专利名称：一种固相化sumo化系统及固相化去sumo化系统的制作方法
技术领域：
本发明属于酶学领域，具体地说，涉及一种固相化SUMO化系统及一种固相化去 SUMO化系统。
背景技术：
在1996年，Blobel发现SUM0(Smt3)能够共价的结合一个小G蛋白的激活蛋白RanGAPl，并能影响此蛋白在细胞核与核质的运输，随后第一次将此类小蛋白命名为 SUMO (small ubiquitin-like modifier)。随后，SUMO化修饰在多种生命过程，在多种生物体(酵母，昆虫，线虫甚至高等脊椎动物)中被发现，并得到阐释。SUMO在细胞的多项生理过程，在疾病的发生发展过程中和某些药物的作用过程中，都发挥着重要的调控作用，成为现阶段蛋白质翻译后修饰领域一个重要研究内容和商业化应用的重要领域。因此，如何对目的蛋白方便、快捷地进行SUMO化和去SUMO化就成为了其研究的一个热点。目前对于SUMO化的研究方法主要为首先通过位点的预测寻找感兴趣的可能被 SUMO化的蛋白，然后通过SUMO激活酶El (包括异源二聚体SAEI和SAEII)和SUMO转移酶 Ubc9进行SUMO化确证，然后集中于研究SUMO化后的蛋白底物的功能。但由于进行SUMO化确证时，没有一个合适的操作平台，导致对目标蛋白的SUMO化及SUMO化后的后续处理均不方便，因此，需要一种能够用于快速高通量鉴定蛋白SUMO化的系统，以简化SUMO化操作。同时，在后基因组时代的研究中，研究一个基因的重要方面就是对它的翻译产物的体外功能进行分析，因此，要求能够方便快捷经济地获得重组蛋白质。然而随后的实践证明，在最为普遍使用的大肠杆菌表达系统中，人类基因组中只有约25%的基因能够以可溶蛋白的方式表达。解决上述两个问题的常用方法就是使用促溶表达融合标签，比如葡萄糖亲和标签 MBP (maltose-binding protein)，谷胱甘肽转移酶标签 GST (glutathione S-transferase) 等。当外源蛋白质融合某些特定的标签后，能够有效增加重组蛋白质的产量和溶解性。但是，在融合标签切除过程中，一个非常值得注意的问题就是许多蛋白质要获得生物活性以及结构稳定性都需要特定的N端氨基酸残基，尤其是很多用于结构研究以及医疗用途的蛋白质。然而所有新生蛋白质在其N端都是甲硫氨酸，然后经过转译后加工修饰才形成其它不同的氨基酸。而常用的GST，NusA或者MBP标签的切除，只能通过引入蛋白酶位点，在融合蛋白完成表达和纯化后，加入蛋白酶切除蛋白质标签。这样在融合标签切除过程中如何避免产生非天然N端氨基酸或者产生特异的N端氨基酸，是很多蛋白酶使用过程中所面临的挑战。而SUMO不仅是较好的促溶蛋白质表达标签之一，更重要的是，SUMO融合标签可以在体外被源于酵母的SUMO特异的蛋白质水解酶Ulpl极为高效和特异地切除，从而获得与天然靶蛋白完全相同的重组蛋白质，满足结构生物学研究和医疗用途的蛋白质需要。但使用水解酶Ulpl进行去SUMO化处理时，现尚没有一个简单合适的操作平台， Ulpl酶的获得需要繁琐的纯化过程，同时Ulpl的加入也会给目标蛋白的纯化及其后续处理带来了不便，因此，需要一种能够十分简便而又能高通量的进行去SUMO化的系统，从而能够很好的解决上述问题，简化去除SUMO融合标签的操作。ChBD作为一个特殊的结构域，对于胆碱或者胆碱类似物有很强的亲和吸附能力， 能够特异性的吸附在二乙氨乙基纤维素(DEAE cellulose)上。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种固相化SUMO化系统。本发明还有一个目的在于，提供固相化SUMO化系统的制备方法。本发明还有一个目的在于，提供固相化SUMO化系统的应用。本发明还有一个目的在于，提供一种固相化去SUMO化系统。本发明还有一个目的在于，提供固相化去SUMO化系统的制备方法。本发明还有一个目的在于，提供固相化去SUMO化系统的应用。本发明提供的固相化SUMO化系统为固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶 SAEII或SUMO转移酶Wdc9的SUMO化系统；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII 的SUMO化系统；其中，SUMO化系统包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶 Wdc9。根据本发明的一个优选实施例，所述SUMO激活酶SAEI的序列选自(a) SEQ ID NO :1 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 SUMO激活酶SAEI活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。