专利名称：一种可德胶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种可德胶及其制备方法。
背景技术：
随着研究的不断深入，人们发现糖类是重要的信息分子，参与和介导了许多重要的生命过程，特别多糖参与细胞的各种生命现象及生理过程的调节备受关注。糖类作为信息分子在受精、生长、发育、分化，神经系统和免疫系统的衡态维持等各方面起着重要的作用；同时炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转化、病原体感染、植物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等众多的生理和病理过程都由糖类分子来介导。多糖资源丰富、来源广泛，可从陆地植物(如石斛)、水生植物(如海藻)中提取，多糖也可通过微生物发酵进行生物合成。兼具生物活性和凝胶化是一些多糖分子具有的主要特征。生物活性是指多糖在参与生命过程中表现出的免疫调节、抗肿瘤活性、抗AIDS和抗氧化作用等，而凝胶化则是是指多糖溶液在一定条件下形成凝胶的性质。目前，在食品、 医药、化妆品、化工等工业领域，多糖已被广泛用做胶凝剂、增稠剂、药物载体、乳化剂、稳定剂、膜材料等。多糖种类繁多，A-l，3-d-葡聚糖是活性多糖家族中最重要的成员之一。1964年，日本的原田笃也(TokuyaHarada)教授从土壤中分离了得到了 1株粪产碱菌变种菌株10C3 Ulcaligenes faecal is var. myxogenes 10C3)，这种微生物能在 10%的乙二醇为碳源的培养基中生成一种粘性物，里面含有琥珀酸。1966年，原田教授在制备琥珀酰聚糖的过程中，发现在培养基中添加的葡萄糖完全被消耗，并且生成大量白色沉淀。他们认为是有机体发生了变异而产生了这种不溶解的物质，通过进一步研究，分离出了一株变异物种，发现它仅仅由A-l，3-d葡聚糖苷键组成的聚合物，当其水悬浮液加热会形成一种弹性凝胶。根据其高温凝固(Curdle)的特性，将其命名为Curdlan (可德胶)。这也是世界上首次发现的唯一完全由A _1，3_d -葡聚糖苷键组成，并能在加热情况下形成凝胶的多糖大分子。1968年起，日本武田(Takeda)化学股份有限公司(大阪，日本)开始与原田教授合作开展可德胶在食品工业上的应用研究工作。分别就可德胶本身是否致癌，能否导致动物体突变反应等问题进行了安全性测试，证实了可德胶为安全无毒性的物质。美国的IRDC(国际研发协作组织)也对可德胶进行了进一步的安全和功能测试，发现它安全无毒，且具有提高人体免疫力，抗肿瘤等生物活性。美国FDA (食品药物管理局)已经推荐将其应用于食品行业，因此可德胶成为继黄原胶、结冷胶之后，第三个可直接作为食品添加剂用于食品配料中的多糖。1989年起，武田公司以Pureglucan TM为可德胶的商品名，在美国、日本、韩国、 台湾等地广泛生产使用。国内对于可德胶的研究起步较晚主要集中在发酵、分离以及生产方面。目前商用的可德胶，其结构中99%以上是由d-葡萄糖通过A-1，3葡萄糖苷键构成的葡聚糖。在自然状态下，可德胶以圆环状的小颗粒形式存在的，与淀粉的结构相类似。干燥的可德胶是无嗅、无味的白色或灰白色粉末状固体。高分子量可德胶不溶于水、醇类及许多有机溶剂，但可溶解于碱液、甲酸、二甲基亚砜、镉乙二胺(cadoxen)及25%碘化钾溶液，但低聚合度的可德胶是水可溶的。对于葡聚糖，大多数活性多糖分子都是具有1，3苷键主链结构。目前国内外对产可德胶菌株的基础性研究较多，集中于菌株筛选、发酵及可德胶 (curdlan)提取、分离和纯化，而应用方面研究较少，且存在产量低成本高的缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种可德胶产量高，生产周期短，性能稳定的制备方法。本发明利用产可德胶ATCC31749菌株通过紫外线(UV)照射和亚硝基胍(NTG) 复合处理等突变方法进行改良，结合苯酚蓝染色来进行筛选，从而获得可德胶高产菌株 Agrobacteriumsp. fcynl (保藏号CGMCC 5103)，并依据发酵“动力学”和“工程学”原理进行发酵过程多参数的调整、优化及放大来提高可德胶的产量。可德胶具体制备步骤如下
