专利名称：一种发酵生产透明质酸的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，涉及一种发酵生产透明质酸的方法，以青霉素类化合物作为发酵调控指标来促进兽疫链球菌代谢，从而提高透明质酸的产量及分子量。
背景技术：
透明质酸的生产方法主要有动物组织提取法和微生物发酵法。( I)动物组织提取法生产透明质酸20世纪30年代和40年代，Mayer等人从动物的眼玻璃体、脐带、皮肤、结缔组织、软骨、鸡胚、关节滑液及雄鸡冠等组织中提取得到透明质酸。透明质酸在动物组织中分布较为广泛，由于透明质酸含量、提取和纯化等因素，目前生产透明质酸的主要原料为鸡冠、人脐带和动物眼球。主要工艺过程包括提取、除杂、酶解、沉淀、分离、纯化。提取透明质酸的生物原料含较多的蛋白质而纯度不高，纯化去除蛋白质的操作造成分子量的大幅下降。同时，提取透明质酸的动物组织原料来源有限，且透明质酸的含量少、组织成分复杂、提取分离困难、成本非常高，因而价格十分昂贵。(2)微生物发酵法生产透明质酸1937年，Forrest等首次发现链球菌可以制备透明质酸，随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生透明质酸。发酵法生产透明质酸的质量主要取决于菌种、培养基、培养条件和分离提纯工艺。微生物发酵法所需原料简单易得、产量不受原料的限制、能够生产更高的分子量的透明质酸。同时透明质酸存在于发酵液内，易于与菌体分离，提取过程简单，微生物发酵法生产透明质酸的实现是透明质酸生产领域近年来取得的最重大的进展。不仅可以实现了大规模的生产，降低了生产成本，而且提高了透明质酸的产率及质量，因此发酵法成为透明质酸生产的发展方向。透明质酸发酵过程中的条件控制非常重要，目前，主要研究的发酵控制有温度、pH值、时间、营养条件、氧载体、搅拌转速、通气量(溶氧量)、发酵方式等因素。成霞、刘登如等人对搅拌转速、通气量等因素进行了考察，发现搅拌转速为200r/min、初始葡萄糖浓度为65. 8g/L、通气量为I. 2L/ (min L)时透明质酸的产量较高。Naoki Izawa等人研究了发酵条件及大豆多肽对透明质酸生产的影响。台湾成功大学Wei-Chih Huang等人发现溶氧从
2.5%提高至Ij 5%时，透明质酸的产量从0. 65g/g菌体增长到0. 76g/g菌体。SwaminathanJagannath等人研究了糖浓度、温度、pH值、营养成分对透明质酸产量及分子量的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种发酵生产透明质酸的方法，其利用青霉素类化合物抑制肽聚糖转肽酶及D-丙氨酸羧肽酶的活性抑制肽聚糖合成，干扰细胞壁合成，增加了细胞的通透性，有利于透明质酸向胞外分泌，提高菌株生产透明质酸的产量及分子量。为实现上述目的，本发明提供了一种发酵生产透明质酸的方法，包括以下步骤(I)取斜面菌I 2环接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，在温度为35°C、转速为200r/min的条件下振荡培养16 18小时；(2)将步骤I)得到的种子液接入装有50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量为10%，在摇床上进行培养，培养的条件为转速200r/min，初始pH值为7. 2，发酵温度为35°C，当培养到第8 14小时时，添加青霉素类化合物，添加青霉素类化合物的量为l(T30mg/L。作为本发明的优选实施例，在所述步骤(I)前，首先从菌种平板上划线，然后将平板培养基放置在隔水式恒温培养箱下培养，温度设定为35°C,时间12 16小时；