根据本发明的一个优选实施例，所述SUMO激活酶SAEII的序列选自(i)SEQ ID NO :2 ；或(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 SUMO激活酶SAEII活性的由(i)衍生的蛋白质或多肽。根据本发明的一个优选实施例，所述SUMO转移酶W3C9的序列选自(I)SEQ ID NO :3 ；或(II)在(I)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 SUMO转移酶W3C9活性的由(I)衍生的蛋白质或多肽。根据本发明的一个优选实施例，SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶W3C9的固相化为通过ChBD序列的连接将所述SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII 和SUMO转移酶W3C9吸附在二乙氨乙基纤维素上。根据本发明的一个优选实施例，所述ChBD序列选自(I)SEQ ID NO :4 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。本发明提供的固相化SUMO化系统的制备方法包括以下步骤:A)分别制备蛋白pChBD-SAEI，pChBD-SAEII 和 pChBD-SUMO 转移酶 Ubc9 ；B)将步骤 A 中制备好的 pChBD-SAEI， PChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶W3c9分别与二乙氨乙基纤维素充分混合，或将步骤A中制备好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9分别两两混合，再与二乙氨乙基纤维素充分混合，或将步骤A中制备好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶W3C9与二乙氨乙基纤维素共同充分混合，以获得固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9。本发明提供的固相化SUMO化系统的应用为用于高通量鉴定可SUMO化蛋白，或用于将可SUMO化蛋白SUMO化，以研究该可SUMO化蛋白的功能。本发明提供的固相化去SUMO化系统包括固相化的SUMO水解酶。根据本发明的一个优选实施例，所述SUMO水解酶的序列选自(I)SEQ ID NO 5 ；或 SEQ ID NO 6 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。根据本发明的一个优选实施例，SUMO水解酶的固相化通过ChBD序列吸附在二乙氨乙基纤维素上而将水解酶固相化。本发明提供的固相化去SUMO化系统的制备方法包括以下步骤:A)制备蛋白 pChBD-Ulpl ；B)将步骤A中制备好的pChBD-Ulpl与二乙氨乙基纤维素充分混合，以获得固相化SUMO化系统。本发明提供的固相化去SUMO化系统的应用为在体外将SUMO化蛋白去SUMO化。使用本发明提供的固相化SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将可SUMO化的蛋白进行SUMO化；使用本发明提供的固相化去SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将SUMO化的蛋白去SUMO化，同时，上述固相化系统还可重复利用。
图Ia为改造后的表达载体pET28a的改造部分的结构示意图。图Ib为改造后的表达载体pET28a的多克隆位点MCS序列。图2为pChBD-Ulpl的固相化酶催化反应的检测结果，其中，泳道1为Marker，泳道2为未加入游离Ulpl酶，只加入催化反应底物的阴性对照，泳道3为加入游离的Ulpl 酶的阳性对照，泳道4为固相化pChBD-Ulpl第1次催化反应的检测结果，泳道5为固相化 pChBD-Ulpl第2次催化反应的检测结果，泳道6为固相化pChBD-Ulpl第3次催化反应的检测结果。图3为未优化的固相化SAEI，SAEII, Ubc9的SUMO化反应检测结果，其中，泳道1 为三酶全游离的检测结果，泳道2为三酶全固相化的检测结果，泳道3-5为双酶固相化的检测结果，泳道6-8为单酶固相化的检测结果。图4为优化的固相化双酶及三酶的SUMO化反应检测结果，其中，泳道1为三酶全游离的检测结果，泳道2为三酶全固相化的检测结果，泳道3-5为双酶固相化的检测结果。图5为优化的固相化SAEI，SAEII双酶的SUMO化反应检测结果，其中，泳道1_3分别为同时固相化SAEI，SAEII双酶，催化SUMO化反应的第一次至第三次的催化反应结果。
