专利名称：一种灰树花多糖锰复合物的生产方法
技术领域：
本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及使用一株适合在米糠和麸皮复合物为碳源和氮源的培养基上生长的灰树花诱变菌株，发酵并高产灰树花多糖锰复合物的生产方法。
背景技术：
国内外科学研究和国内市场表明食用菌多糖能增强人体免疫力，辅助治疗肿瘤等疾病，已成为肿瘤生物疗法选用的辅助用品。国内由食用菌子实体制成的药字号产品有安徽芜湖的灵芝胶囊、浙江庆元的灰树花胶囊等，由食用菌提取物制成的非药字号保健品也有销售。国际上新西兰产有“GanoPoly”(甘诺宝力)多糖提取物系列产品，销往美国、澳大利亚、中国(包括香港和台湾)等地方。该产品的发明人高益槐是国际知名食用菌产品开发专家，曾经获得爱因斯坦发明奖。高益槐发明的“GanoPoly”系列产品主要由灵芝、云芝、猴头等提取的多糖与壳聚糖一道复合构成，用于提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗 等。新西兰安发保健品有限公司现在中国福建泉州建有食用菌多糖的生产基地。在各种食用菌多糖的研究中，现在已有研究说明，药食两用食用菌灰树花的多糖也具有较好的提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等的功效，值得引起足够的重视，例如Ohno Naohito、SuzukiIwao等从灰树花菌体中提取灰树花多糖的药效试验表明，灰树花多糖具有抗肿瘤作用和免疫调节作用(参考文献见① Ohno N, Lino K, Suzuki I et al. Neutral and acidicantitumor polysaccharides extracted from cultured fruit bodies of GrifolaFrondosa[J]. Chem. Pharm. Bull, 1985，33(3):1181-1186 ;② Naohito Ohno, YoshiyukiAdachi, Iwao Suzuki,et al. Characterization of the antiumor glucan obtainedfrom liquid-cultured Grifola frondosa [J].Chem. pharm. Bull. 1986, 34(4):1709 ；③Iwao Suzuki,Koichi Hashimoto, Shozo Oikawa, et al. Antiumor and immunmodulatingactivity of a β -glucan obtained from liquid-cultureed Grifola frondosa [J].chem. Pharm Bull, 1986, 37 (2):410.)。灰树花(Cri/b7a frondosa)为担子菌亚门，层菌纲，非裙菌目，多孔菌科,树花属，又名奇果菌、贝叶多孔菌、千佛菌、莲花菌等，是一种珍稀的食药两用真菌，其子实体肉质，柄短且呈珊瑚状，外观形似菊，气味清香四溢，肉质脆嫩可口。野生灰树花分布于日本、欧洲等，在我国黑龙江、吉林、广西、河北、四川、云南、福建等省区也有分布。河北省迁西人工栽培的灰树花，其营养和口味超过了 “菇中之王”的香菇，能烹调成多种美味佳肴。1834年，日本本坂浩然的《菌谱》中记载了灰树花具有“味甘、平、无毒、可治痔疮”的药用价值，而我国中医认为其具有“扶正固本”之功效。近年来国内外的研究表明，灰树花多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗HIV病毒和保肝护肝等作用。灰树花提取物作为一种高级保健食品，已见于日本、新加坡等市场。传统的灰树花固态培养生产周期长，劳动强度大，易受到病虫害的侵害，且原材料利用率低。研究发现液体深层发酵得到的灰树花菌丝体营养价值及药用效果与固态栽培得到的子实体相当，因此，人们对灰树花液态发酵越来越重视并取得了一定的研究成果。1986年Ohno N等首次报道了灰树花液体培养情况，随后Suzukil等也用类似的方法成功培养出灰树花菌丝体。1992年Zhuang C等研制出一套液体培养装置，可同时收获菌丝体及发酵液多糖。陈石良的研究表明，灰树花发酵菌丝体中的粗多糖含量大大高于子实体多糖，同时发酵液的胞外多糖也是活性多糖。这些研究涉及到优良菌种选育和培养基及培养工艺的探索等，主要目的是降低生产成本并在此基础上提高菌丝活性多糖产量。多数工艺采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯等作为培养基的主要碳源和氮源，即使用到农产品加工的副产品如米糠或麸皮，也是作为次要成分加入，一般还需要大量使用葡萄糖或其他粮食类原料。现有的灰树花菌种难以在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠或麸皮的培养基上生长。本专利设计人刘伟民等曾对原有的灰树花菌种在米糠培养基上液体发酵产灰树花多糖的可能性进行过研究，发现尽管对菌株也进行过初步紫外诱变的处理，如不添加较大量的葡萄糖，灰树花在米糠培养基上发酵不理想，所以在刘伟民指导的杨锁华和顾慧敏的硕士论文的研究，仍添加了较多的葡萄糖，故而只以农产品加工副产品为原料生产灰树花多糖以降低成本的设想并没有能得到真正的实现(参考文献见杨锁华.灰树花发酵米糠制备多糖[D].硕士学位论文.镇江江苏大学.2006 ;顾慧敏·灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究[D].