专利名称：一种提取森林土壤和凋落物中微生物总rna的方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种提取微生物总RNA的方法，尤其涉及一种提取森林土壤和凋落物中微生物总RNA的方法。该方法主要适合于科研、教学、环保等部门对森林土壤和凋落物中微生物功能基因转录组学研究过程中，提取样品中的微生物总RNA。
背景技术：
现有技术条件下，95%以上微生物不可培养，这是传统微生物生态学在揭示自然界微生物群落结构、生态功能及其相互关系研究中的最大障碍。随着分子生物学的理论与技术在微生物生态学研究中的不断渗透，直接对环境样品中分离的微生物总DNA进行分析的方法，在一定程度上弥补了传统培养方法所存在的局限性。但是，由于基因表达的时空特异性，复杂环境条件下环境微生物基因特异性表达及其功能并不能通过对微生物DNA的研究得到揭示，而这种信息是生态环境研究中的重要部分。近年来，通过转录组学的方法， 从mRNA水平上研究环境微生物，取得了很大的成功，且获得的结果更准确、可靠。该方法首先通过提取样品中所有微生物的RNA，将其中的mRNA反转录为cDNA，再运用定量PCR、 Northern杂交和cDNA文库构建等下游实验技术研究功能基因的丰度、群落结构和生态功能等。因此，获得高质量的RNA是顺利进行该方法下游实验的最基本前提。森林凋落物的微生物分解直接影响着森林土壤肥力和森林生态系统养分循环过程。对森林凋落物和土壤中微生物群落结构和功能的研究，已成为国际土壤微生物研究领域的热点。但森林凋落物和土壤中含丰富的腐殖酸、多糖、多酚等物质，使提取的微生物总 RNA纯度不高，且环境中广泛存在着RNA酶，RNA易被其降解，给RNA提取带来了许多困难。 有为数不多的商业公司研发了土壤RNA提取试剂盒，但价格昂贵，且对土壤样品选择性较强，尤其是提取森林凋落物中微生物总RNA时，所提的RNA产量低、效果不稳定。而绝大部分通过手提法获得的土壤微生物总RNA产量不高、腐殖酸污染较严重，会干扰下游试验的顺利进行。此外，目前对环境微生物总RNA提取的方法主要针对土壤、堆肥、水和大气等环境样品，尚缺乏针对森林凋落物中微生物总RNA的有效提取方法。因此，开发一种高产量、 高质量的既适合森林土壤又适合森林凋落物中微生物总RNA提取的方法，是进行森林生态系统凋落物微生物分解过程研究的迫切需要。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种提取森林土壤和凋落物中微生物总RNA的方法， 利用该方法提取的微生物总RNA产量高、完整性好、纯度较好。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法，其步骤是A、将实验所用的所有试剂、耗材用0. 1% (ν/ν,以下相同)焦碳酸二乙酯(DEPC) 水浸泡过夜后高压灭菌，若配制的试剂不可高压灭菌，用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水配制，所述的试剂包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液、20% (w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)、6% (w/w)硅藻土、5M异硫氰酸胍(GITC)、聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液、 72% 75% (ν/ν)乙醇和0. 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水等，所述的耗材包括碾钵、碾棒、玻璃珠、离心管、吸头和试剂瓶等。B、采集新鲜森林土壤或森林凋落物样品，剪碎后立即投入液氮中速冻，经冷冻干燥仪冷冻干燥，磨细、混勻，得粉末样品，将粉末样品置于-70°C保存。C、取于_70°C保存的粉末样品0.2 0.5g，加入300 400 μ L0. 焦碳酸二乙酯 (DEPC)处理水，待水渗透样品后，得混合物Α，将混合物A放入-70°C，过夜；D、于经-70°c过夜的混合物A中，分别加入0. 2 0. 5g玻璃珠混合物、100 400μ 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液、20 8(^1^20% (w/w)十二烷基硫酸钠 (SDS)、40 80 μ L 6% (w/w)硅藻土和300 500 μ L酚/氯仿/异戊醇混合液，于涡旋仪上混勻，得混合液B ；其中玻璃珠混合物中0. Imm和0. 5mm直径玻璃珠的质量比为1:1， 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的浓度为5% (w/ w)、磷酸缓冲液的浓度为120mM、氯化钠(NaCl)的浓度为0. 35M、pH值为8. 0 8. 5，酚/氯仿/异戊醇混合液中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25 24 1、ρΗ值为8.0;E、将所得混合液B放入快速核酸提取仪，以4. 