具体实施例方式蛋白及其衍生的蛋白本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明蛋白质或多肽的衍生形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有相应活性。可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述衍生的蛋白质或多肽。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗本发明蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含本发明蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有本发明蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约 100个连续氨基酸。如本文所用，衍生蛋白是指与本发明蛋白序列可高度同源或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述蛋白具有相应活性。现有技术中已公开了本发明及其同源蛋白的序列，这些本领域已知的蛋白均包括在本发明中。本发明中SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII，SUMO转移酶证⑷优选获自人。 本发明中SUMO水解酶优选为酵母SUMO水解酶Ulpl。应理解，获自其它生物(与本发明如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、 65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98% 序列相同性)的其它蛋白也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。亲和标签本发明所述的亲和标签选自但不仅限于以下标签Chitin binding domain (ChBD), amino acid recognition sequence of a biotin ligase (例如 AviTag), Glutathione-S-Transferase (GST, Invitrogen), His6hexapeptide, Strep-tag 11 (Sigma GenoSys), calmodulin binding peptide (CBP, KRRWKKNFIAVSMNRFKKISSSGAL, Stratagene), hemagglutinin (HA, YPYDVPDYA, BD Biosciences), FLAG(DYKDDDD, Sigma Aldrich)，Myc(EQKLISEEDL, Stratagene)。
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以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或产商推荐的条件进行。 在本发明的下述实施例中，按照hvitrogen公司的手册，将Ulpl酶活定义为1 单位 Ulpl 活性为在 20μ 1 体系(50mM Tris-HCl, pH8. 0,150mM NaCl,5mM β -mercaptoethanol)中，30°C 1小时能够切割2ug的SUM0EGFP标准蛋白质底物的酶量。以下实施例中，使用的材料来源如下QIAEX II Gel Extraction Kit 150 试剂盒购自 QIAGEN 公司。载体 pET28a 购自 Novagen 公司。Taq酶、溶菌酶购自Tiangen公司，限制性内切酶HindIII和Kpnl、NheI和Xhol、 XbaI，SalI、DNase I 均购自 NEB 公司。pEGFP-Cl 购自 Clontech 公司。大肠杆菌BL21 购自 hvitrogen。superscript III 试剂盒购自 hvitrogen。TIANamp酵母基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN。293T 细胞购自 ATCC。Ulpl 酶购自 Fulengen。TlBuffe 的配方为Tris_HCl (ρΗ7· 5) 50mM, NaCl 50mM, EDTA ImM。