专利名称：与脂肪酸合成相关的蛋白GmLEC1B及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中与脂肪酸合成相关的蛋白GmLEClB及其编码基因与应用。
背景技术：
植物油作为主要的食用油和重要的可再生能源物质而受到广泛关注。目前，世界上食用油的85%来自于植物油，只有25%来自于动物和海洋生物。同时，植物油也被广泛应用于工业领域，如洗涤剂，润滑油，油漆和生物可降解塑料等。另外，值得一提的是，植物柴油的开发可能为解决全球能源危机和环境污染提供了一条新的途径。随着人们对植物油的需求量越来越大，现有的产量将远远不能满足社会的需求。大豆作为主要的经济作物之一，是食用植物油的重要来源。大豆油的饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例相对其它的植物油(如菜籽油、花生油等)较为合理，其消费量和食用量也已经逐步超过了其它植物油，成为人们日常饮食重要的营养来源之一。我国是大豆的故乡，世界上其他国家种植的大豆，大都是直接或间接从我国传入的。20世纪50年代以前，中国是世界大豆的重大生产国。然而从1953年，这个地位被美国取而代之，随着大豆在美洲的扎根、受扶植以及转基因技术盛行，到1996年，中国由大豆净出口国变成了净进口国。至2006年，大豆进口量已接近中国粮食进口总量的90%，而且大多来自美洲。因此提高大豆油的产量和含油量是我国目前迫切需要解决的问题。随着生物技术的发展，转基因工程为我们提供了一个有效的途径。首先通过遗传学的方法鉴定与油脂合成有关的调控基因，然后利用基因工程的方法来改善这些调控基因，从而提高大豆种子的含油量。近十余年来，科学家们利用生物技术对脂肪酸生物合成过程中的关键基因进行遗传改良，但都没能取得显著的效果，其中一个主要的原因是植物体内的脂肪酸合成是一个复杂和高度协调的过程，是多基因协同完成的，因此改良单个的脂肪酸合成的基因，并不能有效的改善脂肪酸的含量。最近的研究发现，在脂肪酸的代谢过程中，很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因子(例如转录因子)在起全面的调控作用 (Girke，Τ.，Todd, J.，Ruuska, S.，White, J.，Benning，C.，and Ohlrogge，J. . Microarray analysis of developing Arabidopsis seeds. Plant Physiol· 2000，124，1570-158L )。J|3 么通过对这些调控因子的遗传改良达到增加脂肪酸含量的目的将成为可能。目前，通过对拟南芥的研究发现，参与植物脂肪酸代谢的最重要的转录因子是 LECl (Leafy Cotyledon 1)。LECl是拟南芥胚胎发生和种子成熟过程中一个关键的调控因子，同时也对胚胎形成过程中胚胎储存物的积累进行调控(Lotan，Τ.，Ohto, Μ.，Yee, K. Μ. , West, Μ. Α. , Lo, R. , Kwong, R. W. , Yamagishi, K. , Fischer, R. L. , Goldberg, R. B., and Harada, J. J. Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development invegetative cells. Cell. 1998，93，1195-1205.)。过量表达 LECl 可以诱导数目众多的与脂肪酸合成相关基因的表达，包括编码脂肪酸从头合成关键限速酶乙酰辅酶 A羧化酶中三个核基因组编码亚基的基因，与此相吻合，在LECl过量表达植株中主要脂肪
3酸组分的含量大幅度上升(Mu, J.，Tan, H.，Zheng, Q.，Fu, F.，Liang, Y.，Zhang, J.，Yang, X.，Wang, Τ.，Chong, K.，Wang, X. J.，et al. . LEAFY COTYLEDON 1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Physiol.2008，148，1042—1054.)。
发明内容
本发明的一个目的是提供与脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与脂肪酸合成相关的蛋白，名称为GmLEClB，来源于大豆(Glycine max L.)，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。为了使1)中的GmLEClB蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上6XMYC标签(序列为EQKLISEEDL)。上述幻中的GmLEClB蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的GmLEClB的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失或添加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上6XMYC标签的编码序列得到。上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因(命名为GmLEClB基因)也属于本发明的保护范围。所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因为如下1)-6)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2 ；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3的自5’末端起第49-2118位所示；3)其核苷酸序列是序列表中的序列3 ；4)其核苷酸序列是序列表中的序列4 ；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；6)与1)或2)或3)或4)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列3由2118个碱基组成，自5’末端第1-48位碱基为5’_UTR，自5， 末端第49-99位碱基为第一个外显子，自5，末端第100-1491位碱基为第一个内含子，自5， 末端第1492-2118位碱基为第二个外显子。含有上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为在双元载体pERlO的多克隆位点间插入上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因得到重组表达载体。扩增所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围；所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因GmLEClB或基因组DNA转入目的植物中，得到脂肪酸含量高于所述目的植物的转基因植物。