5 5. 5m/s的速度裂解细胞30 45s后，于4°C、14000rpm，离心10 15min，得上清液；F、步骤(E)所得的上清液中加入IOOyL 5M异硫氰酸胍(GITC)，混勻，于4°C、 12000 14000rpm，离心5 lOmin，得上清液，并重复该步骤1 3次；G、步骤(E)所得的上清液或步骤(F)所得的上清液中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿/异戊醇混合液中氯仿、异戊醇的体积比为M 1，轻轻混勻，于4°C、 12000 14000rpm，离心lOmin，得上清液；H、步骤(G)所得的上清液中加入2倍体积的聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液，聚乙二醇溶液中聚乙二醇6000 (PEG6000)的浓度为30% 40% (w/w)、氯化钠(NaCl)的浓度为1. 5 2. 0M，充分混勻，室温QO 25°C，以下相同)放置1 2h以沉淀核酸；于4°C、 14000rpm，离心lOmin，弃掉上清液，得核酸沉淀；I、用300 400 μ L预冷的72% 75% (ν/ν)乙醇，分两次清洗步骤(H)所得的核酸沉淀，瞬时离心10 15s，用移液器吸走残留乙醇溶液，于超净工作台中，自然晾干5 IOmin,加50 100 μ L 0. 1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水，溶解，混勻，得DNA/RNA溶液C。J、用琼脂糖凝胶电泳检测DNA/RNA溶液C中DNA和RNA的完整性，用DNA酶消化 DNA/RNA溶液C中的DNA，得RNA溶液D，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA溶液D中RNA的完整性，用核酸蛋白测定仪检测RNA溶液D中RNA的浓度和纯度，并将RNA溶液D保存于-70°C 上述的技术方案中，所述CTAB缓冲液与SDS裂解液体积比的控制是该技术方案的关键之一，CTAB缓冲液同时具有裂解细胞和去除样品中的腐殖质、多糖等物质的功能，在 CTAB缓冲液中加入SDS可增加破坏细胞壁和裂解细胞的能力，提高RNA的产量；当试验样品为森林土壤时，可适当降低CTAB/SDS的比例，即所述步骤⑶中CTAB缓冲液的加入量为 100 300 μ L，SDS的加入量为40 80 μ L ；当试验样品为凋落物时，可适当增加CTAB/SDS 的比例，即所述步骤(D)中CTAB缓冲液的加入量为200 400 μ L，SDS的加入量为20 40 μ L0
上述的技术方案中，所述快速核酸提取仪购自美国MP BIO公司，型号为 FastPrep-24 ；所述步骤(E)中，混合液B放入快速核酸提取仪，以4. 5 5. 5m/s的速度裂解细胞30 45s，可被替换为将混合液B置于转速1500 2000rpm的涡旋仪上，涡旋10 15min。上述的技术方案中，所述步骤(F)中，加入的GITC是一种蛋白质变性剂，多次加入 5M GITC能有效去除蛋白质类物质；根据不同样品，若提取的RNA OD2607280 ^ 1.8，可省去所述步骤(F)，若提取出的RNA OD2607280 < 1. 8，则有必要进行所述步骤(F)。上述的技术方案中，所述步骤(H)中，以PEG6000为沉淀剂，可使核酸与腐殖质类物质有效分离，所提取的RNA的纯度比以乙醇或异丙醇作为沉淀剂有大大提高。上述的技术方案中，所述RNA质量的检测，可按本领域常规方法进行，本发明采用的RNA质量检测方法如下1)取1 3 μ L上述技术方案中步骤⑴所得DNA/RNA溶液C，经1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳检测DNA/RNA溶液C中DNA和RNA的完整性；2)再取适量DNA酶液，加入适量的DNA/RNA溶液C，于37°C水浴保温30 60min， 对DNA/RNA溶液C中的DNA进行消化，得RNA溶液D ；3)取1 3 μ LRNA溶液D，经1. 5 % (w/w)琼脂糖凝胶电泳检测RNA溶液D中RNA 的完整性；4)取1 2 μ LRNA溶液D，用核酸蛋白测定仪测定RNA溶液D中RNA的浓度和纯度；以OD26tl表示RNA浓度，以OD26W表示RNA的蛋白质污染程度，其值> 1. 8表示RNA基本未被蛋白质污染，以(ω·/表示RNA的腐殖质污染程度，其值1. 7 2. 0表示RNA受腐殖质污染较轻。本发明与现有RNA提取技术相比，具有以下优点和效果1)操作方便提取过程简单、易操作；2)效果优良操作过程中RNA不易降解，提取的RNA产量高QO 150μ g/g干样)、纯度较好(0D26(1/28C1值为1. 8 2. OjOD2607230值为1. 5 1. 8)、完整性好，可直接用于反转录、RT-PCR、Northern杂交等后续实验。3)适用范围广适用不同地区、不同来源的森林土壤和森林凋落物中微生物总 RNA的提取，亦可用于提取农田土壤中的微生物总RNA，具有广普适用性；4)经济实用综合成本低，并且能同时提取样品中微生物总DNA和RNA，对于需要同时研究微生物总DNA和RNA的试验，采用该方法，实验操作更省时、经济。
