专利名称：MaAQP1蛋白在植物耐逆性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种MaAQPl蛋白在植物耐逆性中的应用。
背景技术：
香蕉前期植株较小，根系浅生，易受旱，其叶面积大，蒸腾量大，早在其发生萎蔫之前，就已表现出缺水现状。尤其是在高温季节，香蕉受到干旱后，叶片失水，相对含水量下降，水分胁迫导致香蕉叶片的细胞质膜透性增大，极大地伤害香蕉正常的生理代谢活动，造成香蕉减产，品质下降等。香蕉栽培生产中，耗水量大，缺水会减少香蕉果实数量且使香蕉变小，挂果期受旱，会影响果实膨大。因此，对香蕉抗逆品种的改良是十分重要而且紧迫的。水是细胞中最基本和重要的成分，细胞通过细胞膜进出水分，专门的膜通道促进了水分进出分子膜的效率。1988年，Peter Agre等在分离人红细胞中1 蛋白时，在红细胞膜上发现了一个^kD的跨膜多肽，这种多肽非常丰富，分布广泛，也见于人类肾脏、大脑和植物体中。Peter Agre等证明该蛋白只能让水通过，称为CHIP^ (通道形成完整膜蛋白， Channel-forming intagral membrane protein) M 而 it.flfM^J 并 7^ + !,^;, 其原因在于大多数高等植物体内并不存在像肾脏一样的器官或位点来转运水分，且生物膜本身的透性也足以满足植物细胞内的水分运动。但随着一些技术的进步，1993年，Maurel 等经爪蟾卵母细胞异源表达系统第一次分离出拟南芥液泡膜上的水通道蛋白TIP，基于其专一的水转运功能，采用了 aquaporin (水通道蛋白或水孔蛋白)一词。CHIP^也于1997 年被基因组命名委员会命名为AQP1。随后，在许多动植物及微生物中相继发现的类似的专一性运输水的通道蛋白被统称为水通道蛋白(aquaporins，AQPs)。除了水，水通道蛋白还能使小分子如甘油，尿素以及一些离子在膜上进行渗透。在植物中，许多水通道蛋白已经被识别和研究。大多数水通道蛋白在受到环境胁迫如干旱等时被诱导表达，并且分布在各种组织和器官中，存在于生长发育的各个时期，揭示了它们在整个生命活动中具有重要的作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物方法。本发明提供的方法，为将MaAQPl蛋白的编码基因导入目的植物，获得具有如下 1)-3)中至少一种特征的转基因植物1)所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；2)所述转基因植物的根长大于所述目的植物；3)所述转基因植物的根的根毛数目大于所述目的植物；所述MaAQPl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述MaAQPl蛋白的编码基因的核苷酸序列为如下1)或2):1)序列表中的序列1;2)序列表中序列1自5’末端第1-855位核苷酸。
所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。所述耐盐性通过增加根长和/或提高存活率体现；所述耐旱性通过增加根长、降低失水率和/或提高存活率体现。所述根为主根；所述MaAQPl蛋白的编码基因通过表达载体导入所述目的植物。所述表达载体为将所述MaAQPl蛋白的编码基因插入pCAMBIA1304的NcoI和SpeI 酶切位点间，得到的表达MaAQPl蛋白的载体。所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物。所述双子叶植物为拟南芥。本发明的另一个目的是提供一种表达载体。本发明提供的表达载体，具体为将所述MaAQPl蛋白的编码基因插入pCAMBIA1304 的NcoI和SpeI酶切位点间中，得到的表达MaAQPl蛋白的载体；所述MaAQPl蛋白的编码基因为序列表中的序列1。所述MaAQPl蛋白、所述MaAQPl蛋白的编码基因和/或所述的表达载体在植物育种中的应用也是本发明保护的范围；或所述MaAQPl蛋白或所述MaAQPl蛋白的编码基因在培育耐逆性植物中的应用； 所述植物为拟南芥；所述耐逆性为为耐盐性和/或耐旱性也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明将香蕉果实(Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian)的MaAQPl基因，导入野生型拟南芥中，得到转基因植物，转基因植物在高盐和/或干旱胁迫条件下根长、存活率均高于野生型拟南芥，为植物育种奠定了基础，从而解决香蕉抗逆方面所面临的问题。