硕士学位论文.镇江江苏大学.2009.)。后刘伟民又指导硕士研究生张建对原有灰树花菌种进行过初步微 波-紫外复合诱变的处理，其诱变菌株在米糠、麸皮培养基上(不添加葡萄糖)液体发酵产灰树花多糖效果较好，菌丝干重和多糖较原有菌株分别提高39. 24%和42. 58%，并提交了中国发明专利申请，申请专利的名称是用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株，申请号为201010579078. 5。尽管该菌株生产的多糖较实验室原有的菌株生产的多糖有较大的提高，但诱变菌种会退化，从稳定诱变菌种、提高生产效率的角度而言，不断诱变菌种，获得更高的多糖产量仍是需要不断研究的问题和更高的发明创造的目标。另外，申请号为201010579078. 5的灰树花菌株比较适合的发酵工艺是需要对米糠和麸皮先进行植物纤维酶的酶解，提供发酵所需的碳源，但引入酶解工艺会增加生产成本。如果诱变出高效灰树花菌株，在没有先期酶解的情况下，也能高效转化米糠和麸皮，则将达到创新的效果。申请人与本发明同时提交了另一个发明专利申请，题目是用于高效发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株，瞄准上述目标，进行灰树花菌种的新诱变，以求获得新的生产灰树花多糖的高效菌株。但《用于高效发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株》的发明专利并没有涉及用所得菌株生产灰树花多糖锰复合物的方法。这一方法由本发明专利描述。锰在自然界的分布相当广，植物性食品含锰量较多。人体含锰较少，成人体内约含锰10
20 mg，分布于一切组织内，以肝、骨骼、脑、肾、胰、垂体内含量较多。由肠道吸收，因其溶解度小，故吸收率低；由肠道及肾排出。锰是多种酶的核心组成部分或激活剂，对硫酸酶、激酶、硫酯酶、肽酶、脱氢酶、脱羧酶、核苷酸环化酶和葡萄糖基转移酶等都有激活剂或辅助因子作用。锰对人的生长、代谢、血液形成、内分泌腺、心脏、肾和神经系统都有重要影响。它的具体功用可能有①促进细胞内脂肪氧化，减少肝脂贮存；②使中枢神经及垂体保持良好功能；③促进固醇类性激素的生成促进骨髓的造血机能；⑤作为丙酮酸羧化酶的组分促进糖异生，作为超氧化物歧化酶的组分防止自由基对心肌的损害，在防癌、防心肌损坏起一定作用；⑥刺激抗毒素的生成，提高对传染病的抵抗力。流行病学调查表明，芬兰和苏联阿拉木图地区土壤中锰含量与恶性肿瘤发病率呈负相关。我国广东顺德，江苏崇明等肝癌高发区土壤中锰含量均较低，而且这些地区农作物和人发中锰水平也低于或显著低于低发区。广西四会县鼻咽癌高发区，当地土壤、大米中锰含量也显著低于低发区。此外，四川盐亭、山西太行山、河南林县、河北等地食管癌高发区，饮水和食物中除钥低外，锰亦低。我国多数研究结果证实，癌症患者体液锰含量低于或显著低于正常人，国外也有类似报道。另一方面，系川秀治曾报道，姜科植物对Sar-coma A具有抗肿瘤活性，而姜科植物锰含量都较高，两者间似有内在联系，是某些中草药能抑制癌瘤生长的可能因素。河南省肿瘤研究所王顺祥等发表研究文章报道测定41种中草药微量元素的含量，其中25种中草药均为中医治癌常用处方药，经现代动物药理实验，也证实对癌细胞有不同程度的抑制作用，且部分药物的抗癌有效成分已分离提纯。研究结果表明在测定的41种中药中，Mn、Zn、Si、Cu含量明显为高，初步证实与这些药物的抗癌作用似有一定的关系。
人体缺锰还可能引发其他一系列疾病，在儿童会引起生长停滞、骨骼畸形和软骨病，成人缺锰，则出现食欲不振、体重下降、性功能障碍，孕妇缺锰可导致不孕或胎儿死亡。锰摄取量过多将会影响机体的氧化还原过程，从而导致一系列的锰中毒症状，主要表现为神经精神系统的慢性毒性作用，以类帕金森综合症的椎体外系神经损害为特征。锰中毒的主要机理涉及神经细胞凋亡、神经递质代谢紊乱、突触传导功能障碍，亦与基因易感性和遗传多态性有关，具有如头痛、头晕、疲乏无力、语言障碍、动作笨拙、肌肉痉挛、心悸、心动过速、多汗、流涎等症状。借鉴食用菌将无机硒转化为有机硒降低毒性和提高硒的使用效率的想法，以及借鉴姜科植物锰含量较高的事实，也可用食用菌将无机锰转化为有机锰以提高有机锰的功效。《食品营养学》教材推荐成人锰摄入量为3.5mg/d，最高摄入量为10mg/d。在多糖中再富集锰需要对锰的添加量作限制。考虑每个成年人每天摄入的多糖量为O. 5g lg，其中所含的猛为3. 5mg IOmg为宜。灰树花在米糠麸皮培养基上发酵产多糖并富集有机锰是本项目除了提高多糖产量外的又一个创新点。我国是以稻谷和小麦为主的产粮大国，其加工副产品米糠、麸皮来源丰富，且价格低廉。米糠中富含淀粉、纤维素等物质，而麸皮富含蛋白、纤维素等物质。从理论上讲，米糠和麸皮复合已经具备了灰树花生长所需要的碳源和氮源的原始物质。在灰树花自身纤维素酶及其他酶的作用下，灰树花可将米糠和麸皮转化成自身的营养物质进行生长，生产灰树花多糖。因此，运用米糠、麸皮等廉价农副产品，作为完全的碳源和氮源，而不添加其他碳源和氮源，提供灰树花液体发酵所需的碳源和氮源营养物质，生产具有辅助肿瘤治疗的灰树花锰多糖，将具有经济价值。本发明将得到实现这一目标的一种有效方法。特别说明本发明所述的米糠麸皮培养基特指只以米糠和麸皮复合物为碳源和氮源物质的培养基，培养基中不再添加其他碳源和氮源物质。将有机锰和食用菌多糖复合，可以协同发挥两类物质的作用，为组合创新方法，得到的灰树花多糖锰复合物是新产物。为了降低原料成本，高效利用农产品加工副产品米糠和麸皮，得到高价值的保健食品，有必要研究只以米糠麸皮提取物为碳源和氮源的新技术。