图1为一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法的电泳图。本发明实施例1中从森林土壤中提取的微生物总DNA和RNA的1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳图；1，2，3，4，5分别代表五个小样方所提取的土壤中微生物总DNA和RNA ；M为 D2000 DNA Marker (索莱宝公司)。图2为一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法的电泳图。本发明实施例1中从森林土壤中提取的微生物总RNA的1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳图；M为D2000DNA Marker (索莱宝公司)；Sl代表实施例1中标准样方的土壤中微生物总RNA。图3为一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法的电泳图。本发明实施例2中从森林凋落物中提取的微生物总DNA和RNA的1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳图；6，7，8，9，10分别代表五个小样方所提取的凋落物中微生物总DNA和RNA ； M为D2000 DNA Marker (索莱宝公司)。图4为一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法的电泳图。本发明实施例2中从森林凋落物中提取的微生物总RNA的1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳图；M为D2000DNA Marker (索莱宝公司)；S2代表实例2中标准样方的凋落物中微生物总RNA。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1 一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法(提取马尾松林土壤中微生物总RNA)，其步骤是(1)将实验所用的所有试剂、耗材用0. 1% (ν/ν,以下相同)焦碳酸二乙酯(DEPC) 水浸泡过夜后高压灭菌，若配制的试剂不可高压灭菌，用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水配制，所述的试剂包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液、20% (w/w)十二烷基硫酸钠(SDS),6% (w/w)硅藻土、5M异硫氰酸胍(GITC)、聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液、 72% 75% (ν/ν)乙醇和0. 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水等，所述的耗材包括碾钵、碾棒、玻璃珠、离心管、吸头和试剂瓶等。(2)在马尾松林(针叶林)，选择一个标准样方(20 X 20m)，在标准样方中选择5个小样方(5X5m)，编号分别为1、2、3、4和5，分别采集表土(0 20cm)，混勻，按四分法分取约50g，放入灭菌铝箔包好，立即投入液氮中速冻，带回实验室；经冷冻干燥仪冷冻干燥，去除样品中的水分，经磨细、混勻后，置于-70 V保存。(3)取0. 5g于_70°C保存的土壤样品放入2mL离心管，加入300 μ L 0. 1% DEPC处理水，待水渗透样品后，放入-70°C，过夜；(4)加入 0. 5g 玻璃珠、150 μ L CTAB 缓冲液、80 μ L 20% (w/w) SDS、40 μ L 6% (w/ w)的硅藻土，400yL酚/氯仿/异戊醇(体积比25 24 LpH 8. 0)，于涡旋仪上混勻； 所用的玻璃珠由1 1质量比的0. Imm和0.5mm直径的玻璃珠混合，所用的CTAB缓冲液中含 5% (胃/^)07^、1201111磷酸缓冲液、0. 35M NaCl.pH 8. 0 ；(5)放入快速核酸提取仪，以5. 5m/s的速度裂解细胞40s，4°C、14000rpm，离心 lOmin，转移上清液至另一新的1. 5mL离心管；(6)加入 IOOyL 5M GITC，4 °C、14000rpm，离心 5min，转移上清液至另一新的 1. 5mL离心管，重复该步骤2次；(7)加入等体积氯仿/异戊醇(体积比M 1)，轻轻混勻，4°C、14000rpm,离心 lOmin，转移上清液至另一新的1. 5mL离心管；(8)加入2倍体积的PEG溶液，充分混勻，室温(20 25°C，以下相同)放置2h，4°C、14000rpm，离心 lOmin，弃上清液；所用的 PEG 溶液中含 35 % (w/w)PEG6000 禾口 1. 