专利名称：生产透明质酸的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产透明质酸的方法及其专用菌株。
背景技术：
透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质(Meyer K.，Palmer J.W.The polysaccharideof the vitreous humor.J.biol.chem，1934，107629-634)。此后，人们又对HA的分布、化学结构、生理功能和临床应用进行了大量的研究，特别是Balazs于1960年首次将HA用于复杂的视网膜脱离手术，并取得了理想的疗效之后，有关HA在医药应用领域的研究又取得了一系列重大的进展。HA作为一种生化药物，不仅在医学上应用广泛，在日化工业，特别是化妆品工业中也有广阔的应用前景(陈同来。41种生物化学制品。北京大学出版社，1996)。
HA最初的生产方法是从动物组织(主要是鸡冠、牛眼)中提取。这种动物组织提取法成本高、HA含量低(一般1kg新鲜鸡冠仅可以提取到4gHA)，且分离纯化复杂，提取的HA的分子量也比较小。1937年，Kendall等发现溶血性链球菌streptococcushaemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜(Kendall F.E.Heidelberger M.Dawson M.H.A serologically inactive polysaccharide elaborated by mucoid strain ofgroup A hemolytic Streptococcus.J.Biol.Chem.1937，118(1)61-69)；其后，又陆续报道了能合成HA的微生物菌种。由于许多链球菌都可以合成以HA多糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌(特别是对人体危害较小的C型)成为研究最多的HA生产菌，已报道的能作为HA生产菌的链球菌有溶血性链球菌(A型)，兽疫链球菌(C型)，马链球菌(C型)，粪马链球菌(C型)，缺乳链球菌(C型)以及鸡霍乱杆菌(C型)等；其中A型为人体致病菌，C型则只能感染畜类。1983年，首次报道了日本的资生堂用链球菌生产HA(赤坂日出道，驹崎久幸，柳光男，株式会社资生堂。アルロン酸の制造方法。日本公开特许公报，昭58-56692，1983)，随后，英美等国相继报道了采用微生物发酵法生产HA的方法，大大拓宽了HA的来源，推动了HA的研究和应用。微生物发酵生产HA的实现是HA生产领域在近年来取得的最重大的进展。
链球菌属于兼性厌氧菌，在有氧、无氧条件下都可以生长。HA在链球菌内的生物合成路线表明，透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖在透明质酸合成酶作用下通过β-1-3和β-1-4糖苷键连接而成的二糖单体重复构建而形成的直链高分子多糖，如图1所示。在有氧条件下，链球菌利用氧分子将NADH氧化为NAD，同时ADP转化为ATP。ATP的积累有利于UTP的生成，而UTP是合成HA的两个前体化合物(UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖)所必须的物质，因而从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成(Goh，L.T.Fermentation studies of hyaluronic acidfermentation by Streptococcus zooepidemicus.In Chemical Engineering；BrisbaneUniversity of Queensland，1998)。但是，细胞在合成HA的同时也合成大量的小分子有机酸，其中大部分是乳酸和乙酸，使得发酵过程中pH值以0.01-0.15/min的速度降低。一方面大量的碳源流向乳酸合成，使得碳源向透明质酸的转化率很低；另一方面当发酵液pH值低于5.0时，菌体生长和代谢很慢或停止，限制了发酵生产中HA的产率(高海军，Streptococcus zooepidemicus，生物合成透明质酸的过程优化与代谢网络分析，无锡轻工业大学，1999)，这也成为了限制透明质酸发酵工业的一个重要因素。
