专利名称：一种分析维生素c生产菌株传代过程磷脂组变化的方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，涉及一种分析维生素C生产菌株混菌传代培养过程磷脂组变化的方法。
背景技术：
随着经济发展和生活水平不断提高，人类对健康越来越重视，各种维生素类保健品的需求量逐年增加。在各种维生素中，维生素C是一种高效抗氧化剂，参与人体新陈代谢中重要的生物合成过程，是维持机体营养、生长所必需的维生素。它还在药品、食品和化妆品添加等方面有极为广泛的应用。目前，我国通过使用巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌 (Gluconobacter oxydans)混合发酵生产维生素C。其中，前者为伴生菌，后者为产酸菌。两菌在混合发酵的过程中，通过相互作用促进产酸菌的生长和产酸。在不加入伴生菌时，产酸菌生长缓慢，产酸效率极低，不适合工业生产；而混合培养时，产酸菌也会影响伴生菌的生长和形态。改造两菌相互作用模式，进一步提高发酵产物2-酮基-L-古龙酸(维生素C的前体)的产量，可以减少能源消耗和环境污染，极大的降低生产成本。在两菌混合培养中，它们之间的交流最先经由感受外界信号的细胞膜，再进一步传递到胞内，并产生一系列的信号事件。研究两菌传代培养，不断强化相互作用的过程中， 细胞膜磷脂组的变化，可从这一角度找到两菌相互作用促进产酸的原因，并为进一步的菌种筛选和改造，以及生产工艺优化等提供支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法。本发明的技术方案概述如下一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，包括如下步骤(I)固体培养取10_500yL保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌 (Gluconobacter oxydans)和10-500 μ L保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28_35°C,培养24h_48h ;⑵种子培养将经步骤(I)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在 28-350C，200-280rpm摇床振荡培养，24h_48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为 2 X 107-2 X 1010cfu/mL,使氧化葡糖杆菌的密度为 2 X 108-2 X 10ncfu/mL,在 28_35°C， 200-280rpm摇床振荡培养，以24h_48h为传代周期，以体积比为1% -10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天，在0-100或0-150天选3_5个取样时间取3_5个样；(3)分纯将步骤(2)获得的3-5个传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35°C培养24h-48h ;再分别转入种子培养基，在28_35°C，200_280rpm摇床振荡培养 24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；(4)发酵将所述进化了的巨大芽孢杆菌、进化了的氧化葡糖杆菌以及混合的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2X 107-2X 101QCfu/mL，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2 X 108_2 X 10ncfu/mL， 在 28-35°C，200-280rpm 摇床振荡培养 IOh-15h ；(5)细胞磷脂组的提取①取在步骤⑷摇床振荡培养10h-15h的三种细胞悬液100-200mL，1000-3000rpm 离心3-10min，去除上清液，保留细胞，用pH = 7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液洗细胞1_3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；②将步骤①所得细胞制成干粉，称取200-300mg细胞干粉，置于离心管A中，加入 O. 5-0. 8mL超纯水，充分混匀；③向离心管A中再加入2-4mL提取液，充分混匀；1000-3000rpm离心3-lOmin，使
溶液分层，取下层有机溶剂层，置于离心管B中；④重复步骤③2-4次，至细胞完全沉降；⑤向离心管B中，加入O. 8-1. 2mol/L KCl水溶液O. 5-1. 5mL，充分混勻， 2000-4000rpm离心3-10min,除去含水溶性杂质的上清；⑥再向离心管B加入l-3mL超纯水，充分混匀，2000-4000rpm离心3-lOmin，去上清；⑦蒸馏或氮气吹干步骤⑥所得混合物中的有机溶剂，得到总磷脂提取混合物；⑧将所述总磷脂提取混合物溶于O. 2-2mL储存液中制成样品，冷冻_40°C以下保存；⑨检测前，向所述样品内加入磷脂标准品，使磷脂标准品终浓度为O. 5-1. 5 μ g/ mL ；所述提取液是含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1-2 1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为O. 005-0. 01% ;所述储存液为含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1-4 1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为O. 005-0. 01% ;(6) LC-MS 检测采用LC-MS对步骤(5)获得的加入了磷脂标准品的样品进行检测，得到维生素C 生产菌株传代过程的磷脂组的分子结构和含量数据；(7)多元统计分析将步骤(6)获得的维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子含量数据，进行多元统计分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的差异磷脂分子标志物；(8)过程分析