作为本发明的优选实施例，所述平板培养基的成分及含量(g/1)为葡萄糖10，牛肉膏:5，酵母浸粉:10, NaCl :5，琼脂20 ；作为本发明的优选实施例，所述种子培养基成分及含量(g/1)为葡萄糖20，NaH2PO4 2H20 :0. 75，蛋白胨10，酵母浸粉10，KH2PO4 :2. 0，MgSO4 7H20 :2. 0，Na2HPO4 12H20 1. 5 ；作为本发明的优选实施例，所述发酵培养基的成分及含量(g/1)为萄糖30，NaCl :3，酵母浸粉30，牛肉膏15, Na2HPO4 12H20 :1. 5,MgS04 *7H20 :1. OjNaHCO3 3, CaCO3 20 ；作为本发明的优选实施例，所述青霉素类化合物包括青霉素G类、青霉素V类、耐酶青霉素、广谱青霉素或抗绿脓杆菌的广谱青霉素；作为本发明的优选实施例，所述青霉素类化合物的添加量为20mg/L ；作为本发明的优选实施例，所述青霉素类化合物的添加时间为12小时。本发明发酵生产透明质酸的方法至少具有以下优点通过本发明方法发酵得到的透明质酸，其产量从0. 452mg/L提高到0. 520mg/L，最高产量达到0. 645mg/L，产量提高10% 30% ;平均分子量从900，OOODa提高到1000，OOODa，最高平均分子量达到1200，OOODa,分子量提高109^35%;经纯化后，蛋白质含量小于1%，紫外扫描显示与5标准品基本一致，提纯的HA溶液最大吸收峰在199. 7nm,在257nm、280nm无吸收峰,核酸与蛋白质去除较为干净。
图I是青霉素添加量为20mg/L时,添加时间分别为接种发酵后6小时、12小时、18小时透明质酸最大产量、菌体量与未添加青霉素的空白对照比较图；图2是青霉素添加时间在接种发酵第12小时，添加量分别为5ml UOml, 20ml、30ml时，透明质酸最大产量、菌体量与未添加青霉素的空白对照比较；图3是透明质酸溶液在190nnT300nm的紫外扫描曲线。
具体实施例方式I.发酵方法实施例I步骤I)在无菌操作台上，从原菌种斜面上挑一环在平板上划线，然后将平板培养基放置在隔水式恒温培养箱下培养，温度设定为35°C，时间12小时；步骤2)取斜面菌或步骤I)得到的菌种I 2环接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，在温度为35°C、转速为200r/min的条件下振荡培养16小时；步骤3)将步骤2)得到的种子液接入装有50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量为10%，在摇床上进行培养，培养的条件为转速200r/min，初始pH值为7. 2，发酵温度为35°C，当培养到第8小时，添加青霉素，添加青霉素的量为10mg/L，培养至透明质酸含量达到最大值为止，总时间约为16 24小时。实施例2步骤I)在无菌操作台上，从原菌种斜面上挑一环在平板上划线，然后将平板培养基放置在隔水式恒温培养箱下培养，温度设定为35°C，时间13小时；
步骤2)取斜面菌或步骤I)得到的菌种I 2环接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，在温度为35°C、转速为200r/min的条件下振荡培养16. 5小时；步骤3)将步骤2)得到的种子液接入装有50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量为10 %，在摇床上进行培养，培养的条件为转速200r/min，初始pH值为7. 2，发酵温度为35°C，当培养到第10小时，添加青霉素，添加青霉素的量为15mg/L，培养至透明质酸含量达到最大值为止，总时间约为16 24小时。实施例3步骤I)在无菌操作台上，从原菌种斜面上挑一环在平板上划线，然后将平板培养基放置在隔水式恒温培养箱下培养，温度设定为35°C，时间14小时；步骤2)取斜面菌或步骤I)得到的菌种I 2环接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，在温度为35°C、转速为200r/min的条件下振荡培养17小时；步骤3)将步骤2)得到的种子液接入装有50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量为10 %，在摇床上进行培养，培养的条件为转速200r/min，初始pH值为7. 2，发酵温度为35°C，当培养到第11小时时,添加青霉素,添加青霉素的量为20mg/L，培养至透明质酸含量达到最大值为止，总时间约为16 24小时。实施例4步骤I)在无菌操作台上，从原菌种斜面上挑一环在平板上划线，然后将平板培养基放置在隔水式恒温培养箱下培养，温度设定为35°C,时间15小时；步骤2)取斜面菌或步骤I)得到的菌种I 2环接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，在温度为35°C、转速为200r/min的条件下振荡培养17. 5小时；步骤3)将步骤2)得到的种子液接入装有50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量为