通过对兽疫链球菌代谢网络的分析发现在发酵过程中，链球菌产生大量乳酸的原因是为了获得NAD的再生。控制较高溶氧时，乳酸产量下降，而溶氧降低时，乳酸产量增加。因为细菌的另一条NAD再生途径是通过O2直接氧化NADH，这个过程需要NADH氧化酶的作用，在兽疫链球菌内过表达NADH氧化酶能降低乳酸合成(ChongB.F.，Nielsen L.K.Amplifying the cellular reduction potential ofStreptococcus zooepidemicus.J.Biotech.2003，10033-41)，这个现象证明了当细菌有足够氧化力的时候乳酸产量能够下降。但是由于发酵液粘度非常高，溶氧很低，而且O2以及一些中间产物过氧化物都是对细胞有毒性的，限制了透明质酸产量的提高。
聚羟基丁酸(Polyhydroxyalkanoic acids，PHB)的合成是大多数细菌在NADH/NAD水平升高时有普遍意义的代谢反应。在合成PHB时可以将NADH氧化成NAD，从而完成NAD循环避免NADH的堆积(Lafferty R.M.，Korsatko B.，Korsatko W.1988，Biotechnology.Vol.6)。Ralstonia.eutropha的PHB合成途径是目前研究得最清楚的PHB合成途径。它的PHB合成酶系统由phbCAB基因(见序列表中的序列1)编码，包含三种酶3-酮基硫解酶(3-ketothiolase)、NDPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetoacyl-CoA reductase)和PHB合成酶(PHB synthase)；上述三种酶分别由phbA、phbB和phbC基因编码，且位于同一个操纵子上，如图2所示。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产透明质酸的方法及其专用菌株。
本发明所提供的生产透明质酸的专用菌株为含有phbCAB基因的重组链球菌。
所述链球菌为溶血性链球菌、兽疫链球菌、马链球菌、粪马链球菌、缺乳链球菌和鸡霍乱杆菌中的任意一种。其中优选为A型溶血性链球菌、C型兽疫链球菌、C型马链球菌、C型粪马链球菌、C型缺乳链球菌和C型鸡霍乱杆菌中的任意一种。兽疫链球菌ATCC 39920是最优选的。
本发明所提供的生产透明质酸的方法，是构建含有phbCAB基因的质粒表达载体，将构建的载体导入链球菌中，获得重组链球菌，发酵重组链球菌得到透明质酸。
所构建的质粒表达载体优选的是将phbCAB基因插入到载体pEU308(EichenbaumZ.，Federle M.J.1998.Use of the lactococcal nisA promoter to regulate geneexpression in Gram-positive bacteriacomparison of induction level andpromoter strength.Appl.Environ.Microbiol.642763-2769)的多克隆位点获得的pEUHB。
为提高转化效率，将重组质粒表达载体导入链球菌中的方法优选为电转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如热激法、原生质体转化法、接合转化法等。
为了提高透明质酸的产量，在发酵重组链球菌时还可以加入抗生素或/和IPTG，实验表明，同时加入抗生素和IPTG的情况下效果最好。一般情况下抗生素优选的是壮观霉素，所加入的抗生素的浓度一般为80-120mg/l；IPTG的浓度一般为15-25mM。抗生素的使用可以起到稳定质粒的作用，IPTG的作用是诱导基因的表达。
本发明通过在链球菌中表达phbCAB基因，获得了新的NAD再生途径，从而避免了NADH堆积，减少了乳酸的生成；同时NAD是合成透明质酸所需的，因而也促进了透明质酸的合成，摇瓶中透明质酸的产量提高29％的同时乳酸产量降低29％。将本发明应用到透明质酸的发酵工业中，一方面可以解决乳酸产量过高，消耗大量碳源，降低发酵液pH值，抑制菌株生长的问题；另一方面还能够促进透明质酸合成，提高透明质酸产量，具有重要的工业应用价值。
图1为链球菌中心代谢途径与HA合成的关系2为编码PHB的生物合成酶基因操纵子示意3为表达载体pEUHB的构建图具体实施方式
实施例1、含有phbCAB基因的载体pEUHB的构建菌种大肠杆菌E.coli JM109
