减少经处理的精子样品中的dna断裂的方法和系统的制作方法

专利名称：减少经处理的精子样品中的dna断裂的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明实施方式总体涉及用于减少各种经处理的细胞和精子细胞的群体中的DNA断裂事件的数量的方法和系统，更具体而言，涉及用于改变细胞处理和精子分选过程以减少各种细胞和精子悬浮液中的DNA断裂事件、用于减少各种细胞和精子样品中的DNA的断裂发生率以及用于改善辅助生殖技术和操作的整体成功率的方法和系统。
背景技术：
精子和性别分选的精子(基于携带X或者Y染色体分选的精子)对辅助生殖技术，特别是畜牧繁殖业具有重大意义的生物材料。但是，损伤的和/或死亡的精子缺乏通过人工授精(Al)、体外受精(IVF)、胞质内精子注射(ICSI)、胚胎移植(ET)或者其它辅助生殖技术产生后代的活力。损伤的细胞可以包括膜改变的细胞、经历细胞凋亡的细胞、以及具有DNA断裂的细胞。损伤的精子，当其存在于辅助生殖技术中使用的有活力的精子群体中时，可能能够使卵子受精，但是可能无法产生有活力的胚胎或者产生的胚胎具有基因异常(其不会正常发育或稍后死亡)。以这种方式，具有DNA断裂的精子和有活力的精子竞争，减少了成功妊娠的总体可能性，增加了产生畸变后代的可能性。Simon等(Human Reproduction, Vol. 25No. 7pp. 1594-1608(2010))证明了 精子DNA断裂比率的增大对采用例如IVF和ICSI等辅助生殖技术的妊娠率和胚胎发育具有不利影响。因此，需要这样的涉及精子和其他生殖细胞处理的方法和系统，其能减少经处理的生殖细胞或分选的精子亚群体，特别是用于辅助生殖过程中的分选的亚群体中的DNA断裂水平或DNA的断裂率。更具体而言，对于处理常规的精子和性别分选精子存在该需求。性别分选的精子是性别富集的精子亚群体，其以携带X染色体或Y染色体为特征并基于此进行分选。利用所述性别分选的精子，可以以高度确定性产生具有所期望的性别的后代，因而特别有利于乳制品和牛肉工业。绝大多数的精子分选方法采用流式细胞分析和过程，其通常结合非毒性DNA结合荧光染料，该染料在适宜的条件下透过细胞膜，以化学计量方式和细胞的DNA相关联。与各精子关联的染料的量与包含在每个细胞中的DNA的量密切相关，其根据激光激发可使得带有Y染色体的精子和带有X染色体的精子产生可区分的荧光模式。美国专利5，135，759,6, 357，307,7, 371，517和7，758，811 (其中每个都通过引用的方式并入本文)提供了基于X染色体和Y染色体差异的适于精子分选的系统和方法。虽然所有动物的新鲜精液本身含有一定基准数量的具有DNA断裂的精子，来自各个捐助者的精液中的DNA断裂的总体水平却可随着以下因素的不同而变化，如氧化应激、细胞凋亡、组蛋白-鱼精蛋白的无法替代、和其他与精液产生相关的环境因素等。在随后的精子处理过程中，这些DNA损伤因子的一部分可以被复合。除此之外，鉴于精子通常是易损的细胞，那么体外射精后得到的精子样品在大多数精子处理过程(同时准备授精样品)中可能会遭受到额外的医源性的损伤。特别是，精子性别分选的方法学包括几个步骤，对细胞制造应力刺激，其不仅是损伤，还可以有助于和加强潜在的医源性损伤。由于所述分选过程某些步骤中所制造的损伤可以整个分选过程中耐受的化学和物理应力而复合，因此特别需要最大限度地减少在精子群体被处理、分选和存储时该群体中DNA断裂事件的发生。因而，需要通过减少分选的精子群体中的DNA断裂的发生来改善经处理的精子样品的活力的方法和系统，该方法和系统用于改善使用性别分选的精子的人工生殖授精技术和后代健康发育的成功率。

发明内容
本发明的实施方式通常涉及使用流式细胞仪和微流体装置的细胞分选方法，所述方法用于分选精子和其他生殖细胞，并且与初始的细胞或者使用常规的分选方法产生的经分选的精子样品相比，所述方法产生的精子群体显示出减少的DNA断裂量或减少的DNA断裂率。这些具有减少的DNA断裂量或减少的DNA断裂率的精子群体有利于改善使用辅助授精和/或受精技术(如Al、ICSI、IVF、ET及其他相关技术)的成功的出生率。 因此，本文中所公开的实施方式提供了用于减少经处理的细胞和分选的精子样品中的DAN断裂的总体水平的方法和系统。在一个方面中，本文中所公开的实施方式提供了通过减少初始细胞、精液或经处理的细胞样品中的细菌污染(在本公开中也称为细菌感染(BI))来减少细胞或精子群体中的DNA断裂的方法和系统。在另一个方面中，本文中所公开的实施方式涉及通过以逐步的方式控制样品的酸度来减少经处理的细胞样品，如精子样品或性别分选的精子样品中的DNA断裂率的方法和系统。在又一个方面中，本文中所公开的实施方式提供了用于性别分选精子的方法和系统，相比于此前的分选和处理方法，所述方法和系统具有减少了 DNA断裂的水平的改进步骤。在再一个方面中，本文中所公开的实施方式涉及改进的精子染色步骤，其通过添加具有较高pH的淬灭染料从而减少DNA的断裂并保存精子活力。在另一个方面中，本文中所公开的实施方式涉及采用新淬灭染料改进染色过程。令人惊讶的是，已经发现，黄色食品染料，更具体而言黄色6 (yellow 6)在分离精子时提供了有关分辨率的益处，并且需要较少的Hoechst染色剂。由于需要较少的染色剂，在分选过程结束时改善了精子的健康。