由于灰树花菌株在米糠麸皮提取物为主要碳源氮源而不加其他碳源氮源的培养基中生长受到限制，所以有必要通过诱变的手段得到高效生长菌株，并使用新的菌株发酵添加锰的米糠麸皮培养基，生产灰树花多糖锰复合物作为新型保健食品，从而形成新的发明创造。要实现上述设想的关键问题之一为必须得到适宜在米糠和麸皮复合培养基上生长的灰树花菌株，所以必须对已有菌株不断进行诱变筛选，因为现有的灰树花菌株在米糠麸皮培养基上生长仍希望得到大幅度提高，如能筛选出适宜的灰树花菌株，则研究和生产将有可能取得突破。与本发明同时提交的另一个发明专利通过原生质体激光诱变的方法，以高产多糖为指标，定向高效转化米糠麸皮提取液为基础，选育得到高产、低成本的灰树花菌株。本发明的关键问题则是利用与本发明同时提交的另一个发明专利所得到的新的诱变菌株，在添加锰的未用植物纤维素酶解的米糠麸皮复合培养基上，发酵生产灰树花多糖锰复合物，由此得到新的灰树花多糖锰复合物及其新的生产方法。因变异菌株是新菌株，在所产多糖物质上有所变化，所得的灰树花多糖锰是一种新的灰树花多糖锰复合物。新的生产方法必须由新的工艺支撑，使用本发明采用的诱变菌株，在未经植物纤维酶解的米糠麸皮加锰复合培养基上进行发酵，高产灰树花多糖锰复合物的工艺是全新的工艺，这种研究未见公开报道。所以，本发明在采用新诱变菌株、以未经植物纤维素酶解的米糠麸皮加锰复 合物作为培养基、新的灰树花多糖锰复合物、新的灰树花多糖锰复合物生产工艺四个方面具有创新性，奠定了本发明专利的基础。
发明内容
本发明将创新一种新的灰树花多糖锰复合物及其的生产技术。为了降低生产成本，考虑采用大宗农产品稻谷和小麦等加工的副产品米糠和麸皮作为培养基的碳源和氮源，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，加入硫酸锰，进行液体发酵，以节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，提高产品附加值，但这需要诱变筛选出在米糠麸皮复合培养基上适宜生长的灰树花菌株和选择适宜的生产工艺方法。因此，为实现上述目的，需要在自然选育之外，通过生物技术手段对灰树花菌株进行诱变，筛选出适宜在米糠麸皮培养基上高产多糖的灰树花菌株，研究该诱变菌株生产灰树花多糖锰复合物的适宜发酵工艺方法，以得到灰树花多糖锰复合物，作为保健食品。本发明所采取的技术方案如下利用新诱变得到的灰树花菌株，发酵培养基只以米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源，但需添加硫酸锰，生产灰树花多糖锰复合物，按照下述步骤进行(I)米糠、麸皮常压下90-98°C水浸提2. 5-3h后，去渣取汁；(2)将得到处理液作为培养基用于发酵，按照米糠使用量为30-120 g/L培养基，麸皮的使用量为30-120g/L培养基，锰(用添加的硫酸锰折算)的添加量为100-300mg/L培养基，添加磷酸二氢钾
I.0-1. 5g/L培养基，硫酸镁O. 5-0. 80 g/L培养基，pH自然，所用菌株为新诱变得到的菌株；
(3)将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水洗涤，干燥至恒重得菌丝体；(4)将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白、乙醇沉淀及冷冻干燥后即可得胞内多糖锰复合物。本发明中步骤(2)中使用的灰树花诱变新菌株Cri/b7a sp. JSU 10_2已经于2011年4月7日保藏在位于中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC )，保藏菌株编号为 CCTCC 12011113，名称为&^/07<3 sp. JSU 10-2。本发明中步骤(2)中锰的添加物采用硫酸锰，添加量由所要求的锰量换算。
本发明中步骤(2)中采用摇瓶发酵时的装样量为摇瓶容积的40%，接种量为装样体积的10%，培养温度26°C -28°C，培养时间摇瓶为7-9d，转速150_180r/min。本发明中步骤(2)中采用上罐发酵时，装样量为发酵罐容积的80%，上罐时通风量为装罐发酵液体积/min，培养温度26°C -28°C，搅拌速率150_180r/min，上罐发酵4_6天。本发明的有益效果
本发明采用发明人同时申请的另一个发明专利中公布的灰树花诱变菌株Grifola sp.JSU 10-2，在不加其他碳源和氮源的未经植物纤维酶酶解的米糠麸皮复合培养基上培养生产灰树花多糖锰复合物，与原始菌株相比灰树花粗多糖产量更高，菌丝干重和菌丝多糖分别提高了 31. 7%和32. 6%。本发明融合四种创新(I)不加其他碳源和氮源的未经植物纤维素酶酶解的米糠麸皮复合培养基技术；(2)采用新获得的在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变菌株Cri/b7a sp. JSU 10_2作为发酵菌株；(3)诱变菌株Cri/bh sp. JSU 10-2在未经植物纤维素酶酶解米糠麸皮复合培养 基上生长，并生产灰树花多糖锰的工艺方法；(4)新的灰树花粗多糖锰复合物。这四种创新组合使得本发明具有明显的有益效果，可以降低生产成本，节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，生产出高价值的具有辅助抗肿瘤治疗效果的新的灰树花多糖锰复合物保健食品。本发明使用了经原生质体激光诱变法诱变并筛选出的灰树花新菌株，即具有高生长速率和高多糖产量的突变菌株Cri/b7a sp. JSU 10_2，所得菌株适合在未经植物纤维酶酶解的米糠和麸皮复合培养基上快速生长并高产灰树花多糖锰复合物。灰树花多糖具有辅助抗肿瘤治疗的价值，使得灰树花已经成为一种重要的药用真菌，但灰树花多糖大规模生产依然要面对成本高、产量低等一系列问题。基于此，本发明解决的技术问题是提供在不加其他碳源和氮源的未经植物纤维酶酶解的米糠麸皮复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的灰树花诱变菌株sp. JSU 10_2发酵生产灰树花多糖锰复合物的生产方法。所述方法，采用灰树花诱变菌株Cri/bh sp. JSU 10_2，在未经植物纤维酶酶解的米糠麸皮加锰复合培养基上，发酵生产灰树花多糖锰复合物，该方法具有高效低成本使用了廉价原料、灰树花多糖锰复合物适合作为保健食品使用的有益效果。