1.菌种活化取J^rohcteriwasAfcynl (保藏号CGMCC 5103)在含1. 5%琼脂糖的 LB平板上划线获得单菌落；
2.一级种子培养取形态和长势较好的单菌落接种于含LB培养基中，30°C，200 RPM, 振荡培养48 50 h，获得一级种子菌；
3.二级种子培养将一级种子菌50倍稀释在二级种子培养基中，30°C、200 RPM培养 48 50 h 培养(培养基组成 g/L 蔗糖 20，酵母膏 10，KH2PO4 1. 74，MgSO4 · 7H20 0. 49，pH 7.0)；
4.菌体培养将二级种子菌体转入菌体培养基中培养，培养基组成g/L蔗糖15，酵母膏 2. 0，NH4Cl 0. 5，KH2PO4 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，并含 0. 3% (ν/ν)无机盐浓缩液(g/L FeCl3 1.0，MnCl2 1.0，NaCl 1.0，CaCl2 1.0 )，pH 7. 00 ；以 600 RPM, 10-20% 的溶氧量，用 10-20%氨水和3M H2SO4调节pH值至6. 8-7. 2培养24h后，加入10% (v/v)400g/L蔗糖后， 在相同条件再培养M 26 h ；
5.发酵培养将菌体培养液转入含发酵培养基的发酵灌中，发酵培养基为g/L蔗糖 50 55，大豆粉 2. 0 3. 0，KH2PO4 0. 4 0. 5，MgSO4 · 7Η20 0. 5 0. 6，柠檬酸钾 0. 3 0. 4 禾口无机盐浓缩液 0.3% (ν/ν)，无机盐浓缩液组成 g/L JeCl3 1.0，MnCl2 1.0，NaCl 1. 0，CaCl2 1. 0)，pH 5. 5 6. 0，以 600 RPM，空气流量为 1. 5 2. 0 v/vm，并用 4 M NaOH 禾口 3 M H2SO4 发酵培养36 38 h，加入10% (ν/ν) 500 g/L蔗糖后，在相同条件培养36 38 h，此时再次加入10% (ν/ν) 500 g/L蔗糖，再在相同条件培养36 38 h后获得发酵液；
6.一次离心发酵培养液以4000 g，离心30 min，弃上清溶液，收聚含可德胶和菌体的沉淀部分；
7.可德胶的碱溶解在含可德胶和菌体的沉淀中加入50mM的氢氧化钠搅拌重悬沉淀，并放置1 h，溶解并提取可德胶；
8.二次离心提取液，以4000 g，离心30 min，弃含菌体的沉淀部分，回收含可德胶的上清溶液；
9.酸沉淀上清液用4M硫酸调pH值到5. 0，混勻后放置1 h ；
410.三次离心浑浊液4000g，离心30 min，弃上清液，收集可德胶沉淀物；
11.干燥并收获可德胶8(T85°C烘干后获得发酵的可德胶。本发明的研究过程
(1)碳源类型对可德胶发酵的影响
选择发酵工业中数种常见的碳源进行单一因素实验，结果表明(图1)，菌株fcynl的碳源利用范围较广，但不能利用乙醇和甘油。在可利用的碳源中，葡萄糖、蔗糖、糖蜜和可溶性淀粉的可德胶产量较高，其中以葡萄糖为碳源时可德胶的产量最高，这是由于菌体优先利用葡萄糖参与到可德胶的生物合成中。考虑节约成本和工业化生产的要求，可确定蔗糖为最佳碳源。糖蜜作为糖工业的副产品，价格低廉，用它作为碳源发酵生产可德胶可以变废为宝，作为工业化生产，糖蜜可作为首先碳源。(2)蔗糖浓度对可德胶发酵的影响