图IA示出了流式细胞仪中精子的前向角荧光V. s.侧向角荧光的代表性绘图。图IB示出了染色质扩散实验中含有精子的一侧，其中所述精子收集自特殊分选区域。图IC示出了染色质扩散实验中含有精子的一侧，其中所述精子收集自特殊分选区域。图2A示出了流式细胞仪中精子的前向角荧光v. s.侧向角荧光的代表性绘图。图2B示出了流式细胞仪中精子的选通部分(gated portion)，其绘制为前向荧光V. s.积分的前向荧光的图。图3A示出了常规的精子样品中随时间推移的DNA断裂的示意图。图3B示出了性别分选的精子样品中随时间推移的DNA断裂的示意图。图3C示出了在常规样品和性别分选的精子样品中随时间推移的平均DNA断裂的示意图。图4示出了根据本文提出的某些实施方式的流式细胞仪。
图5A示出了描绘未表现出细菌感染的样品中在不同时间的精子样品中的DNA断裂的百分率的线箱图。图5B示出了描绘未表现出细菌感染的样品中在不同时间的精子样品中的DNA断裂的百分率的示意图。图5C示出了描绘表现出细菌感染的样品中在不同时间的精子样品中的DNA断裂的百分率的线箱图。图示出了描绘表现出细菌感染的样品中在不同时间的精子样品中的DNA断裂的百分率的示意图。图6示出了几种不同的Red TALP处理的DNA断裂随时间推移的图示。图7A和B示出了样品精液的前向荧光V. s.侧向荧光的绘图。图8A和B分别示出了选通样品7A和7B的Rl区域产生的流式细胞仪中峰值前向荧光的直方图。
具体实施例方式在详述所述方法和系统之前，应当理解的是，所述方法并不限于本文中所公开的特定的实施方式，而是可以以多种方式实施。此外，被描述的方法和系统是以通常的方式公开，因此本领域技术人员一旦理解了这种一般性的规律，这些方法就能运用于具体的系统中。一些实施方式涉及产生不连续的亚群体的细胞分选方法，其中一些亚群体富含特定的特征，并且相比于通过此前的方法分选的精子，所分选的亚群体包含较少的细胞DNA断裂。通常，精子样品直接或间接地获自哺乳动物，包括但不限于Wilson，D.E.和Reeder, D. M. , Mammal Species of the World, Smithsonian Institute Press (1993)中列出的那些，该文献的文本整体以引用的方式特此并入本文中。这些哺乳动物包括但不限于牛、马、猪、犬、猫、海豚、山羊、绵羊和乌鸦。在一个实施方式中，纯精液(新鲜采集的精液)可通过现有技术中已知的增量剂(extender)或缓冲溶液进行稀释或离心分离来处理，从而保存增容的精子样品中精子的活动力和生殖力。在另一个实施方式中，精子样品也可以通过解冻此前冻存的和/或此前处理的精子(来自精子储存管)来建立。在又一个实施方式中，精子样品可包含分别去除其精子尾部的精子头部。在一个实施方式中，诸如喹诺酮等抗菌剂可以与细胞或精子样品结合以最大限度地减少精浆中和精子表面上的细菌及其他微生物的生长。喹诺酮是一组萘啶酸和/或氯喹衍生物，其包括但不限于环丙沙星、吡哌酸、噁喹酸和西诺沙星。抑制精子样品中的细菌生长已经与精子样品中DNA分裂的水平相关联。在一些实施方式中，喹诺酮可以是来自氟喹诺酮组的环丙沙星，并且作为主要的抗菌化合物添加。在其他的实施方式中，包含一种或多种抗生素的具有至少一种喹诺酮的喹诺酮混合物可以直接添加至精子或精液样品中，缓冲溶液中，增容的精子样品中，染色介质中，或者在处理精子时使用的另外介质中。通过孵育、混合或通过其他的方法可以平衡并均匀地分散包含抗生素或抗微生物剂的精子悬浮液。选择的喹诺酮在目标细胞或精子悬浮液中可以以约O. 05 μ g/πιΓ约20 μ g/ml、约O. 2 μ g/ml 约5 μ g/ml和/或约O. I μ g/ml 约2 μ g/ml存在。两种以上的喹诺酮可以各自以指定的浓度添加。经处理的或分选的精子可以被直接收集到包含喹诺酮或喹诺酮混合物的介质中。作为选择，喹诺酮或喹诺酮混合物也可以随后添加，包括在分选前，在分选后，乃至在分选、冷冻和解冻之后。缓冲溶液可包括一种或多种的缓冲体系，可以选自非穷尽性的目录，包括TRIS、柠檬酸钠、卵黄、奶、TALP、MOPS、HEPES类的缓冲剂、磷酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐、氟化物、包含BSA的缓冲液及其组合。 所述方法或系统可进一步包括基于所给定的精子样品的具体组成来调节或优化喹诺酮的组合的机制，从而调节喹诺酮的水平以最大限度地抑制特定的精子样品中的细菌的生长。