构建质粒所用的培养基为(g/l)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10，壮观霉素100μg/l。
构建pEUHB的过程如图3所示，包括以下步骤1)在标准的聚合酶链式反应条件下，以pBHR68质粒(supplied by Steinbüchel of Münster University in Germany)为模板，以PphbCAB-upATAAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGGCGACCGGCAAAGGC和PphbCAB-doGTTATCGAT(ClaI)CGGCAGGTCAGCCCATAT为引物得到3884bp的DNA扩增片段，其基因序列为基因序列表中的SEQ ID NO1。
PCR反应条件96℃45秒，66℃1分钟，72℃4分30秒，共30个循环。
2)将上述包含有phbCAB基因的DNA扩增片段，用限制性内切酶HindIII，ClaI酶切处理后，插入到质粒pEU308的HindIII，ClaI位点之间，得到质粒pEUHB。
实施例2、兽疫链球菌感受态细胞的制备以及电转化方法菌种兽疫链球菌ATCC 39920转化中所用培养基为THYB(g/l)todd-hewitt broth 36.4，酵母浸出物0.5％(w/v)，壮观霉素100mg/l。
1)感受态细胞的制备I) 将兽疫链球菌ATCC 39920在THYB培养基中培养过夜；II)将其接种到50ml新鲜的THYB培养基中，接种后D530不超过0.05，培养到OD530约0.25左右即可；III)在培养结束前半小时加入透明质酸酶0.4mg/ml；IV) 4℃，8000g，离心10分钟，弃上清，用20mL 0.5M蔗糖溶液重悬细胞；V) 4℃，8000g，离心10分钟，弃上清，用1mL 0.5M蔗糖溶液重悬细胞，再离心，弃上清；VI) 将细胞重悬在250uL含有10％甘油的0.5M蔗糖溶液中，按使用体积分装到eppendorf管中；VII)迅速置于-80℃保存。
2) 兽疫链球菌的电转化I) 在200uL感受态细胞中加入500-5000ng质粒pEUHB，冰浴10分钟；II) 将混合体系转移到2mm电激杯中电激，电压设为2.5kv；III)用1mL冰冷的THYB将混合体系转移到10mlTHYB中，冰浴30-60分钟；IV) 37℃静置培养1小时；V) 14℃，6000g，离心10分钟，菌体用1mlTHYB重悬并涂于抗性平板上进行转化子的筛选，得到重组兽疫链球菌。
实施例3、重组菌中PhbB(乙酰乙酰辅酶A还原酶)酶活的检测菌种重组兽疫链球菌外源基因phbCAB所用培养基为THYB(g/l)todd-hewitt broth 36.4，酵母浸出物0.5％(w/v)，壮观霉素100mg/l，IPTG 20mM。
1)酶活测定方法反应总体积500ul，包括12.5ul 10mmol/l NADPH，12.5ul7mmol/l乙酰辅酶A和425ul的缓冲液(120mmol/l磷酸钾，24mmol/l氯化镁，1mmol/l二硫苏糖醇)，先30℃预热1分钟，然后加入50ul酶粗提液，立即检测340nm的吸光度值变化。一个PhbB酶活单位(U)定义为1分钟降解1umol NADPH。酶粗提液的制备如下细胞在加入IPTG的条件下37℃培养14小时，离心弃去上清，用0.1mol/l Tris-HCl(pH7.5)重悬菌体，再离心弃上清，菌体用10％体积的0.1mol/l Tris-HCl(pH7.5)重悬；超声破碎细胞，离心，上清作为酶粗提液。蛋白测定按传统的Bradford方法进行。
2)实验结果在有IPTG诱导情况下，重组兽疫链球菌中PhbB的酶活为每毫克总蛋白0.45U，而原始菌中没有检测到PhbB酶活，phbB在重组菌中得到表达并具有一定活性。
实施例4、重组兽疫链球菌的摇瓶发酵以及HA，乳酸，乙酸的检测菌种重组兽疫链球菌外源基因phbCAB将实验菌分为原始菌和重组菌，再将重组菌分为四组(一组只加入IPTG，一组只加入壮观霉素，一组同时加入IPTG和壮观霉素，一组两者都不加)。
培养基成分1)种子培养基蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏10g/l，MgSO4·7H2O2g/l，MnSO4·4H2O0.1g/l，KH2PO42g/l，微量元素液1ml/l，缓冲液40ml/l；其中微量元素液含CaCl22g/l，MnSO4·4H2O24mg/l，ZnCl246mg/l，CuSO4·5H2O19mg/l；缓冲液含Na2HPO4·12H2O36.76g/l，NaH2PO4·12H2O15.98g/l，NaHCO312.5g/l。
