专利名称：胸腺上皮前体细胞的制备方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胸腺上皮前体细胞的制备方法及其专用
培养基。
背景技术：
胸腺是诱导T细胞分化成熟的免疫器官，对于人体免疫系统正常机能的维持具有重要作用。许多与免疫系统相关的疾病都与胸腺能否诱导正常T细胞的形成密切相关。例如，DiGeorge综合症即是由于先天性胸腺发育不全导致的免疫缺陷病。通过异体胸腺移植能够有效地治疗这一疾病，在美国已有临床应用。另一方面，胸腺还有诱导免疫耐受的重要功能，这对于异体器官移植以及基于细胞替换的治疗具有极其重要的意义。目前异体器官移植大多需要在术后长期服用免疫抑制剂，由此也带来一系列问题包括(一)长期抑制机体免疫功能会极大地增加致死性感染和肿瘤产生的风险；(二)大多数免疫抑制剂本身具有强烈的毒副作用；(三)多数免疫抑制剂价格十分昂贵，长期使用对病人而言成本过高。通过胸腺移植来诱导受体对异体或异种移植物产生免疫耐受，能够有效摆脱长期使用免疫抑制剂带来的一系列问题，具有极高的临床应用价值。此外，人类青春期后随着年龄的增长胸腺开始衰老，逐渐被脂肪组织所取代，未来年长且免疫能力低下的人也能受益于胸腺移植。总之胸腺移植具有广阔的临床应用前景。但是，胸腺本身作为一种器官，其来源受到极大的限制，如何获得大量的胸腺组织用于临床治疗，是目前开展胸腺相关的临床治疗的主要问题。人胚胎干细胞由于具有可向人体三个胚层所有细胞类型的分化潜能以及在体外长期大量扩增的特点，为解决胸腺器官的来源问题提供了一种可能的解决方案。因此，通过人胚胎干细胞诱导分化获得胸腺上皮细胞，具有十分重要的临床应用价值。但是，目前仍然没有人胚胎干细胞向胸腺诱导分化的报道。在胸腺移植临床方案已相对成熟的情况下，有效的诱导人胚胎干细胞向胸腺分化的分化体系的建立是将胸腺移植应用于众多临床应用的主要瓶颈。通过模拟体内特定细胞或器官的发育途径来实现全能干细胞的诱导分化，已经在不同类型的细胞分化中都得以证明是一种极为成功的策略。胸腺的体内发育过程已经在小鼠胚胎发育的研究中积累了一些线索。在小鼠胚胎发育Ell. 5天左右时，胸腺原基自内胚层的第三咽囊部位产生。在大约E12天左右，胸腺原基特化成一群上皮前体细胞，这群前体细胞未来会进一步分化形成构成胸腺的两种细胞类型(皮质上皮细胞和髓质上皮细胞)，研究发现，仅单个胸腺上皮前体细胞就具有能够重建整个胸腺的能力。在E13. 5天左右，胸腺的结构已经基本形成。在这一系列发育过程中的关键基因和信号通路也已有一定程度的研究。例如，Foxnl是胸腺发育的关键基因。在小鼠中敲除了 Foxnl基因会导致胸腺的完 全缺失。但是，更为细节的胸腺发育过程，特别是人胸腺的发育过程的相关研究仍然匮乏。因此，建立人胚胎干细胞向胸腺细胞分化的诱导体系，对于体外研究人胸腺发育过程也具有极为重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种胸腺上皮前体细胞。本发明提供的胸腺上皮前体细胞，是由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化获得的表达、上皮细胞粘附分子、细胞角蛋白5和细胞角蛋白8的胸腺上皮前体细胞，其具有增殖能力且向胸腺髓质上皮细胞和胸腺皮质上皮细胞分化和/或促进T细胞成熟的潜倉泛。
所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系。所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系BG01，BG02,BG03, BG04, SAOI, SA02, SA03, ES01, ES02, ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04,TE06, TE62, TE07, TE72, UCOI, UC06, WAOl，WA07, WA09, WA13 和 WA14 ;所述编号为 NIH 的编号。本发明的另一个目的是提供一种由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化制备所述胸腺上皮前体细胞的培养基，由细胞培养液I、细胞培养液II和细胞培养液III组成，所述细胞培养液I按照如下方法制备将谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、活化素A和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇和活化素A的配比为Iml (O. 005-0. 05)ml (O. 005-0. 05)ml (O. 0005-0. 005)ml (80-120)ng ；所述细胞培养液II按照如下方法制备将谷丙氨酸二肽、NEAA、2_巯基乙醇、视黄酸、IWP2和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、视黄酸和IWP2的配比为Iml (O. 005-0. 05)ml (O. 005-0. 05)ml (O. 0005-0. 