专利名称：一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，具体涉及一种基于代谢组学技术调控根霉菌生物合成富马酸的方法。
背景技术：
富马酸是一种含有双键的二元羧酸，可以通过氨化、水合、加氢及异构等工艺生产 L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、1，4-丁二醇、马来酸等化合物，同时，作为重要的有机化工原料和精细化工产品也被广泛应用于材料(树脂、涂料及增塑剂等)、医药、化工、食品及饲料添加剂等领域(李学坤，张昆，高振等.富马酸的合成及应用[J].现代化工，2005， 25(suppll): 81-84.)。目前，富马酸主要通过石油衍生物马来酸酐转化而来，然而，随着石油资源的枯竭和价格的不断上升，研究者越来越重视用发酵技术代替石油化工转化技术从可再生资源中生物炼制富马酸。诸如米根霉(胁办印狀oryzae)等根霉属丝状真菌，其发酵产物可提取富马酸， 是目前生物法合成富马酸的主要菌种。但由于根霉菌的重组基因不易表达，特异性重组频率低，利用基因工程手段来提高根霉菌生产富马酸的转化率和生产能力仍很困难。传统的诱变方法是提高根霉菌发酵富马酸生产能力的重要工具。但是，由于传统的诱变方法对细胞是全局性的改变，很难通过定点分析的方法全面深入理解高产富马酸根霉菌菌株的代谢特征以及根霉菌高产富马酸的机理，不能有效的指导进一步菌种改造和工业发酵过程的优化。根霉菌胞液中的TCA还原途径是积累富马酸的主要途径，在富马酸有氧条件下的积累过程中，TCA循环和TCA还原途径是同时起作用的。TCA循环为细胞提供生长及基础代谢所需的中间代谢产物与能量ATP，还为TCA还原途径提供必需的还原力NADH。(Kenealy W, Zaady E, Dupreez JC, et al, Biochemical aspects of fumaric acid accumulation by Rhizopus arrhizus . Appl Environ Microbiol, 1986, 52: 128-133.)上述两条富马酸代谢途径间通过能量及还原力相互偶联。相对以上较多的研究根霉菌生物合成富马酸的生理过程，却少有报道根霉菌生物合成富马酸的分子机理。代谢组是细胞内各种各样生理变化产生的终端代谢物的集合，被认为是对基因或环境变化响应的一种放大。随着越来越多的丝状真菌被测序，科学家需要将这些数据与转录信息和代谢轮廓分析信息结合起来以全面系统理解根霉菌胞内代谢组特征(Mei jer，S. ； Panagiotou, G.; Olsson, L.； Nielsen, J. , Physiological characterization of xylose metabolism inAspergillus niger under oxygen-limited conditions. Biotechnology and Bioengineering 2007, 98 (2)，462-475.)，这些信息有利于理解因菌种改造和环境因素变化导致的代谢网络以及胞内代谢物的响应特性。对根霉菌来说，目前还没有报道基于代谢组学技术分析基础上的调控其生物合成富马酸发酵过程的报道。
发明内容
本发明技术目的是提供一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，该方法能利用代谢组学技术原理，系统、定量测定根霉菌高产富马酸菌株胞内代谢物，并通过多元统计数据分析方法确定生物标记物和显著变化的胞内代谢物，并结合根霉菌代谢网络比较分析获得根霉菌高产富马酸的代谢特征，将获得的信息指导根霉菌生物合成富马酸发酵过程的调控。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案如下。—种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于包括以下步骤 (1)同步培养
将根霉菌的原始菌株和其高产突变株用同样的培养条件分别同步培养发酵富马酸，并每12 16 h对发酵液进行取样。以米根霉为例，在本发明中，具体培养条件为在400 rpm、温度35°C的NBS发酵罐中，以10%的接种量接入装液量为5 L的7 L发酵罐中，发酵周期为72 h，每12 1 对发酵液进行取样分析。(2)根霉菌胞内代谢物的提取
将取样得到的发酵液中的根霉菌细胞用冷甲醇溶液灭活，并将淬灭后的根霉菌细胞在液氮中捣碎；将甲醇、氯仿、水的预冷溶液加入到细胞粉末中，同时，加入核糖醇作为内标物，振荡混均。(3) GC-TOF-MS测定和胞内代谢物分析
将步骤(2)得到的样品分别加入甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液和三甲基硅烷基三氟乙酰 (MSTFA)后，用气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF-MS)分析，定性定量检测出根霉菌细胞内所有代谢物。以米根霉为例，在本发明中，具体的分析方法为i yL的样品的以分流比1:1比例注入气相色谱里；质谱的扫描范围为m/z50-800，分析软件为Masslynx (version4. 1， Waters);GC-MS的分析峰利用NIST MS数据库及Golm Metabolome数据库进行分析确定。(4)多元统计分析
利用主成分分析法(PCA)对步骤(3)确定的胞内代谢物进行分析，确定生物标记物和显著变化因素。(5)高产富马酸根霉菌突变株的机理分析
将步骤(4)分析得到的生物标记物和显著变化因素结合根霉菌的代谢功能区进行比对，分析高产富马酸突变株细胞内的代谢特征，从代谢水平理解突变株高产富马酸的机理。其中所述的比对并不局限于糖代谢、氮代谢、嘌呤嘧啶代谢以及脂肪酸代谢等中心碳代谢网络，也包括质谱检测出来的其它任何相关代谢功能区。(6)根霉菌生物合成富马酸的发酵调控
结合根霉菌高产突变菌株的胞内代谢特征，通过有针对性的改变发酵过程参数，以实现调控根霉菌生物合成富马酸的发酵过程。其中，所述的发酵过程参数主要包括溶氧、pH、转速等；培养基成分，如碳源、氮源，无机盐等；培养方式，如分步发酵、连续发酵、补料发酵等；以及外源添加辅助因子等发酵技术以实现强化高产菌株的胞内代谢特征。本发明所述的根霉菌包括米根霉或者少根根霉。本发明的有益效果在于本发明将代谢组学技术应用于指导调控根霉菌生物合成富马酸的发酵过程。通过对高产富马酸菌株的代谢组分析，全面获得根霉菌高产富马酸胞内代谢特征信息，从而为发酵过程控制优化提供重要指导。与其它发酵调控策略相比，该方法能对细胞所有代谢物进行无偏分析，对发酵调控更具有针对性，效率更高，可以为发酵过程控制优化提供一种高效、系统的方法。
图1是本发明所述的调控方法示意图。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。实施例1
本实施例说明产富马酸米根霉(胁办印狀oryzae)的发酵过程调控方法。菌株(1)原始菌株米根霉(ATCC 20344)。(2)高产富马酸突变菌株采用波长为800 nm、重复频率为76 MHz的飞秒激光， 在照射功率为5 40 mW、照射时间为5 30 s的条件下对上述原始菌株进行处理，获得了一株米根霉高产富马酸菌株；其中所用的优化飞秒激光诱变方法，来自专利
发明者于守智, 徐晴, 李霜, 闻建平, 黄和 申请人:南京工业大学, 天津大学