专利名称：一种疱疹病毒ⅰ型pcr荧光定量快速检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒及方法。
背景技术：
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)属于疱疹病毒科α病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。人类单纯疱疹病毒分为两型，即单纯疱疹病毒I型(HSV-I)和单纯疱疹病毒II型(HSV-II)。I型主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。HSV-I与HSV-II容易发生交叉性感染。单纯疱疹病毒感染是由于人与人的接触。从发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的50-90 %，是最易侵犯人的一种病毒，可引起口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹、卡波西病等，有时也是脑膜炎、 脑炎的病因。口唇部疱疹一般较易诊断，同时因日晒、发热等种种的刺激因素而引起复发。单纯疱疹病毒侵入宿主细胞后，病毒DNA进入细胞核内复制，与此同时，病毒DNA 转录物进入胞质，指导病毒结构蛋白在细胞质内的合成；随后，子代病毒DNA回到胞质内装配为具有感染性的成熟病毒颗粒。单纯疱疹病毒入侵后，可在入侵局部造成感染；但一般情况下，病毒沿该局部的神经末梢上行，传入至神经节内，经2 3天短暂时间的复制后，病毒进入潜伏感染状态健康搜索。在适当条件下，单纯疱疹病毒可被激活而大量复制，再沿该神经节的神经分支下行播散到外周支配区域组织的细胞内，导致疱疹发作。局部感染较重时， 病毒可沿淋巴管上行扩散导致淋巴结炎；在机体免疫功能低下时，可形成病毒血症，发生全身播散性感染。其感染的重要特点是，病毒可长期潜伏于体内，其间可因受激惹而反复发作。目前，HSV常用的检查有培养法、PCR试验、血清学检查及其他抗原试验等多种选择。培养法仅能检查症状的患者，在检查无症状患者样本时，其敏感度仅有20% 50%，这使得80%以上的HSV感染者直接被漏检。同时培养法也非常耗时，且需要专门的设备。由于以上问题和具有很高的特异性，培养法一般用于HSV的确诊和法医学鉴定。在细胞学检查中，可检出HSV感染特征性的多核巨细胞内的嗜酸性包涵体，但不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60%。另外，免疫酶方法(ELISA)是一种将抗原的特异性和酶的生物学放大作用有机结合在一起的特异而敏感的免疫学检测方法， 但在快速和定量检测自动化上仍有较多工作做。免疫荧光法(IFA)在检查无症状患者样本时，其敏感度可达到35% 70%，且可以在几个小时内出报告。但该方法目前的主要问题是其结果判断的经验依赖性较高。乳胶凝集试验(LA)是将特异性的抗体与乳胶颗粒结合成复合物，当有HSMg存在时，就会形成抗原-抗体-胶乳聚合物，出现肉眼可见的凝集.问题是敏感性较差。随着分子生物学的发展，转录介导的扩增试验、酶放大免疫反应、半巢式PCR-微空板杂交法、巢式PCR、实时荧光PCR定量检测等方法都在应用，提高了检测的准确性和敏感性，为临床提供了无创、灵敏、快速的检测手段，可用于筛查试验。
发明内容
本发明目的是提供一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，检测临床样品中单纯疱疹病毒I型特有的核酸序列，从而达到快速判断单纯疱疹病毒I型存在的目的。为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括DNA提取液，PCR反应液，DNA聚合酶，阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品，定量参比品，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物上游引物5，-GAGACGCTGATGAAGCGCGAACTGA-3，；下游引物5，-ATAGTGCCACGCCCACCACGTTCGAGCT-3，；荧光探针5，-FAM-TGACGAGGCCGCAGCTCACCAAG-TAMRA-3，。作为本发明的进一步设置，本发明试剂盒引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针、引物和内参DNA，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，所述内参照系统包括上游引物序列SEQ ID NO. 5、下游引物序列SEQ ID NO. 6和探针序列SEQ ID NO. 7。作为本发明的进一步设置，所述阳性质控品浓度为10倍梯度IO6Copies/ mL-IO7Cop ies/mL，所述弱阳性质控品浓度为 103cop ies/mL-104cop ies/mL。作为本发明的进一步设置，所述DNA聚合酶包括tap酶、UNG酶。本发明的另一种技术方案为提供一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测方法， 其中PCR扩增的靶序列为SEQ ID NO. 4，PCR扩增所用引物为上游引物序列如SEQ ID NO. 1，下游引物序列如=SEQ ID N0. 2，荧光探针序列如=SEQ ID N0. 3。作为本发明的进一步设置，所述荧光探针5，端标记FAM荧光基团，3，端标记TAMRA 淬灭基团。本发明的有益效果为填补了国内临床检测单纯疱疹病毒I型(HSVI)的荧光PCR 试剂盒的空白。而且本发明检测单纯疱疹病毒I型(HSVI)利用了 Taqman核心技术平台， 具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。使用了拟南芥内参照系统，它在单纯疱疹病毒I型基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。