使用不同浓度的蔗糖作碳源，考查蔗糖浓度对可德胶发酵的影响。结果表明(图2)葡萄糖的浓度为49 g/L时可德胶的产量最高。这是因为首先，在蔗糖浓度较低时，碳源过早消耗完从而影响到发酵后期的可德胶的进一步合成；其次，较高的蔗糖浓度导致渗透胁迫而阻止了菌体的生长和可德胶产物的合成；第三，使用高浓度蔗糖发酵，会使较多的多糖在短时间内形成，发酵液的粘度急剧上升，造成搅拌和通气的困难，溶氧的急速降低从而限制了后期多糖进一步大量的生成。因而蔗糖的较适浓度50 g/L 55 g/L之间。(3)氮源种类对可德胶发酵的影响
以有机氮源(如酵母粉，蛋白冻，鱼粉，大豆粉)和无机氮源(氯化铵，硫酸铵，硝酸钾和碳酸铵)来考察氮源种类对可德胶发酵的影响。结果显示(图3)，菌株fcynl的氮源利用范围较窄，它能较为良好地利用营养较全面的酵母粉，大豆粉和蛋白冻稍差，对无机氮源利用能力较差。选用大豆粉作为培养基氮源，有利于降低成本。(4)氮源浓度对可德胶产量及对菌体生长的影响
应用不同浓度的酵母粉作为氮源，考察氮源浓度对可德胶产量及对菌体生长的影响， 如图4所示，氮源浓度较低时，菌体细胞量较少，可德胶合成速率也慢，可德胶产量低；随着酵母粉浓度的增加，菌体生物量也继续增大，但可德胶的产量却下降，这时由于碳氮比过低而氮源充足，菌体细胞的过分生长导致维持菌体代谢的碳源消耗过度，从而影响到可德胶的合成和产量。因此，在工业化生产过程中，进入产胶期后通过补加蔗糖来提高碳氮比，从而提高可德胶的产量。(5) ΚΗ2Ρ04、柠檬酸钾和H2SO4 · 7H20对可德胶发酵的影响
考察了 KH2P04、MgS04 ·7Η20及柠檬酸钾对可德胶发酵的影响，见图5所示。随着KH2PO4 浓度的增加可德胶产量逐渐增加，但如果KH2PO4浓度继续增加则可德胶的产量会降低，以 0. 4^0. 5 g/L时为最佳KH2PO4浓度。MgSO4 · 7H20有着与KH2PO4同样的影响趋势，只是耐受范围较宽，在0.5、. 6 g/L范围内，产胶效果较好。柠檬酸钾浓度对可德胶发酵的影响不十分显著，发酵产量的起伏不大，适宜的添加浓度为0. 3^0. 4 g/L左右。本发明与现有技术比较具有以下积极效果
1)本发明利用Agrobacterium sp. fcynl (保藏号CGMCC 5103)菌株为生产可德胶， 产量达到34. 5 g/L,比现有技术提高了 97. 3%，且发酵周期短，遗传性能稳定。2)以葡萄糖、蔗糖、糖蜜和可溶性淀粉作为发酵的碳源生产可德胶，获取生产最佳碳源；以酵母粉，鱼粉，大豆粉进行研究为获取最佳氮源，通过正交实验获取主要无机盐组分对可德胶发酵的影响，并利用响应面分析法(RSM)获得的最优培养基组合，温度，氧气， 发酵种子液的适宜种龄，接种量等对规模化生产可德胶的影响。3)对可德胶粗多糖多种提取工艺比较分析，主要是醇析法和酸碱法及两者相结合的方法进行比较分析，确定性价比最优的提取工艺。节约成本，价格低廉。
图1是本发明的可德胶生产工艺流程图。图2碳源类型对可德胶发酵的影响。图3是蔗糖浓度对可德胶发酵的影响。图4是氮源种类对可德胶发酵的影响。图5是氮源浓度对可德胶产量及对菌体生长的影响。图6是KH2PO4对可德胶发酵的影响。图7是MgSO4 · 7H20对可德胶发酵的影响。图8是柠檬酸钾对可德胶发酵的影响。图9是可德胶干燥后及及研磨后的产品图，A (固体)，B (粉未)。图10是可德胶标准品红外光谱。
具体实施例方式实施例1
制备可德胶的具体步骤如下
1.菌种活化取储存于_80°C的Agrobacteriumsp. fcynl (保藏号CGMCC 5103)菌株在含1. 5%琼脂糖的LB平板上划线获得单菌落；
2.一级种子培养取形态和长势较好的单菌落接种于含10 mL LB培养基的50 mL三角瓶中，30°C，200 RPM，振荡培养48 h左右，获得一级种子菌；
