专利名称：一种生产透明质酸的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产透明质酸的方法及其专用菌株。
背景技术：
透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质(Meyer K.，Palmer J.W.The polysaccharideof the vitreous humor.J.biol.chem，1934，107629-634)。此后，人们又对HA的分布、化学结构、生理功能和临床应用进行了大量的研究，特别是Balazs于1960年首次将HA用于复杂的视网膜脱离手术，并取得了理想的疗效之后，有关HA在医药应用领域的研究又取得了一系列重大的进展。HA作为一种生化药物，不仅在医学上应用广泛，在日化工业，由于HA具有良好的保湿作用，又是皮肤和其它组织中广泛存在的天然生物分子，从20世纪80年代开始用于化妆品中，被誉为理想的天然保湿因子(凌沛学，贺艳丽，郭学平。透明质酸。中国轻工业出版社，2000)，因而其在化妆品工业中也有广阔的应用前景。
HA最初的生产方法是从动物组织(主要是鸡冠、牛眼)中提取。这种动物组织提取法成本高、HA含量低(一般1kg新鲜鸡冠仅可以提取到4gHA)，且分离纯化复杂，提取的HA的分子量也比较小。1937年，Kendall等发现溶血性链球菌streptococcushaemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜(Kendall F.E.Heidelberger M.Dawson M.H.A serologically inactive polysaccharide elaborated by mucoid strain ofgroup A hemolytic Streptococcus.J.Biol.Chem.1937，118(1)61-69)；其后，又陆续报道了能合成HA的微生物菌种。由于许多链球菌都可以合成以HA多糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌(特别是对人体危害较小的C型)成为研究最多的HA生产菌，已报道的能作为HA生产菌的链球菌有溶血性链球菌(A型)，兽疫链球菌(C型)，马链球菌(C型)，粪马链球菌(C型)，缺乳链球菌(C型)以及鸡霍乱杆菌(C型)等；其中A型为人体致病菌，C型则只能感染畜类。1983年，首次报道了日本的资生堂用链球菌生产HA(赤坂日出道，驹崎久幸，柳光男，株式会社资生堂。アルロン酸の制造方法。日本公开特许公报，昭58-56692，1983)，随后，英美等国相继报道了采用微生物发酵法生产HA的方法，大大拓宽了HA的来源，推动了HA的研究和应用。微生物发酵生产HA的实现是HA生产领域在近年来取得的最重大的进展。链球菌属于蒹性厌氧菌，在有氧和无氧条件下都可以生长。而从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成(Goh，L.T.Fermentation studies of hyaluronic acidfermentat ion by Streptococcus zooepidemicus.In Chemical Engineering；BrisbaneUniversity of Queensland，1998)。但是在发酵过程中由于产生的透明质酸包裹在菌体周围，增加了发酵液粘稠度，降低溶氧，限制了菌的生长和透明质酸的产量，成为了限制透明质酸发酵工业的一个重要因素。
透明颤菌(Vitreoscilla sp.)是一种专性好氧的革兰氏阴性菌，在低氧环境中诱导合成透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)，其编码基因为透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene，vgb，序列见序列表中的序列1)，这种血红蛋白能在极低的溶氧量(＜5％)下被大量诱导合成，使透明颤菌在贫氧环境中(如泥塘腐地)很好地生存(Fish P A，Webster D A，Stark B C.Vitreoscillahemoglobin enhances the first step in 2，4-dinitroluene degradation in vitroand at low aeration in vivo，Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic，2000，975-82)。VHb是以氧合态参与和氧有关的代谢，通过将氧传递给呼吸链，而调节末端氧化酶的活性，改变氧化磷酸化的效率，进而改变低氧条件下的代谢途径，以至影响到某些基因的表达。它能够从分子水平上提高重组菌对氧气的利用能力(Jacobsen J R，Khosla C.New directions in metabolic engineering.CurrentOpinion in Chemical Biology 1998，2133-137)。一些文献报导了vgb基因的应用实例，表明它具有促进细胞生长，提高细胞培养密度和外源基因表达的作用。如vgb基因在金色链霉菌中的表达可将产物链霉素的合成提高40％～60％(孟春，叶勤，石贤爱，邱荔，宋思扬，郭养浩。透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达。微生物学报，2002，42(3)305-310)。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产透明质酸的方法及其专用菌株。
