔·拉蒙·维达尔, 巴特里夏·马托雷利·格罗拉, 努里亚·冈萨雷斯·马丁内斯, 萨尔瓦多·赫诺韦斯·马丁内斯, 索菲·勒格兰-拉斯波, 伊莎贝尔·尚博, 拉斐尔·布尔代-西卡尔 申请人:热尔韦·达诺尼公司, 佰欧波利斯有限公司