该调节或优化的一个实例可涉及到监测并调节特定的精子样品的酸度以减少精子悬浮液中的DNA断裂的水平。所得到的精子样品于是可以预先冻存和/或预先性别分选。在该实施方式中，喹诺酮或喹诺酮的混合物可以在解冻后步骤中添加，或者在分选处理后步骤中添加。在一个实施方式中，可以将冻存的精子解冻并将喹诺酮添加至解冻的精子样品中。这可以与分选(如性别分选)相结合，并在分选(如性别分选)之前或之后进行。在另一个实施方式中，在加入喹诺酮之后可以冻存精子样品。在每一种情况中，经处理的精子可用于建立授精样品，无论其是常规的还是性别分选的。在另一个实施方式中，喹诺酮或喹诺酮混合物可应用于IVF过程或培养基以减少胚胎悬浮液中的细菌污染。在一些实施方式中，添加喹诺酮以实现显示出DNA断裂的细胞数的减少，其可以减少细胞悬浮液中的DNA断裂的整体水平。所述细胞悬浮液可以是任何类型的精液样品，如新鲜的、冷冻的、常规的、分选的，也可以是卵母细胞或卵母细胞衍生物的悬浮液，包括但不限于卵母细胞、去核细胞及其经注射的衍生物、经胞内注射的卵母细胞，冷冻胚胎以及其他相关的生殖细胞悬浮液。本文中的一些方面涉及增容的精子样品，该样品可包含精子、喹诺酮和/或缓冲溶液。在一个实施方式中，喹诺酮可包括氟喹诺酮，例如环丙沙星，不过也可以使用其他的喹诺酮。所述喹诺酮可以以约O. 05 μ g/ml 约20 μ g/ml、约O. 2 μ g/ml 约5 μ g/ml和/或约O. I μ g/πιΓ约2 μ g/ml的范围存在于新鲜的或增容的精子样品中。所述缓冲溶液可以是前述的任何一种，以及它们的任意组合。增容精子样品中的精子可包括以生殖力特征(例如X染色体或Y染色体的存在)而分选的精子。在另一个方面中，某些实施方式涉及消除或减少受到污染的细胞样品或细胞培养基中的细菌及其他微生物的水平的方法。该方法可包括下述步骤获得包含生殖细胞的细胞样品，并将一种或多种喹诺酮施用至细胞样品或细胞培养基以恢复具有最少可检测水平的细菌污染或不具有可检测水平的细菌污染的细胞系。所述生殖细胞可包括精子、卵母细胞、卵子、具有或不具有注入的DNA的去核配子、胚胎、可通过添加一种或多种喹诺酮来进行处理并孵育以实现喹诺酮的抗微生物效果的培养的胚胎。在另一个方面中，某些实施方式涉及用于产生胚胎的方法，该方法可以包括以下步骤获得精子样品、使精子样品与喹诺酮结合、抑制精子样品中的细菌生长和用精子使卵子受精。所述精子可以利用各种染色和分选方法来进行性别分选，所述方法包括但不限于如前所述的本领域中的那些标准方法。在另一个方面中，所述方法可涉及用改进的染色过程来处理精子样品的方法。该方法的第一步为获得精子，所述精子可以是前述的任一种精子悬浮液，包括此前被冷冻的精子样品。所述精子悬浮液然后用第一培养基中的DNA选择性染料染色，随后通过添加可含有第二染料的第二培养基来染色。可调整第二染料的PH配合第一染料的pH，或第二染料 的pH配合第一染料的pH与精子样品的pH的组合，以维持或调整pH至所需范围。调整第二染料的pH进行配合应当理解为例如包括以下操作使第二培养基的pH与第一培养基的PH相配；用适宜的缓冲系统改变第一培养基的pH以实现染色效果，然后再次调整pH至更合适的pH，从而将细胞损伤减至最少；或通过添加精子样品改变第一培养基的PH以达到所需的最终pH。通过减少对待染色的精子的潜在的pH的变化和冲击，或通过达到或接近最终的目标PH，可以完成调整第二培养基的pH进行配合的步骤。第二培养基或缓冲系统可包含第二淬灭染料以便于分选。调整第二培养基的步骤可包括调整第二培养基的pH至5. 5以上，在约5. 5 约7. 4之间，至约6. Γ约7. 4之间，约6. 4和约7. 4。第二培养基的pH可被调整为在第一培养基的2pH单位之内，第一培养基的IpH单位之内，或者基本上具有与第一培养基相同的pH。类似地，第二培养基也可以被调整为达到最终的精子样品的pH，即约6. 6 约7. 2。此前，没有认识到应用包含第二染料的pH 5. 5的培养基将杀死悬浮液内的精子。在pH 5. 5TALP接触部分溶液并开始混合时，但在悬浮液达到平衡之前，局部的浓度更偏酸性，具有较低PH的混合物实际上接触了很少的局部的精子亚群体，并损伤或杀死这些局部的精子，从而减少了精子样品的整体的精子活动性和活力。这样，添加PH 5. 5的培养基的处理步骤会对精子产生意想不到的负面效果。令人惊讶的是，该效果可能比施用更高PH的淬灭染料更具破坏性。传统上认为在较高的PH下施用淬灭染料将导致最终的悬浮液的pH对于精子的健康而言过高。对于本公开的目的，本领域的技术人员将认识到指定PH(例如5. 5pH)意味着与pH 5. 5相同。第一培养基可包括TALP类缓冲液，或另外的缓冲液，与DNA选择性染料(如发荧光的DNA选择性染料、Hoechst 33342或诸如本文中所描述的那些的其他染料)的组合。第二培养基可包含红色TALP，其可包括TALP类的缓冲液和红色食品染料。