专利名称：基于pcr的玉米半粒种子dna快速提取方法
技术领域：
本发明涉及一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，属于分子生物技术领域， 具体涉及玉米半粒种子DNA快速提取，提取后的DNA适用于PCR扩增。ニ背景技术：
目前，植物DNA提取已经发展了很多方法，可以从植物叶片、果实和种子等组织器官中提取DNA，但大多数方法提取时间较长，这些方法大多应用于科学研究，难以应用于快速检测领域。在提取植物DNA的过程中，需要根据植物组织材料的外在性质(来源、部位、形态等)和内在特点(化学成分、组织结构等)的差异，选择适宜的方法或作ー些特殊的处理。传统的DNA提取方法(SDS法和CTAB法)是在裂解细胞的基础上，用等体积的酚氯仿或酚氯仿异戊醇(25:24:1)抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，核酸留在水相，从而达到分离核酸的目的；加入RNA酶可以去除RNA ;然后加入异丙醇或こ醇沉淀DNA ;用70%こ醇漂洗沉淀，去除残留的有机溶剂和盐离子，以免影响DNA溶解和后续实验，最后用TE或ddH20 溶解DNA备用。自从SDS法和CTAB法报道以来，国内外很多学者对这两种方法作了许多改迸。经典的DNA提取方法不需要昂贵的仪器和药品，提取的DNA能够满足一般分子生物学研究的需要，已成为分子生物学实验室提取DNA最常用的方法。但这些方法也存在着很多不足，如操作步骤复杂、耗时长、易交叉污染、苯酚和氯仿等有机溶剂易造成环境污染并且有损操作者健康等。今后，DNA提取方法研究的发展方向①用无毒的有机溶剂或无机溶剂代替有毒的有机溶剂；②简化操作步骤，朝着批量提取的方向发展提取过程朝着自动化方向发展，将DNA提取与其他分子生物学技术(毛细管电泳、基因芯片技术等)相结合， 实现从样品处理到分析的过程全部自动化。由于目前的DNA提取方法提取时间较长，在短时间内不能进行基于PCR的大量样品的检测，难以在基于PCR的快速检测中应用。为了突破DNA提取时间较长这个瓶颈，国内外很多研究者加入了 DNA提取研究的行列，并取得了ー些成绩。近年来有很多DNA快速提取方法的报道，提取时间缩短了很多，少数方法可以用于快速检测，但提取速度还不是很快，有待进ー步加快。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法。一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取技木，是先将玉米种子沿胚纵切，取含有胚的半粒种子放入I. 5mL离心管中，再加入200ii L 1000 y L提取液，所述的提取液为 0. 03M 0. 2M氢氧化钾(K0H)或氢氧化钠(NaOH)溶液，提取时间Imin 48h，混匀提取液，混匀后的提取液即为DNA样品，用于PCR扩增。用于PCR扩增时DNA模板量为0. 5 y L 5u L,综合考虑DNA样品中杂质含量和加样的操作方便性，通常优先选择2 ii L作为DNA模板。本发明提取过程简便，不研磨、不离心、不转管、不使用有毒试剂，最主要的是提取速度非常快。用SSR引物对该方法提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物用9%PAGE (聚丙烯酰胺凝胶)检测，结果显示PCR扩增产物良好。
四
图I提取液浓度和体积对PCR扩增产物的影响(材料郑单958)
由图I可知，PCR扩增产物主要受提取液浓度影响，提取液体积200 ii L 1000 ii L的样品间差异不显著。提取液浓度0. 01 0. 02M的样品有较弱的目标带，0. 03 0. 05M的样品有中等売度的目标带，0. 06 0. 2M的样品有清晰的目标带，0. 3M的样品无目标带。图2提取时间对PCR扩增产物的影响
由图2可知，提取Imin 48h的样品间差异不显著，提取3d的样品目标带亮度开始减弱，提取4d的样品目标带已经很弱。图3 DNA模板量对PCR扩增产物的影响
由图3可知，各处理间差异不显著，说明该方法有很宽的DNA模板量适应范围。图4不同公司的Mix对PCR扩增产物的影响(材料郑单958)