将步骤(7)获得的差异磷脂分子标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些磷脂分子变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的磷脂分子及相关代谢途径，从而为以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。所述细胞制成干粉的方法优选为使用液氮在研钵内研磨细胞。所述步骤(5)⑦中所述蒸馏优选为30_40°C减压蒸馏。所述磷脂标准品为磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酸至少两种。所述磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰乙醇胺或磷脂酸的脂肪酸疏水尾长度为每条10-20个碳原子。所述LC-MS检测条件优选为色谱柱HypersilGOLD Silica,其规格为 150mmX 2. lmm, 5 μ m ;进样量IOyL;柱温25°C；流动相A(% ):氯仿(89. 5)，甲醇(10)，氢氧化铵(O. 5)；流动相B (% ):氯仿(55)，甲醇(39)，氢氧化铵(O. 5)，水(5. 5)；梯度程序0-7min，20-30% B ;7_15min 30-40 % B ；15-20min 40-50 % B ； 20-25min 50% B ；25-35min, 50-20% B ；35-45min, 20% B ；离子化方式ESI (负离子方式);扫描方式MSScan ；扫描范围m/z400-900 ；扫描速度1000scan/s;毛细管电压3KV;锥孔电压30V;萃取电压3V;离子源温度100°C;脱溶剂气温度350°C ；锥孔气流量50L/Hr脱溶剂气流量400L/Hr ；进/出口能量50;碰撞能量2 ；HM1/LM1/HM2/LM2 15. O ；IonEnergy I I. O ；Ion Energy 2:2.0。所述多元统计分析方法为Pareto预处理后进行主成分分析。本发明提供了一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的手段，这种手段涉及细胞总磷脂的提取和分析，多元统计方法分析所获得的磷脂组学数据，通过对不同传代数的维生素C生产菌株在单独和混合培养条件下的磷脂分子分别进行定性和定量分析， 找到与增强维生素C生产菌株两菌相互作用相关的磷脂分子和代谢途径的分析提供了方法，对以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化具有重要的意义。
2-2)； 5-2)；
图I为不同传代时间的巨大芽孢杆菌的磷脂含量变化；
图2为不同传代时间的巨大芽孢杆菌的主成分分析得分图(图2-1)和荷载图(图
图3为不同传代时间的巨大芽孢杆菌的磷脂分子标志物含量变化；
图4为不同传代时间的氧化葡糖杆菌的磷脂含量变化；
图5为不同传代时间的氧化葡糖杆菌的主成分分析得分图(图5-1)和荷载图(图
图6为不同传代时间的氧化葡糖杆菌的磷脂分子标志物含量变化；
图7为不同传代时间的混菌的磷脂含量变化；
图8为不同传代时间的混菌的主成分分析得分图(图8-1)和荷载图(图8-2)； 图9为不同传代时间的混菌的磷脂分子标志物含量变化。
具体实施例方式下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何限制。下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例I一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是包括如下步骤(I)固体培养取IOOyL保藏于体积浓度为20 %的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌 (Gluconobacter oxydans)和100 μ L保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,30°C,培养36小时；(2)种子培养将经步骤(I)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在 300C，240rpm摇床振荡培养，36h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2X108cfu/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2 X 101(lCfu/mL，在30°C，240rpm摇床振荡培养，以36h为传代周期，以体积比为5%为传代比接入新的种子培养基中，传代150天，分别在第O天、第50天、第100天和第150天取4个样；(3)分纯将步骤(2)获得的4个传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上， 30°C培养36小时；再分别转入种子培养基，在30°C，240rpm摇床振荡培养36h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；(4)发酵将进化了的巨大芽孢杆菌、进化了的氧化葡糖杆菌以及混合的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2X 108cfu/mL，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2 X 101(lCfu/mL，在30°C，240rpm摇床振荡培养13h ；(5)细胞磷脂组的提取①取在步骤(4)摇床振荡培养13h的三种细胞悬液150mL，2000rpm离心5min，去除上清液，保留细胞，用PH = 7. 3的磷酸盐缓冲液洗细胞2次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；②将步骤①所得三种细胞使用液氮在研钵内分别研磨制成干粉，每种称取250mg 细胞干粉，置于三支离心管A中，分别加入O. 