10%，在摇床上进行培养，培养的条件为转速200r/min，初始pH值为7. 2，发酵温度为35°C，当培养到第12小时时，添加青霉素，添加青霉素的量为25mg/L，培养至透明质酸含量达到最大值为止，总时间约为16 24小时。实施例5步骤I)在无菌操作台上，从原菌种斜面上挑一环在平板上划线，然后将平板培养基放置在隔水式恒温培养箱下培养，温度设定为35°C,时间16小时；步骤2)取斜面菌或步骤I)得到的菌种I 2环接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，在温度为35°C、转速为200r/min的条件下振荡培养18小时；
步骤3)将步骤2)得到的种子液接入装有50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量为10%，在摇床上进行培养，培养的条件为转速200r/min，初始pH值为7. 2，发酵温度为35°C，当培养到第14小时时，添加青霉素，添加青霉素的量为30mg/L，培养至透明质酸含量达到最大值为止，总时间约为16 24小时。在上述实施例中，所述菌种采用美国微生物菌种保藏中心的ATCC39920，属于马腺疫链球菌兽疫亚型(Streptococcus zooepidemicus)；所述平板培养基的成分及含量(g/1)如下葡萄糖 10牛肉膏5酵母浸粉10 NaCl 5琼脂20灭菌前调整pH为7. 0，121°C灭菌20min。 所述种子培养基成分及含量(g/1)如下
葡萄糖20 NaH2PO4 2H200.75
蛋白胨W_母浸粉10
KH2PO42.0 MgS04 7H2O2.0
Na2HPO4 12H20 L5灭菌前调整pH7. 0，121°C灭菌 20min。所述发酵培养基成分及含量(g/1)如下
葡萄糖30NaCl3
酵母浸粉30+_膏15
NazHPO4 12H2O1.5MySO, 7H01.0
NallCO；3CaCO',20灭菌前调整pH7.2，121°C灭菌 20min。所述青霉素类化合物包括青霉素G类如青霉素G钾、青霉素G钠、长效西林等。青霉素V类(别名苯氧甲基青霉素、6-苯氧乙酰胺基青霉烷酸)如青霉素V钾等(包括有多种剂型)。耐酶青霉素如苯唑青霉素(新青II号)、氯唑青霉素等广谱青霉素如氨苄青霉素、羟氨苄青霉素等。抗绿脓杆菌的广谱青霉素如羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、呋苄青霉素等。2.分析方法(I)葡糖醒酸含量测定(Bitter-Muir)葡糖醒酸含量测定最常用的是咔唑(carbazole)法。
(2)相对分子质量测定HA作为非均一的物质，各种方法所测分子量为平均分子量。本实验采用粘度法。(3)菌体生物量的测定采用分光光度计测浊度法，在620nm的条件下测定菌体的OD值。青霉素在透明质酸发酵调控的应用
(I)青霉素类化合物添加量青霉素类化合物添加量对于透明质酸产率与分子量密切相关，添加量过小，对透明质酸发酵影响不大，添加量过大，抑制菌体生长和代谢，透明质酸产量与空白对照相比下降，所以适当的添加量是控制发酵过程的重要因素。在本发明方法中，青霉素的添加量为 l(T30mg/L，最佳为20mg/L，低于5mg/L，产量增幅不明显，高于30mg/L，菌体生长受到抑制，菌体生长量下降，透明质酸产量亦下降，见图I。(2)青霉素类化合物添加时间微生物的生长分为延迟期、对数生长期、稳定期、衰老期等阶段，不同阶段添加效果不同，在延迟期及对数生长期前期添加青霉素类化合物抑制菌体生长，菌体生长缓慢，菌体量及透明质酸的产量下降。