图1为MaAQPl转基因株系的PCR检测图2为各株系的Southern blot检测图3为生长15天的野生型和转基因型图4为生长15天的野生型和转基因型的根长统计图5为野生型和转基因植株4-7天主根生长速率图6为显微镜下生长4天野生型和转基因株系的根毛形态图7为生长4天的野生型和转基因型的根毛统计图8为不同浓度NaCl对野生型、L16和L13根系生长的影响
图9为MaAQPl转基因植株的抗盐性图10为野生型和MaAQPl转基因植株在盐胁迫下的存活率图11为野生型、L16和L13对不同浓度甘露醇的耐受性图12为不同浓度甘露醇对野生型、L16和L13根长的影响图13为MaAQPl过表达植株的抗旱性图14为野生型和MaAQPl转基因植株在干旱胁迫下的存活率图15为野生型和MaAQPl转基因植株的叶片失水率测定图16为转基因拟南芥MaAQPl在干旱胁迫下的表达
图17为转基因拟南芥MaAQPl在Nacl胁迫下的表达
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、转MaAQPl基因拟南芥的获得一、MaAQPl基因的发现从香蕉果实成熟早期阶段的抑制差减杂交文库(SSH)中获得一个属于水通道蛋白家族基因的cDNA片段，并用RACE技术在香蕉果实中克隆到了该水通道蛋白基因的全长， 命名为MaAQPl，其核苷酸序列为序列表中的序列1。二、MaAQPl植物表达载体的构建以植物表达载体pCAMBIA1304为基础构建MaAQPl基因的表达载体，具体如下提取香舊果实(Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian)(巴西舊)的 RNA， 反转录得到 cDNA，以 ATGGAAGGGA AAGAGGAAG 和TCTCTCAGGGCCTGCTCTTG 为引物，进行 PCR 扩增，得到PCR产物。将得到的PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列1 自5’末端第1-855位核苷酸，其基因即为MaAQPl，其编码的蛋白的氨基酸的序列为序列表中的序列2，该蛋白命名为MaAQPl。序列表中的序列1由865个核苷酸组成，序列表中的序列2由286个氨基酸组成。将上述PCR产物用NcoI和SpeI酶切，得到酶切产物，将酶切产物与经过同样酶切的植物表达载体pCAMBIA1304(周雪莉，王园，刘菊华，金志强，迟光红，徐碧玉。香蕉 MuMADSI基因表达产物的亚细胞定位，生命科学研究，2009，13 (5) :418-421。公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得。)进行连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，结果为，该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第 1-855位核苷酸插入pCAMBIA1304的NcoI和SpeI酶切位点之间得到的载体，将该质粒命名为pCAMBIA1304-MaAQPl，序列1自5’末端第1-855位核苷酸插入的是35S启动子后nos 终止子前的多克隆位点间。三、重组农杆菌的获得将上述获得的pCAMBIA1304-MaAQPl导入根癌农杆菌C58 (盛长忠、王淑芳、张心平、王勇、田俊英，土壤农杆菌C58遗传转化东北红豆杉的初步研究，南开大学学报(自然科学)，1999，32(4) :27-32。公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得。)中， 得到重组菌，提取重组菌的质粒，送去测序，结果为该质粒为pCAMBIA1304-MaAQPl，将含有该质粒的农杆菌命名为C58/pCAMBIA1304-MaAQPl。四、转MaAQPl拟南芥的获得1、拟南芥的培养Sf^MMlt^f (Arabidopsis thaiiana, Columbia ecotype) 1 g Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio university, Ohio state, USA))禾中子撒播在花钵中， 并在表面铺一层细砂，将其放置在4°C，湿润、黑暗条件下春化处理3天，保湿待种子萌发。 拟南芥在本实验室人工气候箱中的培养房中培养。以蛭石为基质，温度控制在23°C，营养生