Ulpl 酶切反应 buffer 的配方为50mM Tris-HClpH 8. 0,150mM NaCl, 5mMβ -mercaptoethanolο实施例1、制备ChBD目标序列1.1、引物设计设计引物I^rimerl-lO，用于扩增制备ChBD目标序列，其中，Primerl-IO的序列分别如下所示Primerl 5 ‘ -GGCTGGCAGAAGAATGACACTGGCTACTGGTACGTACATTCAGACG GCTCTTATCCAAA-3‘；Primer2 5 ‘ -CAAAGTAGTACCAAGTGCCATTGATTTTCTCAAACTTGTCTTTTGGAT AAGAGCCGTCT-3‘；Primer3 5 ‘ -GCACTTGGTACTACTTTGACAGTTCAGGCTATATGCTTGCAGACCGCT GGAGGAAGCAC-3‘；Primer4 5 ‘ -ATTTCGCCTGAGTTGTCGAACCAGTACCAGTTGCCGTCTGTGTGCTT CCTCCAGCGGTC-3‘；Primer5 5 ‘ -CGACAACTCAGGCGAAATGGCTACAGGCTGGAAGAAAATCGCTGAT AAGTGGTACTATT-3‘；Primer6 5 ‘ -GTACTTGACCCAGCCTGTCTTCATGGCACCTTCTTCGTTGAAATAGTA CCACTTATCAG-3‘；Primer7 5 ‘ -ACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACTTGGTACTACTTAGACGCTAAAGAAGGCGCCAT-3‘；Primer8 :5 ‘ -AGCCTGTTCCGTCCGCTGACTGGATAAAGGCATTTGATACCATGGCG CCTTCTTTAGCG-3‘；Primer9 5 ‘ -CAGCGGACGGAACAGGCTGGTACTACCTCAAACCAGACGGAACACT GGCAGACAGGCCA-3‘；PrimerlO 5' -TGGCCTGTCTGCCAGTGTTCCGTCTGGTTT-3‘。1.2、PCR 扩增分别以Primer2和3为模板，Primerl和4为引物对；Primer6和7为模板，Primer5 和8为引物对；Primer8和9为模板，Primer7和10为引物对，进行PCR扩增。然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150试剂盒分别纯化回收扩增产物，并将得到的3个PCR扩增片段作为模板，以ft~imerl和10为引物进行二次PCR扩增。在扩增完成后，加入Taq酶lul，于72°C反应30min，以在目的片段两端加上A，然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150试剂盒纯化回收，获得在序列两端加A的ChBD 序列。1.3、连接与转化将步骤1. 2中获得的在序列两端加A的ChBD序列通过TA克隆插入T载体，然后将连接产物转化到RbCl感受态细胞中。使用碱法抽提质粒，并进行酶切鉴定和序列测定，测序结果如SEQ ID NO. :4所示， 根据酶切鉴定和序列测定的结果，ChBD目标序列转化成功。实施例2、ChBD序列转化感受态细胞2. 1、引物设计及PCR扩增设计引物I^rimerll和I^rimerl〗，其序列分别如下所示Primerll 5' -CCCMGCTTATGGTACATTCAGACGGCTCTTATCC-3‘；Primer12:5' ~CGGGGTACCTGGCCTGTCTGCCAGTGTTCCGT~3‘。其中，Primerll中下划线标识的序列为HindIII识别位点；Primerl2中下划线标识的序列为KpnI识别位点。以实施例1. 3中获得的质粒为模版，以I^rimerll和ft~imerl2为引物对，进行PCR 扩增，然后进行凝胶电泳检测，获得ChBD扩增序列。然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150试剂盒纯化回收扩增产物。2. 2、连接与转化使用酶HindIII和KpnI分别对经改造的表达载体pET28a(改造部分的结构如图1 所示)和步骤2. 1中获得的扩增产物进行酶切，然后使用T4DNA连接酶连接后，转化E. coli 感受态细胞DH5 α。然后使用碱法小量抽提质粒，并对抽提获得的质粒进行酶切鉴定，结果显示，ChBD 序列转化感受态细胞DH5 α成功，获得pChBD载体。实施例3、pChBD-SAEI, pChBD-SAEII，pChBD~Ubc9, pChBD-Ulpl 载体及 SUM01-pET28a 和 I^opI-pETZSa 质粒构建参考产品使用手册，使用Superkript III试剂盒，用人源的细胞构建cDNA 文库。