本发明所提供的生产透明质酸的专用菌株为含有vgb基因的重组链球菌。
所述链球菌为溶血性链球菌、兽疫链球菌、马链球菌、粪马链球菌、缺乳链球菌和鸡霍乱杆菌中的任意一种。
所述链球菌优选为A型溶血性链球菌、C型兽疫链球菌、C型马链球菌、C型粪马链球菌、C型缺乳链球菌和C型鸡霍乱杆菌中的任意一种。
所述链球菌更优选为兽疫链球菌ATCC 39920。
本发明所提供的生产透明质酸的方法，是构建含有vgb基因序列的质粒表达载体，将构建的载体导入链球菌中，获得重组链球菌，发酵重组链球菌得到透明质酸。
所构建的质粒表达载体为将vgb基因插入到载体pEU308(Eichenbaum Z.，FederleM.J.1998.Use of the lactococcal nisA promoter to regulate gene expressionin Gram-positive bacteriacomparison of induction level and promoter strength.Appl.Environ.Microbiol.642763-2769)的多克隆位点获得的pEUVGB。
为提高转化效率，将重组质粒表达载体导入链球菌中的方法优选为电转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如热激法、原生质体转化法、接合转化法等。
目前在发酵法生产透明质酸的中后期，随着透明质酸的生成，发酵液粘稠度增加，溶氧降低，限制了菌体的生长。本发明巧妙地将vgb基因导入链球菌中，通过在链球菌中表达vgb基因，可显著提高菌体对氧的利用率，促进菌体生长，使透明质酸的产量提高了约20％。将本发明应用到发酵工业中，可以解决高密度发酵中氧气的供求矛盾，提高透明质酸产量，具有重要的工业应用价值。
图1为本发明质粒构建流程图。
图2不同菌体摇瓶实验的透明质酸含量检测结果。
具体实施例方式
实施例1、构建含有vgb基因的质粒pEUVGB菌种大肠杆菌E.coli JM109用于构建质粒的培养基为(g/l)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10，壮观霉素100mg/l。
构建含有vgb基因的质粒pEUVGB的过程如图1所示1)在标准的聚合酶链式反应条件下，以pBR322-vgb质粒(Yu H M，Shi Y，ZhangY P，Yang S L，Shen Z Y.Effect of Vitreoscilla hemoglobin biosynthesis inEscherichia coli on production of poly(β-hydroxybutyrate)and fermentativeparameters.FEMS Microbiol.Lett.，2002，214223-227)为模板，以Pvgb-upGCGAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGTATGGCAAAACCATAAT和Pvgb-doATTAGATCT(BglII)CTTTATTCAACCGCTTGAGC为引物得到485bp的DNA扩增片段，其基因序列为基因序列表中的SEQ ID NO1。
PCR反应条件95℃变性1min，57℃褪火1min，72℃延伸1min，30个循环。
2)将上述包含有vgb基因的DNA扩增片段，用限制性内切酶HindIII，ClaI酶切处理后，插入到质粒pEU308的HindIII，BglII位点之间，得到质粒pEUVGB。
实施例2、兽疫链球菌感受态细胞的制备以及电转化方法菌种兽疫链球菌ATCC 39920转化中所用培养基为THYB(g/l)todd-hewitt broth 36.4，酵母浸出物0.5％(w/v)，壮观霉素100mg/l。
1) 感受态细胞的制备I) 将兽疫链球菌在THYB培养基中培养过夜；II)将其接种到50ml新鲜的THYB培养基中，接种后D530不超过0.05，培养到OD530约0.25左右即可；III)在培养结束前半小时加入透明质酸酶0.4mg/ml；IV)4℃，8000g，离心10分钟，弃上清，用20mL 0.5M蔗糖溶液重悬细胞；V) 4℃，8000g，离心10分钟，弃上清，用1mL 0.5M蔗糖溶液重悬细胞，再离心，弃上清；VI)将细胞重悬在250uL含有10％甘油的0.5M蔗糖溶液中，按使用体积分装到eppendorf管中；VII) 迅速置于-80℃保存。
2)兽疫链球菌的电转化I) 在200uL感受态细胞中加入8uLDNA，冰浴10分钟；II)将混合体系转移到2mm电激杯中电激，电压设为2.5kv；III)用1mL冰冷的THYB将混合体系转移到10mlTHYB中，冰浴30-60分钟；IV) 37℃静置培养1小时；V) 4℃，6000g，离心10分钟，菌体用1mlTHYB重悬并涂于抗性平板上进行转化子的筛选，得到重组兽疫链球菌。
实施例3，重组兽疫链球菌的发酵以及HA的检测菌种重组兽疫链球菌外源基因vgb基因培养基成分1)种子培养基蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏10g/l，MgSO4·7H2O2g/l，MnSO4·4H2O0.1g/l，KH2PO42g/l，微量元素液1ml/l，缓冲液40ml/l；其中微量元素液含CaCl22g/l，MnSO4·4H2O24mg/l，ZnCl246mg/l，CuSO4·5H2O19mg/l。
缓冲液含Na2HPO4·12H2O36.76g/l，NaH2PO4·12H2O15.98g/l，NaHCO312.5g/l。