第二培养基可包含淬灭染料。所述淬灭染料可以是红色食品染料、黄色食品染料、percoll (经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液)、碘化丙啶、台盼蓝或已知渗透受损的细胞膜用于淬灭发荧光的染料的其他染料。如前所述，处理过的精子随后进行性别分选，并在选自以下缓冲液的缓冲液中进行增容TRIS、柠檬酸钠、卵黄、牛奶、TALP, MOPS、HEPES、磷酸盐、KMT、硼酸盐、碳酸氢盐、包含BSA的缓冲液和/或氟化物、以上物质的组合或其他用于精子处理或存储的已知的缓冲液。在一个实施方式中，以第一培养基和第二培养基染色的步骤可在单独的pH调整事件中完成。在另一个实施方式中，染色的精子可以被性别分选，然后冻存。在一些可能希望对精子样品进行性别分选的实施方式中，精子样品可以用荧光染料等标记来染色。所述标记可以是DNA选择性染料,如Hoechst 33342、Hoechst 33258、BBC,SYBR-14,SYBR Green I、双苯酰亚胺染料，或其组合。为了使精子均匀地且在合理的时间内吸收DNA选择性染料(如Hoechst 33342)，染色过程需要升高精子的温度和pH。温度可以升至34°C 39°C，pH升至约7. 2^7. 4。通过第一染色步骤可以对精子施加这些条件，在第一染色步骤中引入的第一培养基具有所需的pH、克分子渗透压浓度和DNA选择性染料的浓度。仅举一个实例来说，该第一培养基可以是补充有BSA(牛血清清蛋白)、卵黄、抗生素和其他添加剂的TALP类的或HEPES类的溶液。 在一些实施方式中，所述精子可以用淬灭染料来染色，红色食品染料、碘化丙啶或具有淬灭性质的另外的染料等。习惯上，制备第二培养基使其具有与第一培养基类似的组成，区别在于其中添加了淬灭染料并处于较低的pH以使总体样品的pH恢复至对精子的损害较低的水平。本发明的一个实施方式涉及以与第一培养基相同或相近的较高的PH提供第二培养基中的第二染料的方法。一个方面涉及用改进的淬灭染料来染色精子。该方法的起始步骤为获得精子。精子获自新鲜的精液、纯精液乃至解冻的此前冷冻的精液。精子随后在受控的染色条件下用荧色物染料孵育。受控的染色条件可包括在30°C 39°C的温度、在7. (Γ7. 4的pH孵育20分钟 I小时的时间。所述荧色物染料可以是诸如Hoechst 33342等荧光染料。淬灭染料可以在孵育步骤之后或在孵育期间加入到精子中。所述淬灭染料可以是黄色食品染料、橙色食品染料、绿色食品染料乃至蓝色饰品染料。更具体而言，所述淬灭染料可以是6号黄色食品染料。无论选择哪一种淬灭染料都应选择其展示改进的分选应用(如微流体分选或流式细胞仪)的分辨率。在一个实施方式中，使染色的精子随后流经诸如流式细胞仪或微流体装置等分选器，然后曝露于辐射能量。使用诸如Hoechst 33342等荧光染料时，辐射能量源可以是在UV波长操作的激光器。该激光激发可基于由染色精子所发出的荧光能来区分带X染色体和Y染色体的精子。在许多实施方式中，使用流式细胞仪或基于荧光或可见光发射的另外的分析技术，可对各染色精子进行评估。在流式细胞术中，精子被夹带在液体流中，然后该液体流被分裂成液滴，每个液滴理想地含有单个精子，其在检查区用激光等能量源单独地照射。激光是能量源的一个实例，不过弧光灯和其它辐射能源可以用来辐射被染色的精子。所述DNA选择性染料将吸收来自激光的能量并响应于激发而发出不同波长的光。这种发射光的量可以定量，以测定与样品中的其他精子相比的DNA选择性染料的相对量。DNA选择性染料的量随后可用于确定精子的特性，更具体地可用于确定是否单个精子含有X染色体或Y染色体。用于分选精子的系统可包括定位以用于检测在检查区内的辐射能量与和各精子相关联的DNA选择性染料的相互作用的传感器。该传感器可以是光电倍增管，其可基于这些发射的水平产生信号，并能够与用于处理信号且对各事件进行分选确定的分析器联通。评估该信号，以评估样品中的各精子的DNA特性。DNA特性可包括在各精子核中X染色体或Y染色体的存在。一旦通过所述分析器进行确定，信号可以传送至分离器以将样品分离为不同群体。例如，在一些使用流式细胞术的精子分选系统中，基于所述分析器产生的信号，通过对夹带精子的流体进行充电可以分离精子。构成液体流并与液体流分离的带电的液滴然后保持该电荷，并通过偏转平板而发生电磁偏转，从而引导所述液滴进入几个容器中的一个。分离的精子然后根据其DNA特性被分选到多个收集元件中。在经分诜的精子中的DNA断裂本文中提供的四个实验例示了将死亡的和DNA损伤的精子与有活力的精子样品分离的分选技术。死亡的和将死的精子群体中的精子有较高的DNA断裂频率，而分入有活 力的亚群体中的精子则存在较低水平的精子DNA断裂。通过组合多种分选技术(如使用流式细胞术的性别分选)，可以检测具有高水平的精子损伤，由此将该精子分选到死亡的亚群体中，而其余部分可包含活的亚群体，例如携带活的X染色体和/或活的Y染色体的亚群体。