参考产品使用手册，使用TIANamp酵母基因组DNA提取试剂盒提取酿酒酵母基因组。设计引物SAEI-pF、SAEI-pR、SAEII-pF、SAEII-pR、Ubc9_pF、Ubc9_pR、Ulpl-pF、 Ulpl-pR、SUM01-pF、SUM01-pR、Topol-pF 和 Topol-pR，序列如下SAEI-pF :AATCCGGCTAGCATGGTGGAGAAGGAGGAGGC ；SAEI-pR :AAGAAGAATTCCTCGAGTCACTTGGGGCCAAGGCA ；SAEII-pF CCGGAATTCGCTAGCATGGCACTGTCGCGGGGGCT ；SAEII-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGAGTCAATCTAATGCTATGACATCATCA ；Ubc9-pF :GGGAATICCAIAIGICGGGGAICGCCCI ；Ubc9-pR :AACCCAAGCTTATGAGGGCGCAAACTTCTT ；Ulpl-pF :GGGAATTCCATATGGCTAGCCTTGTTCCTGAATTAAATG ；Ulpl-pR:CCGGAATTCACTCGAGCTATTTTAAAGCGTCGGTTA ；SUMOl-pF :ATGGGAATTCGGTACCCATATGTCTGACCAGGAGGCAAAA ；SUMOl-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGAGCTAACCCCCCGTTTGTTCCTGA ；Topo1-pF :AATAGGGCTAGCGATCGCCATGAGTGGGGACCACCTCC ；Topol-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCTT CCTCTTCTTTCTTCGGCTT。以构建好的人cDNA文库为模板，分别以引物SAEI-pF和SAEI-pR、SAEII-pF和 SAEII-pR、Ubc9-pF 和 Ubc9_pR、SUM01-pF 和 SUM01-pR、以及 Topo 1-pF 和 Topol-pR 为引物对，进行PCR扩增，PCR扩增产物经QIAEX II Gel Extraction Kit 150胶回收，获得相应的基因片段，其中，SAEI基因片段序列如SEQ ID NO 1所示，SAEII基因片段序列如SEQ ID NO 2所示，Ubc9基因片段序列如SEQ ID NO 3所示。以提取的酵母基因组为模板，以Ulpl-pF，Ulpl-pR为引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物经QIAEX II Gel Extraction Kit 150胶回收，获得Ulpl基因片段，获得Ulpl基因片段如SEQ ID NO 5所示，Ulpl基因片段的全长序列如如SEQ ID NO 6所示。将SAEI基因片段和SAEII基因片段通过NheI和BioI双酶切，并将酶切产物连接入同样经过NheI和BioI双酶切的pChBD载体中，经测序确定，得到了 N端为ChBD，C端为 SAEI 和 SAEII 的融合克隆 pChBD-SAEI 和 pChBD-SAEII。采用同样的方法，分别得到了 N端为ChBD，C端为W3C9的融合克隆、N端为ChBD， C 端为 Ulpl 的融合克隆 pChBD-Ubc9 和 pChBD-Ulpl，以及 pET28a_SUM01 和 pET28a_Topol。将上述重组表达质粒转化大肠杆菌BL21后，诱导培养，表达其相应的蛋白并进行检测，具体操作如下接种单克隆菌落于LB培养液，37°C培养12 14小时；取上述培养菌液按1 100 比例接种于新鲜的LB培养基中，37°C培养至0D_为0. 6 0. 8，加入异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，22°C培养16-20h。6000rpm离心1分钟收集菌体。然后将菌体溶于含有0. 5mg/ml溶菌酶的破菌缓冲液中，液氮冻融，反复三次，力口入DNase I至终浓度为25mg/ml以及MgSO4至终浓度20mM，冰上消化至不粘，18000rpm/min 离心15分钟后分别取上清S，沉淀P和全菌W，进行SDS-PAGE电泳，并以未诱导全菌Neg作为对照。