图1 灵敏度参比品检测结果图；图2 标准曲线Ie4_le7参比品检测结果图；图 3 标准曲线 Ie4_le7 ；图4 =HSVl特异性结果图。
具体实施例方式单纯疱疹病毒I型检测试剂盒是采用聚合酶链式反应(PCR)及荧光标记探针技术，检测临床样品中单纯疱疹病毒I型特有的核酸序列，从而达到快速判断单纯疱疹病毒I 型存在的目的。
通过对已知的单纯疱疹病毒基因组序列进行比较分析，选择高度保守的区段，设计引物和探针。其中最优引物、探针序列组合如下上游引物5，-GAGACGCTGATGAAGCGCGAACTGA-3，；下游引物5，-ATAGTGCCACGCCCACCACGTTCGAGCT-3，；荧光探针5，-FAM-TGACGAGGCCGCAGCTCACCAAG-TAMRA-3，；靶序列扩增片段如下(5 ‘ -3')GAGACGCTGATGAAGCGCGAACTGACGAGCTTTGTGGTGCTGGTTCCCCAGGGAACCCCCGACGTTCA GTTGCGCCTGACGAGGCCGCAGCTCACCAAGGTCCTTAACGCGACCGGGGCCGATAGTGCCACGCCCACCACGTTC GAGCT。本试剂盒的内参照(Sue)引物上游引物序列SEQ ID NO. 5、下游引物序列SEQ ID NO. 6和探针序列=SEQ ID NO. 7，具体如下上游引物5‘ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3 ‘荧光探针5' -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3'。实施例1表1 试剂盒组成
组成成份规格和数量主要成分DNA提取液1200 μ 1/管NaOH, Tris-HCK ΝΡ40权利要求
1.一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物上游引物5，-GAGACGCTGATGAAGCGCGAACTGA-3，； 下游引物5’ -ATAGTGCCACGCCCACCACGTTCGAGCT-3，； 荧光探针5，-FAM-TGACGAGGCCGCAGCTCACCAAG-TAMRA-3，。
2.按权利要求1所述的疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取液，PCR反应液，DNA聚合酶，阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品，定量参比品。
3.按权利要求1所述的疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性的内参照系统包括内参探针、引物和内参DNA，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，所述内参照系统包括上游引物序列SEQ ID NO. 5、下游引物序列=SEQ ID NO. 6和探针序列=SEQ ID NO. 7。
4.按权利要求1所述的疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品浓度为10倍梯度106COpies/mL-107COpies/mL，所述弱阳性质控品浓度为 103copies/mL-104copies/mLo
5.按权利要求1所述的疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，所述 DNA聚合酶包括tap酶、UNG酶。
6.一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测方法，其特征在于，其中PCR扩增的靶序列为SEQ ID NO. 4，PCR扩增所用引物为上游引物序列如=SEQ ID NO. 1，下游引物序列如 SEQ ID NO. 2，荧光探针序列如=SEQ ID NO. 3。
7.按权利要求6所述的疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测方法，其特征在于，所述荧光探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。
全文摘要
本发明目的是提供一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，检测临床样品中单纯疱疹病毒I型特有的核酸序列，从而达到快速判断单纯疱疹病毒I型存在的目的。为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括DNA提取液，PCR反应液，DNA聚合酶，阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品，定量参比品，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物。本发明的有益效果为填补了国内临床检测单纯疱疹病毒I型(HSV I)的荧光PCR试剂盒的空白。而且本发明检测单纯疱疹病毒I型(HSV I)利用了Taqman核心技术平台和拟南芥内参照系统，具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。
文档编号C12R1/93GK102337355SQ20111027849
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者何东华, 姚雪 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司