3.二级种子培养将10 mL 一级种子菌分别以50倍稀释培养在5个含100 mL 二级种子培养基的1 L三角瓶中(培养基组成g/L 蔗糖20，酵母膏10，KH2PO4 1. 74，MgSO4 · 7H20 0. 49, pH 7.0)，30°C、200 RPM 培养 48h ；
4.菌体培养将约0.5L 二级种子菌体转入含20 L菌体培养基中培养，培养基组成g/ L:蔗糖糖 15，酵母膏 2. OjNH4CI 0. 5, KH2PO4 2. 5，MgS04 ·7Η20 0· 5，并含 0· 3%(ν/ν)无机盐浓缩液(g/L :FeCl3 1.0，MnCl2 1.0，NaCl 1.0，CaCl2 1.0 )，pH 7. 00 ；以 600 RPM, 10-20% 的溶氧量，用10-20%氨水和3 M H2SO4调节pH值至6. 8-7. 2培养24 h后，加入10%(ν/ν) 400 g/L蔗糖(大约2 L)后，在相同条件再培养对h；
5.发酵培养将约20L菌体培养液转入含100 L发酵培养基的发酵灌中，发酵培养基为g/L 蔗糖50，大豆粉3. 0，KH2PO4 0. 4，MgSO4 · 7H20 0. 5，柠檬酸钾0. 3和无机盐浓缩液 0.3% (ν/ν)，无机盐浓缩液组成 g/L =FeCl3 1. 0，MnCl2 1. 0，NaCl 1. 0，CaCl2 1.0), pH 5. 5 6. 0，以600 RPM，空气流量为1. 5 2. 0 v/vm,并用4M NaOH和3 M H2SO4发酵培养 36 38 h，加入10% (ν/ν)，500 g/L蔗糖后，在相同条件培养36 38 h，此时再次加入 10% (ν/ν) 500 g/L蔗糖，再在相同条件培养36 38 h后获得发酵培养液；
66.一次离心发酵培养液以4000 g，离心30 min，弃上清溶液，收集含可德胶和菌体的沉淀部分；
7.可德胶的碱溶解在含可德胶和菌体的沉淀中加入30L 50 mM的氢氧化钠搅拌重悬沉淀，并放置1 h，溶解并提取可德胶；
8.二次离心提取液，以4000 g，离心30 min，弃含菌体的沉淀部分，回收含可德胶的上清溶液；
9.酸沉淀上清液用4M硫酸调pH值到5. 0，混勻后放置1 h ；
10.三次离心浑浊液4000g，离心30 min，弃上清液，收集可德胶沉淀物；
11.干燥并收获可德胶8(T85°C烘干后获得发酵的可德胶。实施例2
与实施例1不同的是5步骤，即
发酵培养将约20L菌体培养液转入含200L发酵培养基的发酵灌中，发酵培养基为g/ L :53，鱼粉 3. 0，KH2PO4 0. 45，MgSO4 · 7H20 0. 55，柠檬酸钾 0. 35 和无机盐浓缩液 0. 3% (ν/ ν)，无机盐浓缩液组成 g/L =FeCl3 1. 0，MnCl2 1. 0，NaCl 1. 0，CaCl2 1. 0)，pH 5. 5 6. 0， 以600 RPM,空气流量为2. 0 v/vm,并用4M NaOH和3M H2SO4发酵培养38 h，加入10% (ν/ v)500g/L蔗糖(大约20L)后，在相同条件培养38 h，此时再次加入10% (v/v) 500g/L蔗糖 (大约20L )，再在相同条件培养38 h后获得发酵培养液。实施例3
与实施例1不同的是5步骤，即
发酵培养将约20L菌体培养液转入含100L发酵培养基的发酵灌中，发酵培养基为g/ L 蔗糖55，酵母粉3. 0，KH2PO4 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 6，柠檬酸钾0. 4和无机盐浓缩液0. 3% (ν/ν)，无机盐浓缩液组成 g/L =FeCl3 1.0，MnCl2 1. 0，NaCl 1. 0，CaCl2 1. 0)，pH 5. 5 6. 0，以600 RPM,空气流量为1. 5 2. 0 v/vm,并用4 M NaOH和3 M H2SO4发酵培养36 h 加入10% (ν/ν) 500 g/L蔗糖后，在相同条件培养36 h，此时再次加入10% (ν/ν) 500 g/L 蔗糖，再在相同条件培养36 h后获得发酵液。