具体实施例方式本发明提供一种灰树花菌株Cri/b7a sp. JSU 10_2 (已经同时另行申请专利),可以在不加其他碳源和氮源的未经植物纤维素酶酶解的米糠麸皮复合培养基上相对于原有的灰树花菌株具有高生长速率和高多糖产量；该灰树花菌株Cri/b7a sp. JSU 10_2已经于2011年4月7日保藏在位于中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株编号为CCTCC 12011113，名称为&^/07<3 sp. JSU 10-2。本发明提供了采用诱变得到的菌株Cri/bh sp. JSU 10_2生产灰树花多糖锰复合物作为保健食品的生产方法。在具体实施方式
中，对米糠和麸皮进行95°C左右浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵。实施例一
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行90°C浸提2. 5h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为30g/L培养基，麸皮的使用量为30g/L培养基，锰的添加量为100mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. Og/L，硫酸镁O. 5g/L，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度26°C，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定菌丝胞内多糖含量。得到菌丝干重为
3.52g/L培养液，菌丝胞内多糖为O. 341 g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为2. 34mg/g干菌丝和16. 13mg/g粗菌丝多糖，其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过O. 5g，即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过9mg。
实施例二
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行98 °C浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为120g/L培养基，麸皮的使用量为120g/L培养基，锰的添加量为300mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 5g/L，硫酸镁O. 8g/L，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28°C，转速180r/min，培养时间9d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为13. 72g/L，菌丝胞内多糖为I. 43 g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机猛分别为O. 79mg/g干菌丝和5. 24mg/g粗菌丝多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过lg，即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过6mg。实施例三
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行97 °C浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为120g/L培养基，麸皮的使用量为50g/L培养基，锰的添加量为150mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 4g/L，硫酸镁O. 75 g/L，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度27°C，转速160r/min，培养时间Sd0将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为9. 38g/L，菌丝胞内胞内多糖为O. 88g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为O. 97mg/g干菌丝和7. 16 mg/g粗菌丝多糖，其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过lg，即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过8mg。实施例四