5长期每日光照时间为8h，生殖生长期每日为光照为16h，光照强度为20001χ，培养室相对湿度为80%。当幼苗长出真叶后，可进行移植。移栽后保湿一星期左右，直至幼苗长出新叶。每隔4d浇适量的拟南芥营养液，待花苔长至5cm及侧苔抽出时，可用于转化，即为受体拟南芥。2.农杆菌介导的浸泡法转化拟南芥将上述获得的C58/pCAMBIA1304-MaAQPl，加到含有Kan和Rif抗生素的LB培养基中，28°C振荡10h，加入拟南芥转基因浸润液(l/2MS，50g/L Sucrose)中，将受体拟南芥倒置浸染到菌液中，采用花序浸染法进行转化，得到3420个TO代转MaAQPl拟南芥种子。3、拟南芥的抗性筛选将TO代转MaAQPl拟南芥的种子以75%乙醇+0.02% Triton XlOO溶液浸泡 IOmin,移除乙醇溶液，重复3次，将种子吹打到无菌滤纸上，风干；将晾干的种子撒播在选择培养基(1/2MS, 1. 5% Sucrose, 0. 7% Agra, 25 μ g/mL hygromycin B)上；4°C黑暗处理3d 后转移到培养房中，在23°C条件下生长，IOd后选择能正常生长的幼苗移栽到花钵中，得到 35株Tl代转MaAQPl拟南芥，计算Tl代种子中能正常生长的幼苗和致死幼苗的比例，即为 1 80。从收获Tl代转MaAQPl拟南芥收获种子，播种，得到T2代转MaAQPl拟南芥。4.转基因拟南芥T3代纯合系培养选择T2代分离比符合3 1的幼苗移栽到培养基质中，保湿一星期后每隔5天以适量的 1/2 的拟南芥营养液 OM KNO3, 2M Ca (NO3)2，2M MaSO4. 7H20, IM NH4NO3, IM KH2PO4, 0. 02M FeSO4. 7Η20，0· 02Μ Na2EDTA,0. 05Μ H3BO3,0. OlM MnCl2. 4Η20，0· OlM Na2MOO4)浇灌，待其长大，收获种子进行后续实验分析，得到四株Τ3代转MaAQPl拟南芥。5、Τ3代转MaAQPl拟南芥的分子检测设计3对引物分别验证转基因株系(1)能够扩增MaAQPl开放阅读框内cDNA序列与pCAMBIA1304中一段序列的引物 (AtAQP 1) (PI :CCTTGTCCACCTGGCTAC ；P2 TCTCTCAGGGCCTGCTCTTG ；)(2)能够扩增表达载体上GFP部分序列的引物(AtGFP) (PI :ATGTGTAATCCCAGCAGC ； P2 CAAGGAGGACGGAAACAT)；(3)能够扩增GFP及插入MaAQPl开放阅读框序列的引物(GFP) (Pl CAGTTGCGCAGCCTGAATG P2 TTGGCCACGGAACAGGTAGT)。DMaAQPl转基因拟南芥的PCR检测提取各株系T3代转MaAQPl拟南芥叶片基因组DNA，以AtAQPl为引物对进行PCR 扩增，以野生型拟南芥为阴性对照，以pCAMBIA1304-MaAQPl为阳性对照。结果如图1所示， 其中，L1-L12均为T3代转MaAQPl拟南芥，WT为野生型拟南芥，得到3(^bp的为阳性T3代转MaAQPl拟南芥，得到四株阳性T3代转MaAQPl拟南芥。2)MMaAQPl转基因拟南芥的Southern blot检测分别提取编号为L13，L16，L6，L8，L1-5的阳性T3代转MaAQPl拟南芥的叶片的全基因组DNA进行Southern印迹检测，经MaAQPl基因特异探针(以pCAMBIA1304_MaAQPl 质粒为模板，以AtGFP为引物进行扩增得到的产物)杂交、显色，以野生型拟南芥为对照，结果如图2所示，CK为阳性对照pCAMBIA1304-MaAQPl，WT为野生型拟南芥，可以看出，编号为 L13，L16，L6，L8，L1-5的阳性T3代转MaAQPl拟南芥均有目的片段，但是大小不一，可能是在转基因植株中既包括多拷贝插入的，也包括单拷贝插入的。采用相同的方法，将空载体PCAMBIA1304导入野生型拟南芥中，得到TO代转空载体拟南芥，传代，直到得到T3代转空载体拟南芥。