6mL超纯水，充分混匀；③向三支离心管A中分别再加入3mL提取液,充分混勻；2000rpm离心5min,使溶液分层，取下层有机溶剂层，置于三支离心管B中；④重复步骤③3次，至三种细胞完全沉降；⑤向三支离心管B中，各加入I. Omol/L KCl水溶液I. OmL,充分混勻，3000rpm离心5min，除去含水溶性杂质的上清；⑥再向三支离心管B各加入2mL超纯水,充分混勻，3000rpm离心5min,去上清；⑦30°C减压蒸馏步骤⑥所得混合物中的有机溶剂，得到三种总磷脂提取混合物；⑧将三种总磷脂提取混合物溶于ImL储存液中制成样品，冷冻_40°C以下保存；⑨检测前，向三个样品内分别加入磷脂标准品，磷脂标准品为双十二烷酰磷脂酰甘油、双十二烷酰磷脂酰乙醇胺、十二烷酰溶血性磷脂酰乙醇胺和双十二烷酰磷脂酸，这四种憐脂标准品终浓度均为I. O μ g/mL ；所述提取液是含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1.5 1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.007% ;所述储存液为含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为2 1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.007% ;(6) LC-MS 检测采用LC-MS对步骤(5)获得的三个加入了磷脂标准品的样品进行检测，得到维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子结构见表I、表2和表3和含量数据见图I、图4和图7 ；LC-MS检测条件为色谱柱HypersilGOLD Silica,其规格为 150mmX 2. lmm, 5 μ m ;进样量10yL;柱温25°C;流动相A(% ):氯仿(89. 5)，甲醇(10)，氢氧化铵(O. 5)；流动相B (% ):氯仿(55)，甲醇(39)，氢氧化铵(O. 5)，水(5. 5)；梯度程序0-7min，20-30% B ;7_15min 30-40 % B ；15-20min 40-50 % B ； 20-25min 50% B ；25-35min, 50-20% B ；35-45min, 20% B ；离子化方式ESI (负离子方式)；扫描方式MSScan ；扫描范围m/z400-900 ；扫描速度1000scan/s;
毛细管电压3KV ；
锥孔电压30V ；
萃取电压3V ；
离子源温度100°C ;
脱溶剂气温度350 0C ；
锥孔气流量50L/Hr
脱溶剂气流量400L/Hr ；
进/出口能量50 ；
碰撞能量2 ；
HM1/LM1/HM2/LM2 15.O ；
IonEnergy 1:1.0;
Ion Energy 2 2.O ；
(7)多元统计分析
将步骤(6)获得的维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子含量数据，进行多
元统计分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的差异磷脂分子标志物；多元统计分析方法为Pareto预处理后进行主成分分析；见图2、图5和图8;(8)过程分析将步骤(7)获得的差异磷脂分子标志物的含量按照不同传代时间制成图表图3、 图6和图9，观察并分析这些磷脂分子变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的磷脂分子及相关代谢途径，从而为以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。表I巨大芽孢杆菌磷脂分子鉴定表
权利要求
1.一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是包括如下步骤(1)固体培养取10-500yL保藏于体积浓度为15-30 %的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌 (Gluconobacter oxydans)和10-500 μ L保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28_35°C,培养24h_48h ;(2)种子培养将经步骤(I)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35°C， 200-280rpm摇床振荡培养，24h_48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为 2X107-2X1010cfu/mL,使氧化葡糖杆菌的密度为 2X 108_2X 10ncfu/mL，在 28-35°C， 200-280rpm摇床振荡培养，以24h_48h为传代周期，以体积比为1% -10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天，在0-100或0-150天选3_5个取样时间取3_5个样；(3)分纯将步骤(2)获得的3-5个传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上， 28-35 °C培养24h-48h ;再分别转入种子培养基，在28-35 °C，200_280rpm摇床振荡培养 24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；(4)发酵将所述进化了的巨大芽孢杆菌、进化了的氧化葡糖杆菌以及混合的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2 X 107-2 X 1010cfu/mL,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2 X 108-2 X 10ncfu/mL,在 28-35°C，200-280rpm 摇床振荡培养 10h_15h ；(5)细胞磷脂组的提取①取在步骤(4)摇床振荡培养10h-15h的三种细胞悬液100-200mL，1000-3000rpm离心3-10min，去除上清液，保留细胞，用pH = 7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液洗细胞1_3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；②将步骤①所得细胞制成干粉，称取200-300mg细胞干粉，置于离心管A中，加入O.5-0. 