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行93 °C浸提2. 9h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为50g/L培养基，麸皮的使用量为120g/L培养基，锰的添加量为250mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 2g/L培养基，硫酸镁
O.7g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度26°C，转速170r/min，培养时间9d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多 糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为7. 82g/L培养液，菌丝胞内胞内多糖为O. 91 g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为I. 17mg/g干菌丝和7. 42mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过lg，即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过8mg。实施例五
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行95 °C浸提2. 6h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为80g/L培养基，麸皮的使用量为90g/L培养基，锰的添加量为270mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 2g/L培养基，硫酸镁
O.5 g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度26°C，转速180r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为10.87g/L培养液，胞内多糖为I. 13g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为I. 00mg/g干菌丝和6. 45mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过lg，即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过7mg。实施例六
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行94°C浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为70g/L培养基，麸皮的使用量为80g/L培养基，锰的添加量为220mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 2g/L培养基，硫酸镁
O.6g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28°C，转速150r/min，培养时间8d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为8.71g/L培养液，胞内多糖为O. 87g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为I. 17mg/g干菌丝和7. 59mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过Ig,即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过8mg。实施例七
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行95 °C浸提2. 9h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为40g/L培养基，麸皮的使用量为40g/L培养基，锰的添加量为120mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 4g/L培养基，硫酸镁
O.6g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度26°C，转速170r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为8. 53g/L培养液，胞内多糖为O. 25g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为O. 63mg/g干菌丝和14. 4mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过
O.5g，即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过8mg。实施例八