死亡的亚群体与活的亚群体均可包括受损伤的或者经历DNA断裂的细胞，但是其在活的亚群体细胞中的比率分布是最小的。证明DNA的损伤减少的实验在接下来的实验中，在3岁至9岁之间的年龄选择5只Jersey公牛和15只Holstein公牛，制备精子样品。每种性别分选的样品使用MoFlo SX TM (BeckmanCoulter, Miami, Florida)进行分选。基于使用 Hoechst 33342 (MolecularProbes, Eugene, Oregon)和红色食品染料(FD&C#40, Molecular Probes Eugene, Oregon)而产生的荧光信号的差异来分选精子。具有较高DNA含量的细胞，即X-染色体携带群体的荧光信号比具有较低DNA含量的细胞，即Y-染色体携带群体的荧光信号更强。红色食品染料通常被排除在具有健康完整的胞膜的那些精子之外，但其保留在具有受损的胞膜(其淬灭了那些细胞中的相当大量的荧光信号)的精子内。 在每个实验中，基于荧光信号的差异选择携带X-和携带Y-染色体的分选的精子，其使用 16. 2mM Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA),该染料在由 20%卵黄-TRIS扩增剂构成的捕捉液中稀释。使用与常规精液制备相同的标准，以及被选择用于要处理的精液的标准精液特征的截止值。在所有的实验中，用于常规的或性别分选的精子储存管精液的公牛精液只有满足以下标准时才能被使用1)55%的最小活动力；2)900xIO6 个精子/mL 的最小浓度，使用 SPl-Cassette, Reagent SlOO 和NuckH)(’(uintcr'K SP-lOO 系统(ChemoMetec A/S, Gydevang 43, DK-3450 Allerod, Denmark)测定，不过也可以使用其他相当的系统；和3) 15%的初级形态，15%的次级形态，以及总形态计数不超过25%。此外，用于解冻后分析的样品必须满足以下的标准质量控制条件1)前向运动活动力在Oh时至少45%，在3h时为至少30% ;和2)在3h时包括至少50%的完整的顶体。对于解冻3小时后的活动力以及顶体的测定，所有的样品在加湿室中于37°C孵育3h。对于所有精液的质量评估，使用 75x25mm 玻璃显微载玻片(Andwin, Addison, Illinois,美国)和 22x22mm#l. 5 盖玻片(Thomas Scientific, Swedesboro, New Jersey,USA)。使用明视野显微术进行所有的活动力评估，使用微分干涉对比(DIC)显微术(放大倍数为x400)进行后期的完整顶体和形态评估。实验中所用的全部扩增剂均具有相同的配方，其具有6. 8的pH，和在300m0sm时与TRIS扩增剂平衡的克分子渗透压浓度。对于冻存，使用甘油通过两步增容对分选的和常规的精子样品进行处理。实验中所用的所有冷冻-解冻的性别分选样品包含2. Ix IO6个精子/精子储存管(O. 25cc)，而常规的样品则具有25x IO6至30x IO6个精子/精子储存管(O. 5cc)的范围。来自每只单独公牛的纯精液被分成两等分试样。一个等分试样被性别分选，之后使用诸如MVDigitcool· (IMV, Ce dex, France)等自动冷冻装置将精子在低温稳定化后冷冻，并保存在液氮中。第二个等分试样被直接冻存，以用于解冻后的DNA断裂水平的后续分析。在进行了 X染色体和Y染色体的性别选择后对不同的亚群体进行精子DNA断裂分析，同时比较每只公牛的两份等分试样。在各实验中，使用Sperm-Halomax 试剂盒(Halotech DNA, Madrid, Spain)测定 DNA断裂。每个精子样品被裂解，然后制备在载玻片上的琼脂糖中。所述载玻片然后用SYBRI (Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregon)或者GELRED (Biotium, Hayward, California)染色，使染色质染色，其在具有DNA断裂和没有DNA断裂的被裂解的精子周围的分散不同。然后具有断裂的DNA的细胞和具有完整的DNA的细胞在每个载玻片上被可视化地识别。关于图1，可以看到在流式细胞仪中分选的精子的前向荧光对于侧向荧光的图(图1A)。该图上一个亚群体包含大比率的死亡或将死的精子(图IA中的R2)，其他组包含活精子(图IA中的Rl)。在商购的流式细胞仪(例如MoFlo SX或者MoFlo SX XDP (BeckmanCoulter, Miami, Florida))上显示的分选参数的区域被标示出来,其示出了基于前向突光和侧向荧光来选通精子细胞的图。图IB示出了来自Rl的精子细胞的原位荧光显微照片，使用了 Sperm-Halomax试剂盒，其中细胞具有小而紧密的晕环表明精子没有经历DNA断裂。