2)发酵培养基酵母粉20g/l，Na2HPO4·12H2O6.2g/l，MgSO4·7H2O2g/l，K2SO41.3g/l，FeSO4·7H2O5mg/l，微量元素液2.5ml/l蔗糖40g/l；壮观霉素100mg/l，IPTG20mM1)摇瓶发酵方法用接种环挑取平板上的菌种接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，于200rpm的摇床上培养14-16小时，培养温度设为37℃；然后按10％的接种量将种子培养液接入盛有50ml发酵培养基的500ml三角瓶中培养14小时，培养温度设为37℃，摇床转速200rpm。需要用IPTG诱导质粒的spac启动子表达的时候，先加入IPTG再进行摇培。
2)测定方法透明质酸含量测定采用bitter-muir氏法(Bitter T.，Muri H.M.A modifieduronic acid carbazol reaction.Anal.Biochem.1962，4330-334)，将5ml0.025M十水合四硼酸钠的浓硫酸溶液加入具塞试管，冷却到-20℃；小心加入0.5ml的样品或标准样，试管用磨砂玻璃塞密封，摇动试管。在剧烈沸腾的沸水浴中加热10分钟，然后冷却到室温，加入0.2ml咔唑试剂(0.125％咔唑溶于无水乙醇中)，再次摇动试管，在沸水浴中再加热15分钟，冷却到室温，在530nm下，用1cm比色皿测量光密度值，OD530值对硫酸空白的应小于0.025。其中标准样为葡萄糖醛酸标准液4-40ug/ml，用储备的苯甲酸饱和去离子水制备，4℃下能够稳定存放6个月。发酵液的测量样品制备方法如下a)取1ml发酵液准确稀释到4ml，6000转离心10分钟；b)取1ml上清加入到4ml无水乙醇中，振荡，6000转离心5分钟；c)弃去上清，加入2ml0.2MNaCl，放置，间或振荡，直至最终溶解；d)加入4ml无水乙醇，振荡，6000转离心5分钟；e)弃去上清，沉淀用2ml去离子水溶解作为HA测定的样品。
蔗糖、乳酸盐及乙酸盐浓度的测定采用HPLC(SpectroSYSTEM P2000，Thermoseparation products，USA)法。折光检测器，离子交换柱Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm，流动相为0.005M硫酸溶液，流速0.50ml/min。检测前，取0.2ml发酵样品，准确稀释到4ml，10000rpm/min离心5分钟，去上清，0.45um滤膜过滤后作为色谱的样品。
3)实验结果表1 摇瓶发酵实验结果
由表1可以看出，重组菌的透明质酸产量普遍高于原始菌，而且在有IPTG诱导phbCAB基因表达的情况下，乳酸产量下降了大约29％。摇瓶发酵结果显示在只有抗生素加入的时候HA的产量最高。
序列表<160>1<210>1<211>3884<212>DNA<213>Ralstonia.eutropha<400>1ataaagctta aggaggatgg cgaccggcaa aggcgcggca gcttccacgc aggaaggcaa60gtcccaacca ttcaaggtca cgccggggcc attcgatcca gccacatggc tggaatggtc120ccgccagtgg cagggcactg aaggcaacgg ccacgcggcc gcgtccggca ttccgggcct180ggatgcgctg gcaggcgtca agatcgcgcc ggcgcagctg ggtgatatcc agcagcgcta240catgaaggac ttctcagcgc tgtggcaggc catggccgag ggcaaggccg aggccaccgg300tccgctgcac gaccggcgct tcgccggcga cgcatggcgc accaacctcc catatcgctt360cgctgccgcg ttctacctgc tcaatgcgcg cgccttgacc gagctggccg atgccgtcga420ggccgatgcc aagacccgcc agcgcatccg cttcgcgatc tcgcaatggg tcgatgcgat480gtcgcccgcc aacttccttg ccaccaatcc