在稳定期添加对菌体量及透明质酸的产量影响较小，最佳添加青霉素类化合物的时间在对数生长中期及对数生长中后期，透明质酸的产量及分子量都得到提高。在本发明方法中，青霉素的添加时间为发酵至8 14小时，最佳为12小时，此时，菌种处于对数生长中期，透明质酸的产量提高10%以上，菌体生长量下降约10%，见图I。通过本发明方法发酵得到的透明质酸，其产量从0. 452mg/L提高到0. 520mg/L，最高产量达到0. 645mg/L,产量提高10% 30% ;平均分子量从900，OOODa提高到1000，OOODa,最高平均分子量达到1200，OOODa,分子量提高10% 35% ;经纯化后，蛋白质含量小于1%，紫外扫描显示与S标准品基本一致，提纯的HA溶液最大吸收峰在199. 7nm，在257nm、280nm无吸收峰，核酸与蛋白质去除较为干净，见图3。与未添加青霉素的发酵方法纯化后透明质酸的质量对比见下表一
权利要求
1.一种发酵生产透明质酸的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)取斜面菌I 2环接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，在温度为35°C、转速为200r/min的条件下振荡培养16 18小时； (2)将步骤I)得到的种子液接入装有50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量为10%，在摇床上进行培养，培养的条件为转速200r/min，初始pH值为7. 2，发酵温度为35°C，当培养到第8 14小时时，添加青霉素类化合物，添加青霉素类化合物的量为l(T30mg/L。
2.如权利要求I所述的发酵生产透明质酸的方法，其特征在于在所述步骤(I)前，首先从菌种平板上划线，然后将平板培养基放置在隔水式恒温培养箱下培养，温度设定为35°C，时间12 16小时。
3.如权利要求2所述的发酵生产透明质酸的方法，其特征在于所述平板培养基的成分及含量(g/Ι)为葡萄糖10，牛肉膏5，酵母浸粉10，NaCl :5，琼脂20。
4.如权利要求3所述的发酵生产透明质酸的方法，其特征在于所述种子培养基成分及含量(g/Ι)为葡萄糖:20，NaH2PO4 · 2H20 :0. 75，蛋白胨10，酵母浸粉:10，KH2PO4 :2. 0，MgSO4 · 7H20 2. O, Na2HPO4 · Iffi2O :1. 5。
5.如权利要求4所述的发酵生产透明质酸的方法，其特征在于所述发酵培养基的成分及含量(g/Ι)为萄糖:30，NaCl :3，酵母浸粉30，牛肉膏15，Na2HPO4 · 12H20 :1. 5，MgSO4 · 7H20 1. O, NaHCO3 :3，CaCO3 :20。
6.如权利要求I或4所述的发酵生产透明质酸的方法，其特征在于所述青霉素类化合物包括青霉素G类、青霉素V类、耐酶青霉素、广谱青霉素或抗绿脓杆菌的广谱青霉素。
7.如权利要求I所述的发酵生产透明质酸的方法，其特征在于所述青霉素类化合物的添加量为20mg/L。
8.如权利要求I或7所述的发酵生产透明质酸的方法，其特征在于所述青霉素类化合物的添加时间为12小时。
全文摘要
本发明提供了一种发酵生产透明质酸的方法，(1)取斜面菌1～2环接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，在温度为35℃、转速为200r/min的条件下振荡培养16~18小时；将步骤(1)得到的种子液接入装有50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量为10％，在摇床上进行培养，培养的条件为转速200r/min，初始pH值为7.2，发酵温度为35℃，当培养到第8~14小时时，添加青霉素类化合物，添加青霉素类化合物的量为10~30mg/L。通过本发明方法发酵得到的透明质酸，其产量提高10%~30%；平均分子量提高10%~35%。
文档编号C12P19/26GK102978262SQ201210520968
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者丁勇, 赵郁聪, 马建岗 申请人:陕西科技大学