提取T3代转空载体拟南芥的DNA，用 AtAQPl作为引物，进行PCR扩增，未得到目的片段，说明其为T3代转空载体拟南芥。实施例2、转MaAQPl基因拟南芥的功能研究一、根的生长特性将野生型拟南芥(WT)、编号为L13，L16，L6，L8，L1-5的阳性T3代转MaAQPl拟南芥种子播撒在MS培养基中并垂直培养，在23°C，》i光照、1 黑暗的条件下生长。以T3代转空载体拟南芥为对照。每个株系50株，实验重复三次，结果取平均值。15d后观察各株系和野生型的外部性状如图3所示，其中，A为野生型拟南芥和编号为L13，L16，L6，L8，L1-5的阳性T3代转MaAQPl拟南芥主根差异，B为野生型拟南芥和阳性T3代转MaAQPl拟南芥阳性T3代转MaAQPl拟南芥(转基因型)侧根差异；各转基因株系的主根均要比野生型的长，且转基因株系除了主根外，基本上不长其他的侧根，而野生型则均长有主根以及侧根。同时在15d后统计具体的根长(以主根记)，如图4所示，从图中看出，WT 的根长为 3. 2cm, L13, L16, L6，L8，L1-5 的根长分别为 4. 48cm, 5. 28cm, 6. 10cm, 5. 55cm, 5. 40cm,可以看出，转基因拟南芥的根长比野生型的长2-3cm左右。在生长的15天内，观察主根长度及其生长速度(生长速度=Ln-Ln-l/t η为天数， t = 24h)的变化，结果如图5所示，WT 在生长 4、5、6、7、8、9、10 天的根长为 5. 09mm、7mm、10· 5mm、14. 5mm、18. 9mm、 23. 6mm>28. Imm ；L13 在生长 4、5、6、7、8、9、10 天的根长为 5. 29mm、7. 5mm、11. 3mm、15. 6mm、20. 4mm、
25.4mm、30. 6mm ；L16 在生长 4、5、6、7、8、9、10 天的根长为 5. 16mm、7. 9mm、12. 3mm、16. 6mm、21. 6mm、 27. lmm>32. 5mm ；L6 在生长 4、5、6、7、8、9、10 天的根长为 5. 16mm、8. lmm、12. 2mm、16. 8mm、21. 7mm、
26.9mm、32. 3mm ；L8 在生长 4、5、6、7、8、9、10 天的根长为 5. 13mm、8mm、12· 1mm、16. 4mm、21. 4mm、 26. 6mm、32. 4mm ；Ll-5 在生长 4、5、6、7、8、9、10 天的根长为 4. 88mm、8mm、12mm、16. 5mm、21. 6mm、 26. 9mm、32. 2mm ；WT 在生长 5、6、7、8、9、10 天的根长增长速率为 0. 07mm/h、0. 15mm/h、0. 165mm/h、 0. 18mm/h、0. 2mm/h、0. 19mm/h ；L13 在生长 5、6、7、8、9、10 天的根长增长速率为 0. 09mm/h、0. 16mm/h、0. 18mm/h、 0. 19mm/h、0. 21mm/h、0. 22mm/h ；L16 在生长 5、6、7、8、9、10 天的根长增长速率为 0. llmm/h、0. 18mm/h、0. 18mm/h、 0. 21mm/h、0. 23mm/h、0. 22mm/h ；
L6 在生长 5、6、7、8、9、10 天的根长增长速率为 0. 13mm/h、0. 17mm/h、0. 19mm/h、 0. 2mm/h、0. 22mm/h、0. 22mm/h ；L8 在生长 5、6、7、8、9、10 天的根长增长速率为 0. 12mm/h、0. 17mm/h、0. 18mm/h、 0. 21mm/h、0. 22mm/h、0. 24mm/h ；Ll-5 在生长 5、6、7、8、9、10 天的根长增长速率为 0. 13mm/h、0. 17mm/h、0. 19mm/h、 0. 21mm/h、0. 22mm/h、0. 22mm/h ；可以看出，从培养第5d开始，转基因株系和野生型的根长开始出现差距，直到第 10d，野生型的根长约为2. 7cm，而转基因株系根长则达到3-3. 3cm左右。为进一步观察转基因株系和野生型之间根部的差异，在生长第4d后于显微镜下观察根毛的生长状况，结果如图6所示，解剖镜下40X物镜观察，转基因株系(编号为L13 阳性T3代转MaAQPl拟南芥)的根毛与野生型(WT)的相比，在根的伸长区部位，根毛较多而且密集。