8mL超纯水，充分混匀；③向离心管A中再加入2-4mL提取液,充分混勻；1000-3000rpm离心3_10min,使溶液分层，取下层有机溶剂层，置于离心管B中；④重复步骤③2-4次，至细胞完全沉降；⑤向离心管B中，加入O.8-1. 2mol/L KCl水溶液O. 5-1. 5mL，充分混匀，2000_4000rpm 离心3-10min，除去含水溶性杂质的上清；⑥再向离心管B加入l_3mL超纯水,充分混勻，2000-4000rpm离心3-10min,去上清；⑦蒸馏或氮气吹干步骤⑥所得混合物中的有机溶剂，得到总磷脂提取混合物；⑧将所述总磷脂提取混合物溶于O.2-2mL储存液中制成样品，冷冻_40°C以下保存；⑨检测前，向所述样品内加入磷脂标准品，使磷脂标准品终浓度为O.5-1. 5μ g/mL ；所述提取液是含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1-2 1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为O. 005-0. 01% ;所述储存液为含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1-4 1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.005-0.01% ;(6)LC-MS 检测采用LC-MS对步骤(5)获得的加入了磷脂标准品的样品进行检测，得到维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子结构和含量数据；(7)多元统计分析将步骤(6)获得的维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子含量数据，进行多元统计分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的差异磷脂分子标志物；(8)过程分析将步骤(7)获得的差异磷脂分子标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些磷脂分子变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的磷脂分子及相关代谢途径，从而为以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。
2.根据权利要求I所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述细胞制成干粉的方法为使用液氮在研钵内研磨细胞。
3.根据权利要求I所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述步骤(5)⑦中所述蒸馏为30-40°C减压蒸馏。
4.根据权利要求I所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述磷脂标准品为磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酸至少两种。
5.根据权利要求4所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰乙醇胺或磷脂酸的脂肪酸疏水尾长度为每条10-20个碳原子。
6.根据权利要求I所述的一种分析维生素C生产菌株磷传代过程脂组变化的方法，其特征是所述LC-MS检测条件为色谱柱Hypersil GOLD Silica,其规格为 1 SOmmX 2. 1mm, 5 μ m ;进样量10yL;柱温25°C ；流动相A(% ):氯仿(89. 5)，甲醇(10)，氢氧化铵(O. 5)；流动相B(% ):氯仿(55)，甲醇(39)，氢氧化铵(O. 5)，水(5. 5)；梯度程序0-7min，20-30 % B ;7-15min 30-40 % B ；15-20min 40-50 % B ；20-25min 50% B ；25-35min, 50-20% B ；35-45min, 20% B ；离子化方式ESI (负离子方式)；扫描方式MS Scan ；扫描范围m/z 400-900 ；扫描速度1000scan/s ；毛细管电压3KV ；锥孔电压30V ；萃取电压3V ；离子源温度100°C ;脱溶剂气温度350°C ；锥孔气流量50L/Hr 脱溶剂气流量400L/Hr ；进/出口能量50 ；碰撞能量2 ；HM1/LM1/HM2/LM2 15.O ；IonEnergy 1:1.0;Ion Energy 2 :2·O。
7.根据权利要求I所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述多元统计分析方法为Pareto预处理后进行主成分分析。
全文摘要
本发明公开了一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，包括如下步骤(1)固体培养取氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌分别接种于固体培养基上，培养；(2)种子培养(3)分纯；(4)发酵；(5)细胞磷脂组的提取；(6)LC-MS检测；(7)多元统计分析；(8)过程分析；本发明通过对细胞总磷脂的提取和分析，多元统计方法分析所获得的磷脂组学数据，对不同传代数的维生素C生产菌株在单独和混合培养条件下的磷脂分子分别进行定性和定量分析，找到与增强维生素C生产菌株两菌相互作用相关的磷脂分子和代谢途径的分析提供了方法，对以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化具有重要的意义。
文档编号C12Q1/02GK102586386SQ201210044060
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者元英进, 吕亚金, 杨洁, 胡梦龙, 邹旸 申请人:天津大学