所述脂肪酸为:C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0和 C20:l 中的至少一种。上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因GmLEClB是通过上述重组表达载体导入目的植物中的。所述重组表达载体为在双元载体pERlO的多克隆位点间插入所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。上述与脂肪酸合成相关蛋白GmLEClB、编码基因GmLEClB和/或含有编码基因 GmLEClB的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在合成脂肪酸中的应用也属于本发明保护的范围；所述脂肪酸为C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0和C20:l中的
至少一种。携带有本发明编码的GmLEClB基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、 微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。被转化的宿主植物(目的植物)为双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或大豆。本发明获得了与脂肪酸合成相关的基因GmLEClB，并通过转基因实验验证了该基因的功能。实验证明，将本发明保护的基因GmLEClB在拟南芥中过量表达后，可以提高拟南芥幼苗中脂肪酸的含量。这对提高大豆的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
图1为重组表达载体pER10-GmLEClB-6XMYC的图谱。图2为通过RT-PCR检测转基因植株中GmLEClB基因的表达量。图3为通过苏丹红染色指示转基因拟南芥植株体内脂肪酸含量的变化。图4为通过气象色谱-质谱连用仪(GC-MS)测定的脂肪酸各组份的含量。图5为野生型拟南芥植株和转基因拟南芥植株的脂肪酸相对含量。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、基因的发现通过同源序列比对，在大豆中找到拟南芥AtLECl基因的同源基因GmLEClB。在序列比对中发现大豆GmLEClB基因与拟南芥AtLECl基因的保守结构域达到95. 5%的同源性。实施例2、转基因植物的获得及其检测一、转基因植物的获得
1、重组表达载体构建以大豆(Glycine max cultivar Nannongll382)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Liao Y，Zou HF, Wei W, Hao YJ, Tian AG, Huang J, Liu YF, Zhang JS*and Chen SY*. Soybean GmbZIP44, GmbZ IP62 and GmbZIP78 genes function as negative regulator of ABA signaling and conf er salt and freezing tolerance in transgenic Arabidopsis. Planta. 2008,228 :225-240) StJBf 片基因组DNA为模板，用以下引物GmLEClB-F :CCctcgagAACGCCTACTTCATCTCTCTTATA (小写字母为 XhoI 的酶切位点) (序列表中序列5)和GmLEClB-R =GGgaattccTATGGAGCGAGCATTTGGTTCATG (小写字母为 EcoRI 酶切位点) (序列表中序列6)进行PCR扩增，得到的PCR产物连接到中间载体pGEM-TCasy (Promega公司)上，获得重组载体pT-GmLEClB，经测序得到序列表中序列3第1-2118位所示的核苷酸序列。序列表中的序列3由2118个碱基组成，为包含GmLEClB基因的基因组DNA片段。 序列3自5，末端第1-48位碱基为5，-UTR，自5，末端第49-99位碱基为该基因的第一个外显子，自5’末端第100-1491位碱基为该基因的第一个内含子，自5’末端第11492-2118 位碱基为该基因的第二个外显子。序列表中的序列3第49-2118位所示的基因组DNA对应的cDNA编码区的核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列2由678个碱基组成，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的蛋白，将该蛋白命名为GmLEClB。序列表中序列1由2 个氨基酸残基组成。用SmaI和BamHI酶对载体pBA_6xMYC(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该载体的非专利文献是aiou Q，Hare PD, Yang Sff, Zeidler M，Huang LF and Chua NH. FHL is required for full phytochrome A signaling and shares overlapping functions with FHYl.Plant Journal. 2005. 43，356-370.)双酶切得到的小片段插入中间载体PSK(购自默克公司上海办事处)的SmaI和BamHI酶切位点间，得到重组载体pSK-6xMYC。然后用BioI和EcoRI双酶切上述获得的pT-GmLEClB得到的小片段插入pSK-6xMYC的XhoI和EcoRI识别位点间，得到pSK-GmLEClB_6xMYC。然后用XhoI 和XbaI双酶切上述获得的pSK-GmLEClB-6xMYC，得到的小片段与用XhoI和SpeI双酶切双元载体PERlO (公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该载体的非专利文献是 Zuo, J. , Hare, P. D. , and Chua, N. H. Applications of chemical-inducible expression systems in functional genomics and biotechnology.Methods in Molecular Biology-Arabidopsis Protocols, eds. Salinas, J.，and Sanchez-Serrano, J.J.，pp 2006. 329-342. Humana Press, NJ) (pERlO细菌抗性为壮观酶素，转基因植物抗性为卡那酶素)连接，因)(bal和SpeI可产生相同的粘性末端，因此得到最终载体 PER10-GmLEClB-6XMYC,测序验证，结果在pERlO的BioI和SpeI酶切位点间插入了序列4 所示DNA片段，序列4中第1-2118位为GmLEClB基因，第2149-2387位为6xMYC，表明构建的载体构建正确。图1为重组表达载体pER10-GmLEClB-6XMYC结构模式图其中promoter 指启动子；Ter为终止子；NPTII为卡那抗性筛选基因；LexA是细菌抑制子；XVE是LexA细菌抑制子的DNA结合域(X)和单纯疱疹病毒蛋白VP16的反式活化域(V)以及雌激素受体
