专利名称：选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂及其制备方法。具体地说是在使用混合抑菌剂两性霉素B、萘啶酮酸、万古霉素、TMP基础上添加乳酸链球菌素 (Nisin)抑制杂菌生长。本发明还涉及该混合抑菌剂的制备方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种弯曲状的革兰阴性杆菌，是引起消化道炎症、溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的主要致病菌，与胃癌的发生直接相关，被国际卫生组织列为一级致癌因子。全世界约50%人群的胃粘膜有Hp感染，如何根除 HP所致的消化系统疾病已成为消化界学者关注的焦点。HP的生长条件要求非常苛刻，培养过程繁琐、培养设备复杂、昂贵、培养技术要求高，杂菌生长多，给研究HP带来很大的困难。目前对于幽门螺杆菌培养方法报道较多，HP的分离培养阳性率与培养基、气体、 仪器、操作技术等有关。HP生长营养要求高，在一般的培养基上不生长，必须在营养丰富且加有血液的培养基上才可生长。常用的有血培养基哥伦比亚琼脂(CBA)、BHI、巧克力琼脂、skirrow、空肠弯曲菌培养基等基础上加5% -10%绵羊血(马血或兔血)、两性霉素B、 多粘菌素B、盐酸万古霉素、TMP以抑制杂菌生长。血液易污染、不便保存、来源受限，目前已研制出无血培养基用环糊精，卵黄、水解酪蛋白、西红柿汁、酵母提取物和马血清替代血液的HP分离培养基。不同的培养基其分离培养效果不同初步分离胃黏膜标本的HP阳性率含7%脱纤维鲜马血的BHI培养基为96%，卵黄琼脂为64%，含环糊精的CBA血琼脂为32%。液体培养基常常由于气体条件难于满足而对培养设备要求高，培养过程复杂。目前HP分离培养基也从无血代替有血、从固体往液体发展。
HP生长的气体条件苛刻，在空气中、无氧条件都不生长，一般采用5% 0 2、10% CO2, 85%队，有些地区还要加5%!12。湿度约为90%。最适生长温度为371，低于271高于421 均不生长。HP在协迫条件下容易发生变异菌体从弯曲杆菌变为球型、丝状型。球型变一般呈非可培养状态，L型、丝状体一般难于再培养。协迫条件包括培养时间延长、培养基水份、营养成分损失、培养基在空气中放置时间过长、气体条件不适、温度不适、抗生素作用等不适宜HP生长的条件。其培养效果取决于气体、湿度、温度是否最适宜HP生长。经查阅文献，对于分离培养幽门螺旋杆菌常用的抑菌剂为单一的两性霉素B、多粘菌素B、盐酸万古霉素、TMP或其组合物。乳酸链球菌素(Nisin)又称乳链菌肽或尼生素，是从乳酸链球菌发酵产物中提取的一类多肽类化合物，由34个氨基酸残基组成。它能有效地抑制致使食品腐败的革兰氏阳性菌的生长和繁殖，特别是对耐热性芽孢杆菌、肉毒梭菌、李斯特菌及其所产生的芽孢有强烈的抑制效果，可用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐装食品等的防腐保鲜。由于乳酸链球菌素是一种多肽，进入人体后易被植物蛋白酶分解，因此是一种安全、无毒、高效的天然食品防腐剂。对于Nisin (乳酸链球菌素)的应用，大多数文献报道都用于食品防腐，至今未见用于幽门螺旋杆菌杂菌抑制剂的报道。本发明是在使用混合抑制剂两性霉素B、萘啶酮酸、万古霉素、TMP基础上添加乳酸链球菌素抑制杂菌生长。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂，以解决幽门螺杆菌培养生长条件要求苛刻，培养过程繁琐、培养技术要求高，杂菌生长多的问题。本发明的另一目的是提供所述选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂制备方法。实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
一种选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂，其配方组成为万古霉素3 50 mg/1， 萘啶酮酸 5 10. 0 mg/l，TMP3 5. 0 mg/1，两性霉素 1 2. 0 mg/1, Nisin 8 10 mg/1。进一步，所述选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂的制备方法，主要包括下列步骤
1)培养基的配制
培养基配方930 ml/1脑心浸液培养基，80 ml/1胎牛血清，1. 0 g/li3_CD，0.04 g/1 TTC (四氮唑红)，pH 7. 2-7. 4 ；
1. 1)按上述配方配制好培养基，装入500 ml锥形瓶(300ml/瓶)，用封口膜将瓶口封紧，121°C高压消毒15 30 min，待高压锅压力降至0后，取出培养瓶，自然冷却；
1. 2)解冻绵羊血，56°C、30 min灭活补体(为防止多次开启，可用小瓶分装成10 ml小包装于-20°C保存备用)；
1.3)将步骤1. 1)冷却至40°C左右的上述培养基倒入无菌培养皿中，加入预先配制好的选择性抗生素(万古霉素3-50 mg/1，萘啶酮酸5-10. 0 mg/l，TMP3_5· 0 mg/1，两性霉素 1-2.0 mg/1, Nisin 8-10 mg/1)和步骤 1. 2)解冻的绵羊血(8% 10%) (ml/100ml,体积分数)；再将该无菌培养皿放置15 30 min,自然凝固后尽快封闭培养基，为防止污染，瓶口开启时间尽可能短。；
2)细菌接种与培养
2.1)用吸管吸取0. Iml HP菌悬液，滴于步骤1. 3)的固体培养基上，用L形棒涂开；