2)发酵培养基酵母粉20g/l，Na2HPO4·12H2O6.2g/l，MgSO4·7H2O2g/l，K2SO41.3g/l，FeSO4·7H2O5mg/l，微量元素液2.5ml/l，蔗糖40g/l，壮观霉素100mg/l(重组菌发酵时加入)。
1)培养方法用接种环挑取平板上的菌种接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，于200rpm的摇床上培养14-16小时，培养温度设为37℃。然后按10％的接种量将种子培养液接入盛有50ml发酵培养基的500ml三角瓶中培养14小时，培养温度设为37℃，摇床转速200rpm。重组菌以100mg/l的浓度加入壮观霉素。
2)透明质酸含量测定方法采用bitter-muir氏法(Bitter T.，Muri H.M.A modified uronic acid carbazolreaction.Anal.Biochem.1962，4330-334)，将5ml0.025M十水合四硼酸钠的浓硫酸溶液加入具塞试管，冷却到-20℃；小心加入0.5ml的样品或标准样，试管用磨砂玻璃塞密封，摇动试管。在剧烈沸腾的沸水浴中加热10分钟，然后冷却到室温，加入0.2ml咔唑试剂(0.125％咔唑溶于无水乙醇中)，再次摇动试管，在沸水浴中再加热15分钟，冷却到室温，在530nm下，用1cm比色皿测量光密度值，OD530值对硫酸空白的应小于0.025。其中标准样为葡萄糖醛酸标准液4-40ug/ml，用储备的苯甲酸饱和去离子水制备，4℃下能够稳定存放6个月。发酵液的测量样品制备方法如下a)取1ml发酵液准确稀释到4ml，6000转离心10分钟；b)取1ml上清加入到4ml无水乙醇中，振荡，6000转离心5分钟；c)弃去上清，加入2ml0.2MNaCl，放置，间或振荡，直至最终溶解；d)加入4ml无水乙醇，振荡，6000转离心5分钟；e)弃去上清，沉淀用2ml去离子水溶解作为HA测定的样品。
3)实验结果从图2可以看出(1-S.Z.兽疫链球菌，2-转入空载体pEU308的兽疫链球菌，3-转入重组质粒pEUVGB的重组菌)，带有vgb基因的重组菌的透明质酸产量高于原始菌。在本发酵实验中，重组菌的透明质酸产量相对于原始菌提高了约20％。
序列表<210>1<211>485<212>DNA<213>透明颤菌(Vitreoscilla)<400>1atgtatggca aaaccataat aatgaactta aggaagaccc tcatgttaga ccagcaaacc 60attaacatca tcaaagccac tgttcctgta ttgaaggagc atggcgttac cattaccacg120actttttata aaaacttgtt tgccaaacac cctgaagtac gtcctttgtt tgatatgggt180cgccaagaat ctttggagca gcctaaggct ttggcgatga cggtattggc ggcagcgcaa240aacattgaaa atttgccagc tattttgcct gcggtcaaaa aaattgcagt caaacattgt300caagcaggcg tggcagcagc gcattatccg attgtcggtc aagaattgtt gggtgcgatt360aaagaagtat tgggcgatgc cgcaaccgat gacattttgg acgcgtgggg caaggcttat420ggcgtgattg cagatgtgtt tattcaagtg gaagcagatt tgtacgctca agcggttgaa480taaag48权利要求
1.含有vgb基因的重组链球菌。
2.根据权利要求1所述的重组链球菌，其特征在于所述链球菌为溶血性链球菌、兽疫链球菌、马链球菌、粪马链球菌、缺乳链球菌和鸡霍乱杆菌中的任意一种。
3.根据权利要求2所述重组链球菌，其特征在于所述链球菌为A型溶血性链球菌、C型兽疫链球菌、C型马链球菌、C型粪马链球菌、C型缺乳链球菌和C型鸡霍乱杆菌中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的重组链球菌，其特征在于所述链球菌为兽疫链球菌ATCC 39920。
5.一种生产透明质酸的方法，是构建含有vgb基因的表达载体，将构建的载体导入链球菌中，获得重组链球菌，发酵重组链球菌得到透明质酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所构建的质粒表达载体为将vgb基因插入到载体pEU308的多克隆位点获得的pEUVGB。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述将重组质粒表达载体导入链球菌中的方法为电转化法。
全文摘要
本发明公开了一种可提高透明质酸产量的方法。本发明所提供的提高透明质酸产量的方法是构建一个含有vgb基因序列的质粒表达载体，再导入链球菌中进行表达。所构建的质粒表达载体为pEUVGB，是将vgb基因序列插入到质粒载体pEU308的多克隆位点获得的。所述链球菌优选为兽疫链球菌。通过在兽疫链球菌中表达vgb基因，可显著提高菌体对氧的利用率，促进菌体生长，增加透明质酸的产量。将本发明应用到发酵工业中，可以解决高密度发酵中氧气的供求矛盾，提高透明质酸产量。因而本发明具有重要的工业应用价值。
文档编号C12N15/87GK1587387SQ200410070768
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月26日 优先权日2004年7月26日
发明者陈国强, 郝宁 申请人:清华大学