权利要求
1.一种可德胶的制备方法，其特征在于按以下步骤进行1)菌种活化取保藏号为CGMCC5103的Agrobacterium sp. fcynl菌种，在含1. 5%琼脂糖的LB平板上划线获得单菌落；2)—级种子培养取形态和长势较好的单菌落接种于含LB培养基中，30°C，200RPM，振荡培养48 50 h，获得一级种子菌；3)二级种子培养将一级种子菌50倍稀释在二级种子培养基中，30°C、200RPM培养 48 50 h 培养，培养基组成 g/L 蔗糖 20，酵母膏 10，KH2PO4 1. 74，MgSO4 · 7H20 0. 49，pH 7 ；4)菌体培养将二级种子菌体转入菌体培养基中培养，培养基组成g/L蔗糖糖15，酵母膏 2. 0，NH4Cl 0. 5，KH2PO4 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，并含 0. 3%v/v 无机盐浓缩液，pH 7. 00 ； 以600 RPM, 10 20%的溶氧量，用10 20%氨水和3M H2SO4调节pH值至6. 8 7. 2培养24h后，加入10% v/v 400g/L蔗糖后，在相同条件再培养M 沈h ；5)发酵培养蔗糖50 55，大豆粉3.0，KH2PO4 0. 4 0. 5,MgSO4 ·7Η20 0. 5 0. 6，柠檬酸钾0. 3 0. 4和无机盐浓缩液0. 3% v/v, pH 5. 5 6. 0，以600 RPM,空气流量为1. 5 2. 0 v/vm,并用 4 M NaOH 和 3 M H2SO4 发酵培养 36 38 h，加入 10% (v/v) 500 g/L 蔗糖后，在相同条件培养36 38 h，此时再次加入10% (v/v)500 g/L蔗糖，再在相同条件培养 36 38 h后获得发酵液；6)—次离心发酵培养液以4000g，离心30 min，弃上清溶液，收聚含可德胶和菌体的沉淀部分；7)可德胶的碱溶解在含可德胶和菌体的沉淀中加入50mM的氢氧化钠搅拌重悬沉淀，并放置1 h，溶解并提取可德胶；8)二次离心提取液，以4000 g，离心30 min，弃含菌体的沉淀部分，回收含可德胶的上清溶液；9)酸沉淀上清液用4M硫酸调pH值到5，混勻后放置1 h ；10)三次离心浑浊液4000g，离心30 min,弃上清液，收集可德胶沉淀物；11)干燥并收获可德胶80 85°C烘干后获得发酵的可德胶。
2.根据权利要求1所述的可德胶的制备方法，其特征在于4)、5)步骤中所述无机盐浓缩液组成为 g/L =FeCl3 1.0，MnCl2 1. 0，NaCl 1. 0，CaCl2 1.0。
3.用权利要求1所述的可德胶的制备方法制备的可德胶。
全文摘要
本发明是一种可德胶及其制备方法。可德胶取保藏号为CGMCC5103的Agrobacteriumsp.fcyn1经菌种活化、一级种子培养、二级种子培养、菌体培养、发酵培养、一次离心、二次离心、三次离心等步骤，干燥并收获可德胶。本发明利用Agrobacteriumsp.fcyn1菌株生产可德胶，产量达到34.5g/L，比现有技术提高了97.3%，且发酵周期短，遗传性能稳定，节约成本，价格低廉。
文档编号C12R1/01GK102286569SQ20111027824
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者尚海丽, 李兴义, 杨发祥, 毛自朝 申请人:云南省微生物发酵工程研究中心有限公司