在该载玻片上，可以看到单个的精子，其染色质松散地分散于膜的周围，表明该精子已经或正在经历DNA断裂。关于图1C，示出了来自R2的精子，可以看到其中的几个精子具有很宽的分散的染色质的晕环，表明了 DNA断裂。关于图2A和2B，一个亚群体包括主要是死亡的精子(图2A中的R2)，其余两组主要由活精子(图2A中的Rl)亚群体组成，所述活精子亚群体包含携带X-染色体(图2B中的R3)和携带Y-染色体(图2B中的R4)的精子，纯度为约95%。MoFlo SX XDP可构造为将R3、R4和R2中的每一个选入分开的容器中，而MoFlo SX可以用于从R2精子中分离出Rl精子° 使用 STS Sexed Semen Purity Analyzer (Sexing Technologies, Navasota, TX),其提供了携带X和Y染色体的精子群体的高分辨率的峰，并依据2000个精子设立每次分析的基础，从而测定样品的性别比率纯度。相对于各分选前的样品(该样品获取自染色和孵育后而在分选之前)中得到的水平，分析并比较所有这些亚群体的DNA断裂的水平。各样品分选总计2x IO6个精子。基于图2A中的区域2分选死亡的精子，排除落在该区域之外的所有其他细胞。分选前精液样品中死亡细胞的比例平均为13%，由此提供的平均分选速度是800至900个死亡精子/秒。因此，通过该过程从初始样品中除去了约85%的包含断裂的DNA的精子。实施傲I-进行第一个实验以分析性别分选前、后DNA断裂量的差异。精子样品取自5只Jersey公牛，每个样品被分成两份等分试样。第一组等分试样被性别分选然后冻存。第二组等分试样被直接冻存。表I示出了在每只公牛的分选前及分选后获得的DNA断裂的水平。表I (DNA断裂％，性别分选)
权利要求
1.一种用于抑制细胞样品中细菌的生长的方法，所述方法包括以下步骤 a.获得生殖细胞样品或精子样品； b.使所述生殖细胞样品或精子样品与喹诺酮结合；和 c.抑制所述生殖细胞样品或精子样品中的细菌生长。
2.如权利要求I所述的方法，其中，所述喹诺酮包括氟喹诺酮。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述氟喹诺酮包括环丙沙星。
4.如权利要求I所述的方法，所述方法还包括冻存所述精子样品的步骤。
5.如权利要求I所述的方法，所述方法还包括用缓冲溶液增容所述精子样品以形成增容的精子样品的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其中，使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤还包括对选自由所述精子样品、所述增容的精子样品和所述缓冲液组成的组中的一种施用所述喹诺酮。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述缓冲溶液选自由TRIS、柠檬酸钠、卵黄、奶、TALP、HEPES、磷酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐、MOPS、含有BSA的缓冲液及其组合组成的组。
8.如权利要求I所述的方法，其中，使所述生殖细胞样品或精子样品与喹诺酮结合的步骤还包括用喹诺酮孵育所述生殖细胞样品或精子样品。
9.如权利要求I所述的方法，其中，使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤基本上发生在收集精子的时候。
10.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括将冻存的所述精子样品解冻的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中，使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤发生在将冻存的所述精子样品解冻的步骤之后。
12.如权利要求I所述的方法,其中，以约O.05 μ g/πιΓ约20 μ g/ml、约O. 2 μ g/mf约5 μ g/ml和/或约O. I μ g/mf约2 μ g/ml的浓度提供所述喹诺酮。
13.如权利要求I所述的方法，其中，形成抗菌培养基的步骤还包括对IVF培养基和/或IVF过程施用喹诺酮以减少或抑制卵子和/或胚胎的细菌污染的步骤。
14.如权利要求I所述的方法，所述方法还包括以下步骤 a.基于所需的生殖力特征对所述精子样品中的精子进行区分；和 b.基于所述所需的生殖力特征分选精子。
15.如权利要求16所述的方法，其中，基于所需的生殖力特征分选精子的步骤还包括对所述精子样品中的精子进行性别分选以形成携带X染色体的精子的性别富集群体和/或携带Y染色体的精子的性别富集群体。