结果显示，分别获得了表达pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD_Ubc9，pChBD-Ulpl， SUMOl和TopoI的菌株。实施例4、SUM0-EGFP融合蛋白制备4.1、引物设计设计引物P1、P2、P3和P4，序列如下所示Pl :5，-GCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’ ；P2 :5， -CGAATTCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’ ；P3 5' -CACCTACCATGGGTCATCACCATCA-3’ ；P4 5，-GGAATTCTTTCATACCTCCAATCTGTTCGCGG-3，。其中，引物Pl和P4的下划线为EcoRI识别位点，引物P2的下划线为BiolI识别位点，引物P3的下划线为NcoI识别位点。4. 2、pET28a-6His-EGFP 质粒构建以质粒pEGFP-Cl为模板，以引物Pl和P2为引物对，进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150回收，获得EGFP序列的扩增产物。将EGFP序列的扩增产物和表达载体pET28a分别使用EcoRI和BioI酶切，并连接后，转化E. coli感受态细胞DH5 α，经检测获得pET28a-6His_EGFP质粒。4. 3、SUM0-EGFP融合表达载体构建以酿酒酵母基因组为模板，以引物P3和P4为引物对，PCR扩增获得SUMO基因，然后以NcoI和EcoRI酶切后插入到经过同样酶切的pET28a-6His-EGFP中，获得SUM0-EGFP 融合表达载体。4. 4、SUM0-EGFP 融合蛋白获得将步骤4. 3中获得的SUM0-EGFP融合表达载体经IPTG诱导表达后，经Ni柱纯化， 获得SUM0-EGFP融合蛋白。实施例5、pChBD_Ulpl固相化取步骤3. 3中获得的表达pChBD-Ulpl的菌株进行诱导培养，然后，进行如下操作， 以实现PChBD-Ulpl固相化(1) 5ml诱导表达的菌液离心后去除培养液加入600ul TlBuffer混勻。(2)加入溶菌酶至终浓度0. 5mg/ml，冰上1小时。(3)超声破菌(400w,40次，每次2s，间隔8s)。(4)超声后的菌液4度离心13000rpm离心30分钟。(5)与此同时对DEAE Beads进行处理，每份样品取Beads lOOul，离心以去除保存液，并用TlBuffer洗涤3次。(6)超声后的菌液离心后，取其上清蛋白粗提物加入到洗涤后的Beads中。(7)4度混旋仪上旋转混勻1小时以充分结合。(8)6000rpm离心1分钟，收集结合后的上清。(9) TlBuffer 500ul 洗涤 Beads。6000rpm 离心 1 分钟。(10)再用高盐洗脱Buffer 500ul洗涤2次，去除杂蛋白。经检测，流出液中的Ulp 1含量明显少于上清蛋白粗提物中的Ulp 1含量，从而可确 SpChBD-Ulpl固相化成功。
实施例6、DChBD-UlDl的固相化酶催化反应使用实施例5中获得的pChBD-Ulpl进行固相化酶催化反应，其中，向底物中加入 Ulpl酶作为阳性对照；底物中不加入Ulpl酶，作为阴性对照；具体步骤和条件如下(1)结合 pChBD-Ulpl 后的 DEAE Beads 再用 Ulpl 酶切反应 buffer 500ul 洗涤一次。离心，洗尽上清。(2)加入Ulpl酶切反应Buffer IOOul，SUM0-EGFP融合蛋白2ug，4度混旋仪反应过夜。(3)设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为SUM0-EGFP融合蛋白2ug，Ulpl酶1U， Buffer补足至20ul ；阴性对照为加入SUM0-EGFP融合蛋白2ug，不加Ulpl酶，同样补足 Buffer至20ul，4度混旋仪反应过夜。(4)过夜反应后，6000rpm离心1分钟，取上清样品，加入Loading Buffer于100°C 煮样品10分钟，留待SDS-PAGE胶电泳分析。(5)固相化的Ulpl酶在取尽上清后，再用酶切反应buffer 500ul洗涤1次，再加入酶切反应bufferlOOul，SUM0-EGFP融合蛋白2ug，继续4度混旋仪反应8小时。(6)重复步骤⑷、(5)以进行第三次反应。样品进行SDS-PAGE胶电泳分析，结果如图2所示。根据图2结果，固相化之后的Ulpl仍然具有很好的酶活性，通过简单的高盐洗脱过程可以将杂蛋白洗脱，只在beads上留下所需的Ulpl酶。同时，由于酶的催化反应本身的特性，在反应的过程中并不会被消耗，利用温和的反应条件可以使固相化酶的重复利用成为可能。