5M NaCl ；(9)分两次加入400 μ L预冷的75% (ν/ν)乙醇，瞬时离心15s，用移液器吸走残留乙醇溶液，于超净工作台中，自然晾干IOminJn 50yL 0. 1% DEPC处理水，混勻，得DNA/ RNA混合液。(10)从编号为1 5的土壤样品中提取的DNA/RNA混合液分别取1. 5 μ L用1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳检测DNA和RNA的完整性，如图1所示；从编号为1 5的土壤样品中提取的DNA/RNA混合液中各取4 μ L溶液(共20 μ L)，加入5 μ L DNA酶，于37°C水浴保温30min，所得RNA编号为Si，取1. 5 μ L DNA酶消化过的RNA，用1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，如图2所示；另取1. 5 μ L DNA酶消化过的RNA，用核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度和纯度，并将DNA酶消化过的RNA保存于_70°C备用。图1、图2中RNA带型整齐、清晰，无明显降解，说明所提取的RNA完整性好；此外，经核酸蛋白测定仪检测用DNA酶消化过的RNA, OD260为180ng/ μ L，即22. 5 μ g/g干土， 0D26(1/28。值为1. 85，0D26(1/23(1值为1. 64，说明从土壤中提取的RNA浓度高，纯度较好，可用于下游RT-PCR等实验。实施例2 一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法(提取喀斯特常绿落叶阔叶混交林凋落物中微生物总RNA)，其步骤是(1)将所用的所有试剂、耗材用0. 1% (ν/ν,以下相同)DEPC水浸泡过夜后高压灭菌，若配制的试剂不可高压灭菌，用0. 1 % DEPC处理过的水配制，所述的所有试剂为CTAB缓冲液、20% (w/w) SDS,6% (w/w)硅藻土、5M GITC、PEG6000 溶液、72% 75% (ν/ν)乙醇和 0. 1% DEPC处理水等，所述的耗材包括碾钵、碾棒、玻璃珠、离心管、吸头和试剂瓶等。(2)在喀斯特常绿落叶阔叶混交林，选择一个标准样方(20X20m)，在标准样方中选择5个小样方(5X5m)，编号分别为6、7、8、9和10，分别采集凋落物，用剪刀剪碎，混勻， 按四分法分取约50g，放入灭菌铝箔包好，立即投入液氮中速冻；带回实验室，经冷冻干燥仪冷冻干燥，去除样品中的水分，经磨细、混勻后，置于-70 V保存。(3)取0. 2g于_70°C保存的凋落物样品放入2mL离心管，加入400 μ L 0. 1% DEPC 处理水，待水渗透样品后，放入-70°C，过夜；(4)加入 0. 2g 玻璃珠、300 μ L CTAB 缓冲液、30 μ L 20% (w/w) SDS、40 μ L 6% (w/ w)硅藻土，400yL酚/氯仿/异戊醇(体积比25 24 LpH 8. 0)，于涡旋仪上混勻；所用的玻璃珠由1 1质量比的0. Imm和0.5mm直径的玻璃珠混合，所用的CTAB缓冲液中含 5% (胃/^)07^、1201111磷酸缓冲液、0.351 NaCUpH 8.0。(5)放入快速核酸提取仪，以4. 5m/s的速度裂解细胞30s，4°C、14000rpm，离心 15mm，转移上清液至另一新的1. 5mL离心管；(6)加入等体积氯仿/异戊醇(体积比M 1)，轻轻混勻，4°C、14000rpm,离心 lOmin，转移上清液至另一新的1. 5mL离心管；(7)加入2倍体积的PEG溶液，充分混勻，室温放置2h，4°C、14000rpm，离心lOmin， 弃上清液；所用的PEG溶液中含35% (w/w)PEG6000和1. 5M NaCl ；(8)分两次加入400 μ L预冷的75% (ν/ν)乙醇，瞬时离心15s，用移液器吸走残留乙醇溶液，于超净工作台中，自然晾干IOminJn 50yL 0. 1% DEPC处理水，混勻，得DNA/ RNA混合液。(9)从编号为6 10的土壤样品中提取的DNA/RNA混合液分别取1. 5 μ L用1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳检测DNA和RNA的完整性，如图3所示；从编号为6 10的凋落物样品中提取的DNA/RNA混合液中各取4 μ L溶液(共20 μ L)，加入5 μ L DNA酶，于37°C水浴保温30min，所得RNA编号为S2，取1. 5 μ L DNA酶消化过的RNA，经1. 5% (w/w)琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，如图4所示；另取1. 5 μ L DNA酶消化过的RNA，用核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度和纯度，并将DNA酶消化过的RNA保存于_70°C备用。图3、图4中RNA带型整齐、清晰，无明显降解，说明所提取的RNA完整性好；此外， 经核酸蛋白测定仪检测用DNA酶消化过的RNA，OD260为300ng/ μ L，即93. 75 μ g/g干凋落物，0D26(1/28(1值为1. 95，OD2607230值为1. 72，说明从凋落物中提取的RNA浓度高，纯度好，可用于下游RT-PCR等实验。