005)ml (O. 8-1. 2) nmol (2. 3-2. 8) nmol ；IWP2 为一种 Wnt Inhibitor。所述细胞培养液III按照如下方法配制得到将谷丙氨酸二肽、NEAA、2_巯基乙醇、骨形成蛋白4、wnt3a和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、骨形成蛋白4和wnt3a的配比为 Iml (O. 005-0. 05) ml (O. 005-0. 05) ml (O. 0005-0. 005) ml (80-120)ng : (80-120)ng。所述细胞培养液I中，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇和活化素 A 的配比为 Iml O. Olml O. Olml O. OOlml IOOng ；所述细胞培养液II中，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEM、2-巯基乙醇、视黄酸和 IWP2 的配比为 Iml O. Olml O. Olml O. OOlml Inmol 2. 5nmol ；所述细胞培养液III中，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEM、2-巯基乙醇、骨形成蛋白4和wnt3a的配比为Iml O. Olml O. Olml O. OOlml 100ng : IOOng0所述培养哺乳动物细胞的基础培养基为X-VIVO 10培养基。本发明的第三个目的是提供一种用所述培养基制备所述胸腺上皮前体细胞的方法，包括如下步骤I)将人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在所述培养基中的细胞培养液I上培养;2)步骤I)获得的细胞在所述培养基中的细胞培养液II上培养；3)步骤2)获得的细胞在所述培养基中的细胞培养液III上培养，得到胸腺上皮前体细胞。步骤I)中，所述培养时间为2. 5-3. 5天，所述培养时间具体为3天；步骤2)中，所述培养时间为2. 5-4天，所述培养时间具体为4天；
步骤3)中，所述培养时间为4. 5-5. 5天，所述培养时间具体为5天。所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系。所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系BG01，BG02,BG03, BG04, SAOI, SA02, SA03, ES01, ES02, ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04,TE06, TE62, TE07, TE72, UCOl，UC06, WAOl，WA07, WA09, WA13 和 WA14 ;所述编号为 NIH 的编号;所述的细胞、所述的方法或所述的培养基在制备胸腺髓质上皮细胞和胸腺皮质上皮细胞和/或促进T细胞成熟中的应用也是本发明保护的范围。所述T细胞为⑶4+T细胞。其中，所述人胚胎干细胞来源见表I。表I.可从商业途径获得的人胚胎干细胞系
提供者_提交编号NIH编号
BresaGen, Inc. hESBGN-01,BGOI,
hESBGN-02, BG02,_hESBGN-03,_BG03,
权利要求
1.胸腺上皮前体细胞，是由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化获得的表达上皮细胞粘附分子、细胞角蛋白5和细胞角蛋白8的胸腺上皮前体细胞，其具有增殖能力且向胸腺髓质上皮细胞和胸腺皮质上皮细胞分化和/或促进T细胞成熟的潜能。
2.根据权利要求I所述的胸腺上皮前体细胞，其特征在于 所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系。
3.根据权利要求I或2所述的胸腺上皮前体细胞，其特征在于所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系BG01，BG02，BG03，BG04，SAOl，SA02，SA03，ESOl，ES02, ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04, TE06, TE62, TE07, TE72, UCOI, UC06,WAOl，WA07, WA09, WA13 和 WA14 ;所述编号为 NIH 的编号。