在4度的反应条件下，进行到第三次酶催化反应，被固相化的Ulpl仍然具有很好的活性。同时，由于Ulpl酶本身不会随着反应液的洗脱而存在与反应之后的底物中，更利于后面相应的检测和反应。因此，固相化Ulpl酶催化反应体系存在的潜在商业价值。实施例7、pChBD-SAEI, pChBD-SAEII，pChBD_Ubc9 的固相化及催化7. 1、单酶固相化采用实施例5中的方法，将pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，PChBD_Ubc9分别进行固相化，获得单独固相化的 pChBD-SAEI，pChBD-SAEII, pChBD_Ubc9。7. 2、固相化单一酶的催化反应将单独固相化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII或pChBD-Ubc9与纯化好的非固相化的另2种相应的酶混合，进行催化反应，同时，加入均为非固相化的上述3种酶进行催化作为阳性对照，其中，进行催化反应时，各酶浓度分别如下SAEI为500ng，SAEII为lugjbd为 1. 5ug，底物为TopoI Iug和SUMO lug，其中，TopoI和SUMO由表达TopoI和SUMOl的菌株 pET28a-Topol和pET28a_SUM01分别经诱导表达、纯化获得。反应结束后，取反应溶液进行Western Blot检测分析，结果如图3所示。7. 3、固相化双酶和固相化三酶的催化反应将固定化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，PChBD_Ubc9全部混合或两两混合，分别获得固定化双酶和固定化三酶，然后参考步骤7. 2中的方法，检测其催化反应，结果如图3所
7J\ ο图3结果显示，在仅仅只固相化一个酶的情况下，SUMO化反应能够较为正常的进
11行，但当固相化三者当中的两者或者三者全部固相化的时候，SUMO化的反应已经十分微弱， 甚至根本不能被检测。根据上述结果，实际的酶催化反应远比想象的复杂，可能存在更多的空间结构位点变化，固相化之后的酶难以在空间结构上相互接近来完成反应。因此，需要对其固相化过程进行优化改进，以便于获得能催化SUMO化反应较为正常的进行的固相化系统。7. 4、优化的固相化双酶和固相化三酶体系制备将酶pChBD-SAEI和pChBD_SAEII同时进行固相化，具体方法与实施例4中的方法基本相同，但进行双酶固相化时，将步骤(6)改为，在Beads内同时加入pChBD_SAEI和 PChBD-SAEII的蛋白粗提物，从而获得优化的pChBD-SAEI和pChBD-SAEII双酶固相化催化体系。采用上述同样的方法，分别获得其他的优化的固相化双酶和固相化三酶催化体系。7. 5、优化的固相化双酶和固相化三酶的催化反应将步骤7. 4中获得的pChBD-SAEI和pChBD-SAEII的固相化双酶与纯化好的非固相化的pChBD-Ubc9混合，进行催化反应，其中，加入的SAEI为500ng，SAEII为lug，W3c9为 1. 5ug，底物为带有 Flag tag 的 Topl-Ilug，SUMO lug。同时，采用同样的条件，将步骤7. 4中获得的其他固定化双酶与对应的纯化好的非固相化的酶混合，并进行催化反应。采用同样的条件，使用步骤7. 4中获得的固相化三酶催化体系进行催化。上述催化反应结束后，采用步骤7. 2中的方法，检测其催化反应，结果如图4所示。上述结果显示，在同时固相化SAEI和SAEII，并加入流动相的证⑷的情况下能够完成SUMO化的催化反应，并且在第二次和第三次的反应中仍然能够完成SUMO化的催化反应，结果如图5所示，但是采用其他的固定化双酶或固定化三酶反应体系，则无法完成SUMO 化的催化反应。根据上述结果，同时固相化SAEI和SAEII，并加入流动性的W3c9，可用于SUMO化固相化酶催化反应，在一定程度上扩展了 SUMO化固相化酶催化反应体系的应用。综上所述，本发明提供了一种SUMO化固相化酶催化反应体系，用于高通量鉴定可 SUMO化蛋白，或用于将可SUMO化蛋白SUMO化，以用于研究可SUMO化蛋白的功能；同时，本发明还提供了一种去SUMO化固相化酶催化反应体系，以获得与天然靶蛋白完全相同的重组蛋白质，从而满足结构生物学研究和医疗用途的蛋白质需要。通过一步化的结合和简单的洗脱过程，能够快速的获得大量的固相化蛋白，同时由于固相化酶本身不会随着反应液的洗脱而存在于反应之后的底物中，更利于后面相应的检测和反应。同时由于酶的催化反应本身的特性，在反应的过程中并不会被消耗，利用温和的反应条件可以使固相化酶的重复利用成为可能。因此，上述固相化酶催化反应体系具有很好的应用前景。即使用本发明提供的固相化SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将可SUMO化的蛋白进行SUMO化； 使用本发明提供的固相化去SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将SUMO化的蛋白去 SUMO化，同时，上述固相化系统还可重复利用。