6的配体结合域(E)构成，PERlO在雌激素的诱导下可以使目的基因在植物体内过量表达，是 35S启动子的3-5倍。2、转基因植物获得将步骤1得到的重组表达载体pER10-GmLECl-6XMYC用电激转化方法转入农杆菌 GV3101(购自^witrogen公司)菌株中。筛选出具有壮观霉素抗性的农杆菌即为阳性转化农杆菌。挑取阳性转化农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含壮观酶素50mg/ L，利福平50mg/L)中J8°C，150rpm振荡培养2天。所获菌液以2 %接种量接菌于含有利福平和壮观酶素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经 5，OOOrpm,20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5%蔗糖和Silwet L-77 (LEHLE SEEDS公司)转化液中，慢慢摇勻。转化液转入250ml烧杯中，将已去掉花和果荚的野生型拟南芥Col-O (公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是:Ren, B.，Liang, Y.，Deng, Y.，Che n, Q.，Zhang, J.，Yang, X.，and Zuo, J. (2009) Genome-wide comparative analysis of type—A Arabidopsis response regulator genes by overexpression studies reveals their diverse roles and regulatory mechanisms in cytokinin signaling. Cell Res. 19 :1178-1190.)倒置于烧杯中，在真空状态保持20秒为宜。将转化后的拟南芥培养得到种子，将得到的拟南芥种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因拟南芥Tl代。从Tl代转基因拟南芥单株上收获种子，播种后获得T2代转基因拟南芥植株的纯合系。同时，用与获得转GmLEClB基因植株相同的方法，得到转空载体对照拟南芥植株；并设未进行任何转基因处理的拟南芥作为野生型对照植株。二、转基因植物的检测1、通过RT-PCR检测GmLEClB基因的表达量T2代转基因的纯合系种子以及野生型对照植株的种子萌发后7天，用10 μ M的雌激素(Sigma公司)处理24h后，参照下面的方法提取RNA，并取1 μ g RNA反转成相应的 cDNA,然后利用引物GmLEClB-F和GmLEClB-R进行RT-PCR检测GmLEClB基因的表达量。利用引物UBQ5-F1和UBQ5-F2扩增UBQ基因作为内标，引物序列如表1。结果如图2所示，Col 代表野生型植株，L42和L43分别代表不同的pER10-GmLEClB-6XMYC转基因株系，从图中可见，与野生型(Col)对照植株相比，转基因植株中GmLEClB基因的表达量显著增加。这两个高表达量的PER10-GmLEClB-6XMYC转基因株系L42和L43，用于下面脂肪酸的检测。转空载体对照拟南芥植株中GmLEClB基因的表达量与野生型对照植株无显著差异。表1引物序列
权利要求
1.一种蛋白，是如下1)或幻的蛋白质1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)-6)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3的自5’末端起第49-2118位所示；3)其核苷酸序列是序列表中的序列3；4)其核苷酸序列是序列表中的序列4；5)在严格条件下与1)或幻或幻或4)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；6)与1)或幻或幻或4)或幻的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中， 得到脂肪酸含量高于所述目的植物的转基因植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入目的植物中。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述重组表达载体为在双元载体 PERlO的多克隆位点间插入权利要求2或3所述的编码基因得到的重组表达载体。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或大豆。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述脂肪酸为C16:0、C18:0、 C18:1、C18:2、C18:3、C20:0 和 C20:l 中的至少一种。
10.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因和/或权利要求4所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在合成脂肪酸中的应用；所述脂肪酸为C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0 和 C20:l 中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了与脂肪酸合成相关的蛋白GmLEC1B及其编码基因与应用。本发明所提供的与脂肪酸合成相关的蛋白，名称为GmLEC1B，来源于大豆(Glycine max L.)，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。将本发明保护的基因GmLEC1B在拟南芥中过量表达后，可以提高拟南芥幼苗中脂肪酸的含量。这对提高大豆的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
文档编号C12N5/10GK102286086SQ20111025244
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者左建儒, 梁岩, 牟金叶 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所