并统计生长4天的野生型和转基因型的主根根毛数目统计，结果如图7所示，WT、 编号为L13，L16，L6，L8，L1-5的阳性T3代转MaAQPl拟南芥在生长4天的根毛数目为31、 41、51、52、50、45 ；可以看出，各转基因株系的根毛是野生型的1.5倍左右。T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。二、转MaAQPl拟南芥耐逆性鉴定1)L16、L13 对 NaCl 的抗性测试野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转MaAQPl拟南芥的种子分别播撒在含0、50、100、150、200mM NaCl 的培养基(1/2MS, 1. 5% Sucrose, 0. 7% Agra,PH 5. 7) 上培养(23°C，8小时光照)15天，每个株系的种子为50粒，实验重复三次，结果取平均值。 以T3代转空载体拟南芥为对照。统计各株系根长(主根)状况如图8所示，訂在含0、50、100、150、2001111 NaCl的培养基的根长(主根)分别为3、2· 5、2· 3、 0. 8、0cm ；L16在含0、50、100、150、200mM NaCl的培养基的根长(主根)分别为4. 1、3. 8、 3. 5、2· 5、0. 8cm ；1^13在含0、50、100、150、2001111 NaCl 的培养基的根长(主根)分别为 3· 9、3· 5、3、 2. 1、0. 7cm ；可以看出，在培养基中NaCl的浓度为50mM和IOOmM时，各株系的生长均未受到显著影响。当NaCl浓度达到150mM时，野生型和MaAQPl转基因植株开始表现出不同的生长状况，野生型和L16和L13的根部均变短，但是野生型的根部变化幅度要比L16和L13的变化幅度大，且子叶变小，L16和L13均有4片子叶，而野生型的仅有两片子叶。而在200mM NaCl的培养基中生长15d时，野生型种子只伸出很短的胚根，而MaAQPl转基因籽苗根长达至Ij 0. 5cm。将生长4周的野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转MaAQPl拟南芥用含 350mM NaCl 的营养液(2M KNO3, 2M Ca (NO3) 2，2M MaSO4. 7H20, IM NH4NO3, IM KH2PO4, 0. 02M FeSO4. 7Η20，0· 02Μ Na2EDTA, 0. 05Μ H3BO3,0. OlM MnCl2. 4Η20，0· OlM Na2MOO4)浇灌 15d 后，野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转MaAQPl拟南芥，以正常处理(用不含350mM NaCl的营养液浇灌)的植株作为对照。观察各株系生长状况如图9所示，正常处理(用不含350mM NaCl的营养液浇灌) 的各植株生长无显著差异。含350mM NaCl处理后，野生型拟南芥(WT)的叶片几乎全部由黄转绿，而L16和L13则仍保持较强生命力。其中L16部分植株的叶片边缘变黄，部分叶片开始出现萎蔫现象，L13的生长则没有受到明显的影响。统计存活率，结果如图10所示，正常处理(对照)下，野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转MaAQPl 拟南芥的存活率分别为100%、100%、100% ；350mM NaCl处理15d后，野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转 MaAQPl拟南芥的存活率分别为58%、81%、92% ；可以看出，用NaCl处理15d后，野生型的存活率已降至58%，而L16和L13的存活率则分别保持在83%和91%，证明MaAQPl转基因植株比野生型具有更强的耐盐能力。T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。2)L16、L13对对干旱的耐受性野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转MaAQPl拟南芥的种子分别播撒在含0、100、200、300mM甘露醇(模拟干旱)的MS培养基中培养(23°C，8小时光照)15d， 观察表型如图11所示，可以看出，在含各种浓度的甘露醇中，野生型和转基因株系的子叶变小，且基本上只有两片子叶，而对照组均有四片子叶。