权利要求
1.一种固相化去SUMO化系统，其特征在于，所述固相化去SUMO化系统包括固相化的 SUMO水解酶。
2.如权利要求1所述的固相化去SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO水解酶的序列选自(1)SEQ ID NO :5 ；或 SEQ ID NO :6 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO 水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。
3.如权利要求1所述的固相化去SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO水解酶固相化为通过亲和标签的连接将所述SUMO水解酶吸附在与亲和标签有亲和结合作用的介质上。
4.如权利要求3所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述亲和标签选自但不仅限于以下标签Chitin binding domain (ChBD), AviTag, Glutathione-S-Transferase (GST), His6hexapeptide, calmodulin binding protein (CBP), protein C tag, hemagglutinin (HA) tag, aFLAGtag 禾口 Myctag0
5.如权利要求3所述的固相化去SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO水解酶固相化为通过ChBD序列的连接将所述SUMO水解酶吸附在二乙氨乙基纤维素上。
6.如权利要求5所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述ChBD序列选自(1)SEQID NO 4 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO 水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。
7.如权利要求5所述的固相化去SUMO化系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤A)制备蛋白pChBD-SUMO水解酶；B)将步骤A中制备好的pChBD-SUMO水解酶与二乙氨乙基纤维素充分混合，以获得固相化去SUMO化系统。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤B后还包括高盐洗脱以去除杂蛋白的步骤。
9.如权利要求1或3所述的固相化去SUMO化系统的应用，其特征在于，所述应用为在体外将SUMO化蛋白去SUMO化，以获得与天然靶蛋白序列完全相同的重组蛋白质。
全文摘要
本发明提供了一种固相化SUMO化系统及一种固相化去SUMO化系统。本发明提供的固相化SUMO化系统固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶Ubc9的SUMO化系统；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII的SUMO化系统；其中，SUMO化系统包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶Ubc9。固相化去SUMO化系统包括固相化的水解酶Ulp1。使用本发明提供的固相化SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将可SUMO化的蛋白进行SUMO化；使用本发明提供的固相化去SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将SUMO化的蛋白去SUMO化，同时，上述固相化系统还可重复利用。
文档编号C12P21/06GK102533712SQ20121001097
公开日2012年7月4日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者杨淑伟, 程夏楷 申请人:中国科学院上海生命科学研究院