cgaggcgcag cgcctgctga tcgagtcggg540cggcgaatcg ctgcgtgccg gcgtgcgcaa catgatggaa gacctgacac gcggcaagat600ctcgcagacc gacgagagcg cgtttgaggt cggccgcaat gtcgcggtga ccgaaggcgc660cgtggtcttc gagaacgagt acttccagct gttgcagtac aagccgctga ccgacaaggt720gcacgcgcgc ccgctgctga tggtgccgcc gtgcatcaac aagtactaca tcctggacct780gcagccggag agctcgctgg tgcgccatgt ggtggagcag ggacatacgg tgtttctggt840gtcgtggcgc aatccggacg ccagcatggc cggcagcacc tgggacgact acatcgagca900cgcggccatc cgcgccatcg aagtcgcgcg cgacatcagc ggccaggaca agatcaacgt960gctcggcttc tgcgtgggcg gcaccattgt ctcgaccgcg ctggcggtgc tggccgcgcg1020cggcgagcac ccggccgcca gcgtcacgct gctgaccacg ctgctggact ttgccgacac1080gggcatcctc gacgtctttg tcgacgaggg ccatgtgcag ttgcgcgagg ccacgctggg1140cggcggcgcc ggcgcgccgt gcgcgctgct gcgcggcctt gagctggcca ataccttctc1200gttcttgcgc ccgaacgacc tggtgtggaa ctacgtggtc gacaactacc tgaagggcaa1260
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1.含有phbCAB基因的重组链球菌。
2.根据权利要求1所述的重组链球菌，其特征在于所述链球菌为溶血性链球菌、兽疫链球菌、马链球菌、粪马链球菌、缺乳链球菌和鸡霍乱杆菌中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的重组链球菌，其特征在于所述链球菌为A型溶血性链球菌、C型兽疫链球菌、C型马链球菌、C型粪马链球菌、C型缺乳链球菌和C型鸡霍乱杆菌中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的重组链球菌，其特征在于所述链球菌为兽疫链球菌ATCC 39920。
5.一种生产透明质酸的方法，是构建含有phbCAB基因的质粒表达载体，将构建的载体导入链球菌中，获得重组链球菌，发酵重组链球菌得到透明质酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所构建的质粒表达载体为将phbCAB基因插入到载体pEU308的多克隆位点获得的pEUHB。
7.根据权利要求5或6所述，其特征在于所述将重组质粒表达载体导入链球菌中的方法为电转化法。
8.根据权利要求5或6所述，其特征在于所述发酵重组链球菌时加入抗生素或/和IPTG。
9.根据权利要求8所述，其特征在于所述抗生素为壮观霉素。
10.根据权利要求8或9所述，其特征在于所述加入的抗生素的浓度为80-120mg/l；IPTG的浓度为15-25mM。
全文摘要
本发明公开了一种可提高透明质酸产量的方法。本发明所提供的提高透明质酸产量的方法是构建一个含有phbCAB基因序列的质粒表达载体，再导入链球菌中进行表达。所构建的质粒表达载体为pEUHB，是将phbCAB基因序列插入到质粒载体pEU308的多克隆位点获得的。所述链球菌优选为兽疫链球菌。将本发明应用到透明质酸的发酵工业中，一方面可以解决乳酸产量过高，消耗大量碳源，降低发酵液pH值，抑制菌株生长的问题；另一方面还能够促进透明质酸合成，提高透明质酸产量，具有重要的工业应用价值。
文档编号C12N1/21GK1587386SQ20041007076
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月26日 优先权日2004年7月26日
发明者陈国强, 张晋宇 申请人:清华大学