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行94°C浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为110g/L培养基，麸皮的使用量为60g/L培养基，锰的添加量为180mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 4g/L培养基，硫酸镁
O.8g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度26°C，转速170r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为8. 59g/L培养液，胞内多糖为O. 86g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为I. 04mg/g干菌丝和6. 70mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过Ig,即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过7mg。
实施例九
灰树花菌株采用诱变得到的fri/b7a sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行95°C浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为100g/L培养基，麸皮的使用量为110g/L培养基，锰的添加量为100mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L培养基，硫酸镁O. 6g/L培养基，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度27°C，转速160r/min，培养时间8d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为10.01g/L培养液，胞内多糖为I. 18g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为O. 77mg/g干菌丝和4. 66mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过lg，即可控制成人每人每天由此多糖锰复合物摄入的锰量不超过5mg。 实施例十
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行98 °C浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为120g/L培养基，麸皮的使用量为120g/L培养基，锰的添加量为300mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 5g/L培养基，硫酸镁0. 8g/L培养基，pH自然，装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为28°C，通风量为装罐发酵液体积/min，搅拌速度180r/min，罐表压0. 05MPa,接种量10%，培养时间6d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸懼水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h, 3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为15. 53g/L培养液，胞内多糖为I. 50g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取0. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为0. 69mg/g干菌丝和4. 92mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过lg，即可控制成人每人每天由此多糖猛复合物摄入的猛量不超过5mg。实施例i^一
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行90°C浸提2. 5h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为30g/L培养基，麸皮的使用量为30g/L培养基，锰的添加量为100mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 0g/L培养基，硫酸镁
0.5g/L培养基，pH自然，装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为26°C，通风量为装罐发酵液体积/min，搅拌速度150r/min，罐表压0. 05MPa,接种量10%，培养时间4d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸懼水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h, 3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为3.64g/L培养液，胞内多糖为O. 37g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为2. 34mg/g干菌丝和14. 86mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过O. 5g，即可控制成人每人每天由此多糖猛复合物摄入的猛量不超过8mg。实施例十二