16.如权利要求I所述的方法，所述方法还包括由所述精子样品建立授精样品的步骤。
17.一种增容的精子样品，所述样品包含 a.精子； b.喹诺酮；和 c.缓冲溶液。
18.如权利要求17所述的增容的精子样品，其中，所述喹诺酮包括氟喹诺酮。
19.如权利要求18所述的增容的精子样品，其中，所述氟喹诺酮包括环丙沙星。
20.如权利要求17所述的增容的精子样品，其中，以约O.05 μ g/πιΓ约20 μ g/ml、约O.2 μ g/ml 约5 μ g/ml和/或约O. I μ g/ml 约2 μ g/ml的浓度提供所述喹诺酮。
21.如权利要求17所述的增容的精子样品，其中，所述缓冲溶液选自由TRIS、柠檬酸钠、卵黄、奶、TALP, MOPS、HEPES、磷酸盐、KMT、硼酸盐、碳酸氢盐、含有BSA的缓冲液及其组合组成的组。
22.如权利要求17所述的增容的精子样品，其中，所述精子包括根据生殖力特征分选的精子。
23.如权利要求22所述的增容的精子样品，其中，所述生殖力特征包括存在X染色体或存在Y染色体。
24.一种对受到污染的细胞样品或细胞培养基进行灭菌的方法，所述方法包括以下步骤 a.获得包含生殖细胞的细胞样品； b.对受到污染的细胞样品或细胞培养基施用一种或多种喹诺酮；和 c.通过消除或最大限度地减少所述细胞样品中的细菌或微生物的水平来恢复细胞系。
25.如权利要求24所述的方法，其中，对所述受到污染的细胞样品或细胞培养基施用一种或多种喹诺酮的步骤还包括用所述一种或多种喹诺酮孵育所述细胞样品或细胞培养基。
26.如权利要求24所述的方法，其中，细胞培养样品或细胞培养物包含选自由精子、卵母细胞、卵子、胚胎、经培养的胚胎组成的组中的一种。
27.一种用于产生胚胎的方法，所述方法包括以下步骤 a.获得精子样品； b.将所述精子样品的一部分添加至含有未受精的卵子的悬浮液中以形成配子悬浮液； c.在所述配子悬浮液中用一个所述精子使所述卵子受精； d.使一种或多种喹诺酮与所述精子样品或所述配子悬浮液或者两者结合；和 e.抑制所述精子样品或所述受精卵中的细菌生长。
28.如权利要求31所述的产生胚胎的方法，所述方法还包括以下步骤 a.使用DNA选择性染料对所述精子样品中的精子进行染色；和 b.基于所述DNA选择性染料的相对吸收对所述精子样品中的精子进行分选。
29.如权利要求32所述的方法，其中，所述DNA选择性染料的相对吸收代表X染色体或Y染色体的存在。
30.一种用于处理精子样品的方法，所述方法包括以下步骤 a.获得精子样品； b.用具有pH的第一培养基中的DNA选择性染料对所述精子样品进行染色； c.对包含第二染料的第二培养基的pH调整使之与所述第一培养基的pH相协调；和 d.用所述第二培养基中的所述第二染料对所述精子样品进行染色。
31.如权利要求30所述的方法，所述方法还包括以下步骤 a.根据与各精子相关联的DNA选择性染料的量将经染色的所述精子样品分选为不同的亚群体；和 b.基于所述分选步骤收集至少一个精子亚群体。
32.如权利要求31所述的方法，其中，将所述第二培养基的pH调整至所述第一培养基的2pH和/或所述第一培养基的IpH之内。
33.如权利要求32所述的方法，其中，将所述第二培养基的pH调整为大致与所述第一培养基的pH相同。
34.如权利要求31所述的方法，其中，所述第二染料是淬灭染料。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述第二培养基包含红色TALP。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述红色TALP包含TALP类的缓冲剂和红色食品染料。
37.如权利要求34所述的方法，其中，所述淬灭染料是选自由红色食品染料、黄色食品染料、perco 11、碘化丙唳和台盼蓝组成的组中的一种。
38.如权利要求30所述的方法，其中，所述对第二培养基的pH调整的步骤还包括调整所述第二培养基的PH至约5. 5 约7. 4、约6. Γ约7. 4和/或约5. 5 约6. 4的步骤。
39.如权利要求40所述的方法，其中，所述红色TALP的pH为大于5.5。
40.如权利要求34所述的方法，其中，对所述第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的PH为大致与所述第一培养基的pH相同的值的步骤。
41.如权利要求34所述的方法，其中，所述精子样品包含牛精子，并且所述第一染料和第二染料的PH均为约7. 4。
42.如权利要求34所述的方法，其中，所述第二培养基的pH大于5.5。
43.如权利要求34所述的方法，其中，基于携带X染色体或Y染色体来分选所述精子。
44.如权利要求34所述的方法，其中，所述第一染色剂包括荧光DNA选择性染料。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述第一染色剂包括Hoechst33342。