2. 2)将步骤2. 1)已接种好的培养皿放入厌氧培养罐，盖紧顶口，使用气体发生袋；或采用抽气换气法，将培养罐内气压抽至O或接近0，立即冲入混合气体(5% O2,10% CO2，85% N2 )，冲混合气体的速度不能太快，以免杂菌充入污染，侧口处塞一灭菌棉花团，可防止污染；
2. 3)将步骤2. 2)培养罐置于37°C恒温箱中培养，72 h后观察菌落生长情况；HP生长的最佳湿度>90%，为保证培养基的湿度，可在培养罐中放入装有适量水的小烧杯，以维持培养基湿度；
3)细菌的保存选取对数生长期(一般为培养48h)的HP进行保存；用接种环刮取培养菌于保存液中， 调整细菌浓度(IXlO8 IXlO9CFU / ml)，保存液基质为脑心浸液和100%甘油；将菌液分装至0.5 ml Ep管中，每管0.2 0.3 ml，置_70°C或液氮中保存。相比现有技术，本发明具有如下有益效果
I、本发明制备以两性霉素B、萘啶酮酸、万古霉素、TMP及Nisin的混合抑菌剂，在培养基中加入混合抑菌剂不但能减少枯草杆菌、革兰阳性球菌、霉菌等杂菌的污染，同时又能提供HP生长所需的胸腺嘧啶脱氧核苷抑制杂菌生长。II、本发明抑菌剂与现有文献资料的抑菌剂相比，加入Nisin后明显提高了抑菌效果
A、两性霉素1-2.0 mg/1、万古霉素 3-50 mg/1、萘啶酮酸 5-10 mg/1、ΤΜΡ3_5· 0 mg/1、 多粘菌素B 5-10 mg/1,有杂菌生长，抑制杂菌效果不明显；
B、两性霉素1-2.0 mg/1、万古霉素 3-50 mg/1、萘啶酮酸 5-10. 0 mg/1、TMP3-5. 0 mg/ 1、Nisin 5-10 mg/1,无杂菌生长，抑制效果明显。
图1为未加抑菌剂空白培养皿照片。图2为A组抑菌剂培养HP结果照片。图3为B组抑菌剂培养HP结果照片。
具体实施例方式为表明本发明提高HP阳性率的效果，通过以下实施例对本发明进行进一步说明。选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂，其配方组成为万古霉素3 50 mg/1, 萘啶酮酸 5 10. 0 mg/l，TMP3 5. 0 mg/1，两性霉素 1 2. 0 mg/1, Nisin 8 10 mg/1。表1:(单位mg/1)
权利要求
1.一种选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂，其特征在于，其配方组成为万古霉素 3 50 mg/1，萘啶酮酸5 10. 0 mg/1，TMP3 5. 0 mg/1，两性霉素 1 2. 0 mg/1, Nisin 8 10 mg/1。
2.根据权利要求1所述选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂的制备方法，其特征在于，主要包括下列步骤1)培养基的配制培养基配方930 ml/1脑心浸液培养基，80 ml/1胎牛血清，1. 0 g/li3_CD，0.04 g/1 TTC, pH 7· 2 7· 4 ；·1. 1)按上述配方配制好培养基，装入500 ml锥形瓶(300ml/瓶)，用封口膜将瓶口封紧，121°C高压消毒15 30 min，待高压锅压力降至0后，取出培养瓶，自然冷却；·1.2)解冻绵羊血，56°C、30 min灭活补体；·1.3)将步骤1. 1)冷却至40°C左右的上述培养基倒入无菌培养皿中，加入预先配制好的选择性抗生素和步骤1. 2)解冻的绵羊血8 lOml/lOOml ；再将该无菌培养皿放置15 30 min，自然凝固后尽快封闭培养基；其中，选择性抗生素配方为万古霉素3 50 mg/ 1、萘啶酮酸 5 10. 0 mg/1、TMP3 5. 0 mg/1、两性霉素 1 ·2. 0 mg/1 和 Nisin 8 10 mg/1 ；2)细菌接种与培养·2.1)用吸管吸取0. Iml HP菌悬液，滴于步骤1. 3)的固体培养基上，用L形棒涂开；·2. 2)将步骤2. 1)已接种好的培养皿放入厌氧培养罐，盖紧顶口，将培养罐内气压抽至0或接近0，立即冲入混合气体；其中，混合气体为5% O2,10% CO2和85% N2 ；·2. 3)将步骤2. 2)培养罐置于37°C恒温箱中培养，72 h后观察菌落生长情况；HP生长的最佳湿度>90% ；3)细菌的保存选取对数生长期的HP进行保存；用接种环刮取培养菌于保存液中，调整细菌浓度为 IXlO8 IXlO9CFU / ml，保存液基质为脑心浸液和100%甘油；将菌液分装至0.5 ml Ep 管中，每管0.2 0.3 ml，置-70°C或液氮中保存。
全文摘要
本发明提供一种选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂，其配方组成为万古霉素3～50mg/l，萘啶酮酸5～10.0mg/l，TMP3～5.0mg/l，两性霉素1～2.0mg/1,Nisin8～10mg/1。所述选择性培养幽门螺旋杆菌的混合抑菌剂的制备方法，主要包括下列步骤培养基的配制、细菌接种与培养和细菌的保存。本发明以两性霉素B、萘啶酮酸、万古霉素、TMP及Nisin的混合抑菌剂，在培养基中加入混合抑菌剂不但能减少枯草杆菌、革兰阳性球菌、霉菌等杂菌的污染，同时又能提供HP生长所需的胸腺嘧啶脱氧核苷抑制杂菌生长。
文档编号C12R1/01GK102559565SQ201210058230
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者乐亮, 刘红, 周慧, 张云玲, 林海珠, 江娟, 王宁, 王琳琳, 胡少南, 胥秀英, 郑一敏 申请人:重庆理工大学