每个株系的种子为50粒，实验重复三次，结果取平均值。以T3代转空载体拟南芥为对照。统计根长(主根长度)，结果如图12所示，WT 在含 0、100、200、300mM 甘露醇中根长为 3. 2,2. 3,1. 6,1. Icm ；L16 在含 0、100、200、300mM 甘露醇中根长为 5. 2,4. 1,3. 6,3. Ocm ；L13 在含 0、100、200、300mM 甘露醇中根长为 4. 4,3. 6,3. 0,2. 5cm ；可以看出，在含IOOmM甘露醇的培养基中，野生型和L16、L13的转基因株系的根部并无太大变化，随着甘露醇浓度的增加，各株系的根部均有所变短，且野生型和转基因株系根部的长度差异越来越大。当甘露醇的浓度增加到200mM时，野生型的根部只有1. 6cm左右长度，而转基因株系根部仍有2. 9cm左右的长度。随着甘露醇浓度的升高，野生型和各转基因株系根长均有所减少，但是野生型的根长减少幅度要比转基因的大，表明了在甘露醇的胁迫下，MaAQPl转基因株系比野生型具有更强的耐旱性。将在蛭石中生长4周的野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转 MaAQPl拟南芥进行控水处理(处理方法是停止浇水)20天后，以正常浇水为对照，每个株系的种子为50粒，实验重复三次，结果取平均值。以T3代转空载体拟南芥为对照。观察表型，结果如图13所示，可以看出，正常浇水各株系植物生长无显著差异。而控水处理后，野生型叶片已经全部失绿，干枯死亡；而L16和L13的部分叶片边缘虽然开始变黄，但还保持较强生命力。在控水处理20天后统计存活率，如图14所示，WT、L16和L13在控水处理20天后的存活率分别为16%、88%和87%，证明MaAQPl转基因植株比野生型具有更强的抗旱能力。在控水处理20天后检测叶片的失水率(方法选取23°C，8h光照，16h黑暗条件下生长4周的各株系健康植株，摘取相同部位的叶片各30片，每隔30min测定其鲜重；失水率=(Mn-Mn-30)/MnM为叶片重量，η为称样时间(min))，结果如图15所示，WT 在叶片摘离植株 30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min 的失水率分别为 5%、12%、17%、21%、25%、30%、33%、35%、38%、41% ；L16 在叶片摘离植株 30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min 的失水率分别为 6%、10%、15%、17%、21%、25%、27%、30%、32%、34% ；L13 在叶片摘离植株 30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min 的失水率分别为 4%,8%,12%,15%,17%,21%,22%,25%,27%,33% ；可以看出，在叶片摘离植株30min之内，野生型和转基因植株的失水率几乎一致。 随着时间的延长，野生型和L16，L13植株的失水速率逐渐增大，但野生型的失水幅度要较转基因型大，而L13较L16缓慢。直至第270min，野生型叶片的失水率达到38. 2%，而1^13 的失水率为27. 2%, L16的叶片失水率为32. 5%，直至第300min达到34. 3%，此时L13与 L16的叶片失水率基本达到一致。说明MaAQPl转基因植株叶片的保水能力较野生型强。T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。三、MaAQPl在转基因拟南芥中的表达(各种处理条件下的表达)1、转基因株系在干旱胁迫下MaAQPl的表达将生长15天的野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转MaAQPl拟南芥干旱胁迫(将生长15天的拟南芥放置于干燥的滤纸上)，分别在胁迫0、2、4、他提取各株系RNA，反转录得到cDNA做为模板，以AtAQPl为引物(PI :CCTTGTCCACCTGGCTAC ； P2 :GCATCACCTTCACCCTCT)，进行qPCR检测，以act in为内参，内参的引物为Pl CGGTGCCTTTGCTCTGT ；P2 :CTTCTTTCCGCTCGCTT ；每个株系的种子为50粒，实验重复三次，结果取平均值。