4.由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化制备权利要求I至3中任一所述胸腺上皮前体细胞的培养基，由细胞培养液I、细胞培养液II和细胞培养液III组成， 所述细胞培养液I按照如下方法制备将谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、活化素A和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇和活化素A的配比为Iml (O. 005-0. 05)ml (O. 005-0. 05)ml (O. 0005-0. 005)ml (80-120)ng ； 所述细胞培养液II按照如下方法制备将谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、视黄酸、IWP2和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、视黄酸和IWP2的配比为Iml (O. 005-0. 05)ml (O. 005-0. 05)ml (O. 0005-0. 005)ml (O. 8-1. 2) nmol (2. 3-2. 8) nmol ； 所述细胞培养液III按照如下方法配制得到将谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、骨形成蛋白4、wnt3a和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、骨形成蛋白4和wnt3a的配比为 Iml (O. 005-0. 05) ml (O. 005-0. 05) ml (O. 0005-0. 005) ml (80-120)ng : (80-120)ng。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于 所述细胞培养液I中，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇和活化素A的配比为Iml O. Olml O. Olml O. OOlml IOOng ； 所述细胞培养液II中，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、视黄酸和 IWP2 的配比为 Iml O. Olml O. Olml O. OOlml Inmol 2. 5nmoI; 所述细胞培养液III中，所述培养哺乳动物细胞的基础培养基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巯基乙醇、骨形成蛋白4和wnt3a的配比为Iml O. Olml O. Olml O. OOlml IOOng IOOng0
6.根据权利要求4或5所述的培养基,其特征在于 所述培养哺乳动物细胞的基础培养基为X-VIVO 10培养基。
7.一种用权利要求4-6中任一所述培养基制备所述胸腺上皮前体细胞的方法，包括如下步骤 I)将人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在权利要求4-6中任一所述培养基中的细胞培养液I上培养；2)步骤I)获得的细胞在权利要求4-6中任一所述培养基中的细胞培养液II上培养； 3)步骤2)获得的细胞在权利要求4-6中任一所述培养基中的细胞培养液III上培养，得到胸腺上皮前体细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于 步骤I)中，所述培养时间为2. 5-3. 5天，所述培养时间具体为3天； 步骤2)中，所述培养时间为2. 5-4天，所述培养时间具体为4天； 步骤3)中，所述培养时间为4. 5-5. 5天，所述培养时间具体为5天。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于 所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系BG01, BG02, BG03, BG04, SAOl，SA02, SA03, ESOl，ES02，ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04, TE06, TE62, TE07, TE72, UCOl，UC06, WAOl，WA07, WA09, WA13和WA14 ;所述编号为NIH的编号； 权利要求1_3中任一所述的细胞、权利要求6-9中任一所述的方法或权利要求4或5所述的培养基在制备胸腺髓质上皮细胞和胸腺皮质上皮细胞和/或促进T细胞成熟中的应用。
全文摘要
本发明公布了一种胸腺上皮前体细胞的制备方法及其专用培养基。本发明提供的胸腺上皮前体细胞，是由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化获得的表达、Epcam、Cytokeratin 5和Cytokeratin 8的胸腺上皮前体细胞，其具有增殖能力且向胸腺髓质上皮细胞和胸腺皮质上皮细胞分化和/或促进T细胞成熟的潜能。本发明的实验证明，在本发明中，通过体外诱导模拟体内胸腺发育过程的方法，首次建立了人胚胎干细胞向胸腺上皮前体细胞分化的分阶段诱导体系。
文档编号C12N5/078GK102732479SQ20111012124
公开日2012年10月17日 申请日期2011年5月11日 优先权日2011年3月31日
发明者吕红霞, 孙晓宁, 尹明, 徐君, 时艳, 苗振川, 邓宏魁 申请人:北京大学, 北京瑞普晨创科技有限公司