46.如权利要求34所述的方法，其中，对第二培养基的pH调整的步骤还包括基于所述第一培养基的PH和所述精子样品的pH调节所述第二培养基的pH的步骤。
47.如权利要求46所述的方法，其中，对第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的PH以实现精子样品的pH为6. 6^7. 2的步骤。
48.如权利要求34所述的方法，所述方法还包括在缓冲液中增容所分选的精子的步骤，所述缓冲液选自由TRIS、柠檬酸钠、卵黄、奶、TALP、MOPS、HEPES、磷酸盐、KMT、硼酸盐、碳酸氢盐、包含BSA的缓冲液及其组合组成的组。
49.如权利要求34所述的方法，其中，所述用所述第一培养基和第二培养基进行染色的步骤与单一的PH调整事件同时进行。
50.如权利要求34所述的方法，其中，所述获得精子的步骤还包括将此前冷冻的精子存储管解冻。
51.如权利要求35所述的方法，所述方法还包括将所分选的精子冻存的步骤。
52.一种处理精子的方法，所述方法包括以下步骤 a.收集包含精子的精液； b.在进行任何其他处理步骤之前，对选自所述精液的pH和所述精液的浓度中的一个进行调节； c对经调节的精子进行染色；和 d.将经染色的缓冲的精子分选为性别富集的亚群体。
53.如权利要求52所述的方法，其中，所述的调节步骤包括在任何其他的处理步骤之前在缓冲溶液中调节所述精液的pH。
54.如权利要求52所述的方法，其中，所述的调节步骤包括调节所述精液中的精子的浓度。
55.如权利要求52所述的方法，其中，所述的调节所述精液中的精子的浓度的步骤还包括将所述精液离心的步骤。
56.如权利要求55所述的方法，其中，对具有低浓度的精子的精液进行离心，然后与TALP缓冲液再结合，由此调节所述样品的pH和/或浓度。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述TALP缓冲液包含包括pH为约7的缓冲液。
58.如权利要求52所述的方法，其中，对于给定的精液，通过调节所述精液的浓度或PH使得处理过程中导致的DNA断裂的量相对于未被调节的精液部分减少。
59.如权利要求52所述的方法，其中，通过将所述精液直接收集到缓冲溶液中来完成所述PH或浓度的调节步骤。
60.一种对精子进行染色的方法，所述方法包括以下步骤 a.获得精子； b.在受控的染色条件下用荧色物染料孵育所述精子； c.向所述精子中添加淬灭染料，其中，所述淬灭染料选自由黄色食品染料、橙色食品染料、绿色食品染料及其组合组成的组。
61.如权利要求60所述的方法，其中，所述淬灭染料包括黄色食品染料。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述黄色食品染料包括6号黄色食品染料。
63.如权利要求61所述的方法，其中，黄色食品染料提供了比传统的红色食品染料淬灭剂更高的分选分辨率。
64.如权利要求60所述的方法，其中，所述受控的染色条件包括 a.在30°C 39°C的温度进行孵育； b.在7.0 7· 4的pH进行孵育；和 c.孵育20分钟 I小时的时间。
65.如权利要求60所述的方法，其中，所述获得精子的步骤还包括将已冷冻的精子解冻。
66.如权利要求60所述的方法，其中，将所染色的精子在微流体装置中进行分选。
67.如权利要求60所述的方法，其中，所述荧色物染料包括Hoechst33342。
68.如权利要求60所述的方法，其中，所述添加所述淬灭染料的步骤在于受控的染色条件下进行孵育的步骤之后发生。
69.如权利要求60所述的方法，其中，所述添加所述淬灭染料的步骤在用所述荧色物染料进行孵育的过程中发生。
70.一种对通过权利要求60的方法染色的精子进行分选的方法，还包括以下步骤 a.使所述经染色的精子流经微流体装置； b.使所染色的精子曝露于辐射能量以激发所述荧色物染料； c.基于所染色的精子响应所述辐射能量而发出的荧光能量来区分携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子。
全文摘要
本发明涉及与常规的分选和处理方法相比以降低的DNA断裂的水平和发生率来处理生殖细胞样品并分选精子的方法和系统，所述方法和系统使用具有低水平的DNA断裂的生殖细胞和精子细胞样品来改善授精样品生殖力的活力和辅助生殖过程的成功率，所述辅助生殖过程包括人工授精、体外受精、胞质内注射、以及其它相关的技术。
文档编号C12N5/076GK102812123SQ201080065616
公开日2012年12月5日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年4月1日
发明者J·莫雷诺, M·埃文斯, M·杰兰德, J·格萨维兹, C·冈萨雷斯·马丁, C·洛佩兹·费尔南德斯 申请人:英格朗公司