由图4可知，提取液浓度0. 01 0. 02M的样品，两个公司的Mix都扩增出较弱的目标带；提取液浓度0. 03 0. 05M的样品，两个公司的Mix都扩增出中等亮度的目标带；但 BioTeke公司的Mix对提取液浓度为0. 06M 0. 20M的样品的扩增都显示很亮的目标带，而天根公司的Mix对提取液浓度为0. 06M 0. IOM的样品扩增显示很亮的目标带，0. 02M的样品就已经开始不出带；提取液浓度为0. 3M的样品两个公司的Mix都未扩增出目标带。图5提取液浓度0. 03M,提取液体积500ml的PCR扩增产物
有图5可知，提取液浓度0. 03M，提取液体积500ml，提取lOmin，能保证得到较好的PCR 产物。图I、图4中图上方是对应的提取液(KOH溶液)浓度编号1 2:0.01M;3 4: 0. 02M ;5 6 0. 03M ;7 8 0. 04M ；9 10 :0. 05M ；11 12 0. 06M ;13 14 0. 07M ；15 16 :0. 08M ；17 18 :0. 09M ；19 20 :0. IM ；21 22 :0. 2M ；23 24 :0. 3M。图2中图上方是对应的提取时间编号1 2 =Imin ;3 4 5min ;5 6 =IOmin ； 7 8 20min ；9 10 :40min ；11 12 60min ；13 14 12h ；15 16 24h ；17 18 36h ； 19 20 48h ；21 22 :3d ；23 24 4d
图3中图上方是对应的DNA模板量编号(I 12:郑单958) : I 2 :0. 5 y L ;3 4 : luL;5 6 :2uL;7 8 :3uL;9 10 4 u L ；11 12 :5uL。图5中图上方1、2、3、4对应4个重复。图I中图左侧是对应的提取液体积。图2中图左侧是对应的玉米品种。图4中图左侧是对应的提供Mix的公司。图 3 中Marker 的大小(从上到下)200bp, 180bp, 160bp, 140bp, 120bp, IOObp0五具体实施例方式
以玉米商品种子(郑单958、先玉335)为材料，通过实施例对本发明做进ー步的描述。实施例统ー采用20 ii L PCR扩增体系，具体组分及程序如下(引物phi065 ；Mix 北京BioTeke公司、北京天根公司)。取2 y L PCR扩增后产物，浓度9%PAGE电泳检测。本发明中的所述的浓度单位M是指摩尔浓度mol/L。
权利要求
1.一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，其特征在于先将玉米种子沿胚纵切，取含有胚的半粒种子放入I. 5mL离心管中，再加入200 μ L 1000 μ L提取液，所述的提取液为O. 03Μ O. 2Μ氢氧化钾KOH或氢氧化钠NaOH溶液，提取时间Imin 2d，混匀提取液，混匀后的提取液即为DNA样品，用于PCR扩增时DNA样品模板量为O. 5 μ L 5 μ L。
2.根据权利要求I所述的一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，其特征在于用于PCR扩增时所述的DNA样品模板量为2 μ L。
全文摘要
本发明涉及一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，是将玉米种子纵切，取一半(必须含有胚)放入1.5mL离心管中，加入500μL提取液(0.03mol/L～0.05mol/LKOH或NaOH溶液)，提取1min～48h，混匀，即为DNA提取液样品。取0.5～5μL该DNA样品可以直接用于PCR扩增，该方法的主要用途是玉米种子纯度或GMO高通量检测，和基于PCR的玉米种子DNA快速提取主要用于玉米种子DNA的快速提取，提取后的DNA满足PCR扩增。
文档编号C12N15/10GK102586230SQ20121005253
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者张春庆, 温大兴 申请人:山东农业大学