结果如图16所示，可以看出，干旱胁迫浊时，在L16和L13中，MaAQPl的表达受到高度诱导，其表达量分别为59. 2和65，而随着干旱胁迫时间的增加，转基因植株中基因的表达量均呈现下调趋势。野生型拟南芥MaAQPl的表达量为0。2、转基因株系在盐胁迫下MaAAPl的表达用Nacl胁迫(将生长15天的拟南芥放置于泡于IOml各浓度Nacl溶液的滤纸上)野生型拟南芥(WT)、编号为L16和L13的阳性T3代转MaAQPl拟南芥0h、2h、6h、IOh; 每个株系的种子为50粒，实验重复三次，结果取平均值。结果如图17所示，L16和L13两个转基因株系的表达量呈现先升后降的趋势，在 Nacl胁迫Mi时，L16和L13中MaAQPl的表达被高度诱导，表达量分别为25. 1和33. 3。在 Nacl胁迫池和IOh时，L13中MaAQPl的表达量基本一致。野生型拟南芥MaAQPl的表达量为0。
10
权利要求
1.一种培育转基因植物方法，为将MaAQPl蛋白的编码基因导入目的植物，获得具有如下1)-3)中至少一种特征的转基因植物1)所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；2)所述转基因植物的根长大于所述目的植物；3)所述转基因植物的根的根毛数目大于所述目的植物；所述MaAQPl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述MaAQPl蛋白的编码基因的核苷酸序列为如下1)或2):1)序列表中的序列1；2)序列表中序列1自5’末端第1-855位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述耐盐性通过增加根长和/或提高存活率体现；所述耐旱性通过增加根长、降低失水率和/或提高存活率体现。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述根为主根；所述MaAQPl蛋白的编码基因通过表达载体导入所述目的植物。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述表达载体为将所述MaAQPl蛋白的编码基因插入PCAMBIA1304中，得到的表达MaAQPl蛋白的载体。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述双子叶植物为拟南芥。
9.一种表达载体，为将所述MaAQPl蛋白的编码基因插入pCAMBIA1304中，得到的表达 MaAQPl蛋白的载体；所述MaAQPl蛋白的编码基因为序列表中的序列1。
10.所述MaAQPl蛋白、所述MaAQPl蛋白的编码基因和/或权利要求9所述的表达载体在植物育种中的应用；或所述MaAQPl蛋白或所述MaAQPl蛋白的编码基因在培育耐逆性植物中的应用；所述植物为拟南芥；所述耐逆性为为耐盐性和/或耐旱性。
全文摘要
本发明公开了一种MaAQP1蛋白在植物抗逆中的应用。本发明提供了一种培育转基因植物方法，为将MaAQP1蛋白的编码基因导入目的植物，获得具有如下1)-3)中至少一种特征的转基因植物1)所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；2)所述转基因植物的根长大于所述目的植物；3)所述转基因植物的主根根毛数目大于所述目的植物；所述MaAQP1蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明将香蕉果实的MaAQP1基因，导入野生型拟南芥中，得到耐逆性高的转基因植物，为植物育种奠定了基础。
文档编号C12N15/29GK102304521SQ20111025195
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者刘菊华, 张建斌, 徐碧玉, 许奕, 贾彩红, 金志强 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所