灰树花菌株采用诱变得到的sp. JSU 10_2菌株。对米糠和麸皮进行95 °C浸提3h处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为70g/L培养基，麸皮的使用量为80g/L培养基，锰的添加量为200mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 3g/L培养基，硫酸镁
O.7g/L培养基，pH自然，装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为27°C，通风量为装罐发酵 液体积/min，搅拌速度170r/min，罐表压O. 05MPa,接种量10%，培养时间5d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60°C条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸懼水，经研磨后，在80°C水浴中浸提3h, 3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4°C的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得到菌丝干重为8. 77g/L培养液，胞内多糖为O. 94g/L培养液。将提取多糖并烘干后的菌丝及菌丝胞内多糖粉末各称取O. 500g分别微波消解，采用高碘酸钠分光光度法测定含锰量，得到原始菌丝含有机锰及菌丝多糖提取物中含有机锰分别为I. 09mg/g干菌丝和6. 38mg/g粗多糖。其中所述的微波消解程序设置如附表I所示。此种菌丝多糖成人每人每天的使用量不超过lg，即可控制成人每人每天由此多糖猛复合物摄入的猛量不超过7mg。
表I微波消解程序设置表
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权利要求
1.一种灰树花多糖锰复合物的生产方法，其特征在于按照下述步骤进行(1)米糠、麸皮常压下90-98°C水浸提2. 5-3h后，去渣取汁；(2)将得到处理液作为培养基用于发酵，按照米糠使用量为30-120 g/L培养基，麸皮的使用量为30-120 g/L培养基，锰的添加量为100-300mg/L培养基，添加磷酸二氢钾I. 0-1. 5g/L培养基，硫酸镁O. 50-0. 80 g/L培养基，PH自然，所用菌株为新诱变得到的灰树花菌株；(3)将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水洗涤，干燥至恒重得菌丝体；(4)将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白、乙醇沉淀及冷冻干燥后即可得胞内多糖锰复合物。
2.根据权利要求I所述的一种灰树花多糖锰复合物的生产方法，其特征在于其中所使用的新诱变得到的灰树花菌株Cri/bh sp，保藏菌株编号为CCTCC M2011113。
3.根据权利要求I所述的一种灰树花多糖锰复合物的生产方法，其特征在于步骤(2)中所述的锰添加物为硫酸锰，添加量由所要求的锰量进行换算。
4.根据权利要求I所述的一种灰树花多糖锰复合物的生产方法，其特征在于步骤(2)中摇瓶时的装样量为摇瓶容积的40%，接种量为装样体积的10%，摇瓶培养时间为7-9d，培养温度 26°C -28°C，转速 150-180r/min。
5.根据权利要求I所述的一种灰树花多糖锰复合物的生产方法，其特征在于步骤(2)中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的80%，上罐时通风量为装罐液体体积/min，培养温度260C -280C，搅拌速度150-180r/min，上罐发酵4_6天。
全文摘要
一种灰树花多糖锰复合物的生产方法，涉及食品微生物应用技术领域。按照下述步骤进行米糠、麸皮常压下90-98℃水浸提2.5-3h后，去渣取汁；将所取汁用于发酵，按照米糠使用量为30-120g/L培养基，麸皮的使用量为30-120g/L培养基，锰的添加量为100～300mg/L培养基，添加磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，硫酸镁0.5-0.80g/L，pH自然，所用菌株为诱变得到的灰树花菌株；将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水洗涤，干燥至恒重得菌丝体；将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白、乙醇沉淀及冷冻干燥后即可得胞内多糖锰复合物。该方法的复合物新、产量高、高效低成本使用了廉价原料。
文档编号C12R1/645GK102816807SQ201110150890
公开日2012年12月12日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者刘伟民, 沈国栋, 赵莉, 李永转, 刘丽丽, 郭春梅, 任晓锋, 段玉清, 张红印, 赵杰文 申请人:江苏大学