权利要求
1. 一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法，其步骤是A、将实验所用的所有试剂、耗材用0.1% ν/ν焦碳酸二乙酯水浸泡过夜后高压灭菌，不可高压灭菌的试剂，用0. 1% ν/ν焦碳酸二乙酯处理过的水配制，所述的试剂包括十六烷基三甲基溴化铵缓冲液、20% w/w十二烷基硫酸钠、6% w/w硅藻土、5M异硫氰酸胍、聚乙二醇 6000溶液、72% 75% ν/ν乙醇和0. 1 % ν/ν焦碳酸二乙酯处理水；B、采集森林土壤或森林凋落物样品，剪碎后投入液氮中速冻，经冷冻干燥仪冷冻干燥， 磨细、混勻，得粉末样品，将粉末样品置于-70°C保存；C、取于_70°C保存的粉末样品0.2 0. 5g，加入300 400 μ L0. 1% ν/ν焦碳酸二乙酯处理水，待水渗透样品后，得混合物Α，将混合物A放入-70°C，过夜；D、于经_70°C过夜的混合物A中，分别加入0.2 0. 5g玻璃珠混合物、100 400 μ L 十六烷基三甲基溴化铵缓冲液、20 80 μ L 20% w/w十二烷基硫酸钠、40 80 μ L 6% w/ w硅藻土和300 500 μ L酚/氯仿/异戊醇混合液，于涡旋仪上混勻，得混合液B ；其中玻璃珠混合物中0. Imm和0. 5mm直径玻璃珠的质量比为1 1，十六烷基三甲基溴化铵缓冲液中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为5% w/w、磷酸缓冲液的浓度为120mM、氯化钠的浓度为0. 35M、pH值为8. 0 8. 5，酚/氯仿/异戊醇混合液中酚、氯仿、异戊醇的体积比为 25 24 1、ρΗ 值为 8. 0 ；E、将所得混合液B放入快速核酸提取仪，以4.5 5. 5m/s的速度裂解细胞30 45s 后，于4°C、14000rpm，离心10 15min，得上清液；F、步骤E所得的上清液中加入IOOyL5M异硫氰酸胍，混勻，于4 °C、12000 14000rpm,离心5 lOmin，得上清液，并重复该步骤1 3次；G、步骤E所得的上清液或步骤F所得的上清液中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液， 氯仿/异戊醇混合液中氯仿、异戊醇的体积比为M 1，混勻，于4°C、12000 14000rpm， 离心lOmin，得上清液；H、步骤G所得的上清液中加入2倍体积的聚乙二醇6000溶液，聚乙二醇6000溶液中聚乙二醇6000的浓度为30% 40% w/w、氯化钠的浓度为1. 5 2. OM,混勻，室温放置1 2h以沉淀核酸；于4°C、14000rpm，离心lOmin，弃掉上清液，得核酸沉淀；I、用300 400μ L预冷的72% 75% ν/ν乙醇，分两次清洗步骤H所得的核酸沉淀， 瞬时离心10 15s，用移液器吸走残留乙醇溶液，于超净工作台中，自然晾干5 lOmin，加 50 100 μ L 0. 1 % ν/ν焦碳酸二乙酯处理水，溶解，混勻，得DNA/RNA溶液C ；J、用琼脂糖凝胶电泳检测DNA/RNA溶液C中DNA和RNA的完整性，用DNA酶消化DNA/ RNA溶液C中的DNA，得RNA溶液D，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA溶液D中RNA的完整性，用核酸蛋白测定仪检测RNA溶液D中RNA的浓度和纯度，并将RNA溶液D保存于_70°C备用。
全文摘要
本发明公开了一种提取森林土壤和凋落物中微生物总RNA的方法，其步骤1、冷冻干燥森林土壤或凋落物样品后，磨细、混匀；2、粉末样品中加入焦碳酸二乙酯处理水，-70℃过夜；3、加入玻璃珠、十六烷基三甲基溴化铵缓冲液、十二烷基硫酸钠、硅藻土和酚/氯仿/异戊醇，混匀；4、将混合液剧烈振荡后，离心，得上清液；5、上清液中加入异硫氰酸胍，离心，得上清液；6、上清液中加入氯仿/异戊醇，离心，得上清液；7、上清液中加入聚乙二醇6000，放置，离心，弃掉上清液；8、经洗涤、溶解、DNA酶消化后，得RNA溶液；9、用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度和纯度。利用该方法提取的RNA产量高、完整性好、纯度较好。
文档编号C12N15/10GK102286467SQ20111025199
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者何寻阳, 梁月明, 苏以荣, 陈香碧 申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所