包含mda-7的组合物和方法

专利名称：包含mda-7的组合物和方法
包含MDA-7的组合物和方法本申请是国际申请号为PCT/US2004/006147、国际申请日为2004年3月2日、进入中国国家阶段的申请号为CN 200480005918. X、发明名称为“包含MDA-7的组合物和方法”的中国专利申请的分案申请。
背景技术：
本申请要求与本发明具有同样的名称和发明人的2003年3月3日提交的美国专利申请No. 60/452，257，2003年5月30日提交的美国专利申请No. 60/474，529，2003年6月4日提交的美国专利申请No. 60/476，159，2003年7月11日提交的美国专利申请No. 60/486，862，2003 年 10 月 29 日提交的美国专利申请 No. 60/515，285，2003 年 12 月 10日提交的美国专利申请No. 60/528, 506的优先权。这些申请的各个内容完整地本文引入作为参考。美国政府依据国立癌症研究所授予本发明的基金CA86587，R41CA88421， P01CA78778, P01CA06294, CA70907 和 P30CA16672 而拥有本发明的权利。
A.发明领域本发明总地涉及分子生物学和基因治疗领域。更具体地说，本发明涉及治疗癌症和其它新生血管形成相关病症(抗新生血管形成治疗)的诊断、预后和治疗性组合物和方法。本发明还涉及MDA-7的纯化方法以及含纯化MDA-7的组合物。B.相关领域所述I.新生血管形成(angiogenesis)血管通过两个过程构建脉管生成，由此在从多能间质前体细胞的胚胎发生过程中建立了原始血管网络；和新生血管形成，在此过程中已存在的血管发出毛细管芽产生新的血管。内皮细胞在每个过程都扮演主要角色。它们迁移、增殖然后以紧密的细胞-细胞连接组装成血管(Hanahan，1997)。当内皮细胞释放的酶和白细胞开始侵蚀基底膜时，在内皮细胞周围发生新生血管形成使内皮细胞突出于基底膜。然后这些内皮细胞响应血管原性刺激开始迁移，形成血管分枝，并且继续增殖直到这些分枝互相融合形成新的血管。通常，人类和动物中新生血管形成只在很有限的几种情况下发生，例如胚胎发育、伤口愈合以及黄体、子宫内膜和胎盘的形成。然而，异常的新生血管形成与包括癌转移在内的很多疾病相关。事实上，普遍认为肿瘤的生长依赖于血管生成过程的。因此，增加或降低新生血管形成的能力分别对临床状况例如伤口愈合(例如移植存活)或癌症治疗有重要的意义。现有几方面的直接证据表明新生血管形成对于实体瘤的生长维持及其转移是必须的(FoIkman, 1989 ；Hon 等，1991 ；Kim 等，1993 ；Millauer 等，1994)。为了刺激新生血管形成，肿瘤上调它们多种血管原性因子的产生，包括成纤维细胞生长因子(FGF和DTCF)(Kandel等，1991)和血管内皮细胞生长因子/血管渗透性因子(VEGF/VPP)的产生。然而，很多恶性肿瘤也产生新生血管形成抑制因子，包括血管抑素(血管抑素)和血小板反应素(Chen等，1995 ；Good等，1990 ;0，Reilly等，1994)。推测血管原性表型是这些新生血管形成的正调控因子和负调控因子之间净平衡的结果(Good等，1990 ;0’ Reilly等，1994 ；Parangi等，1996 ;Rastineiad等，1998)。已鉴定到其它几种新生血管形成的内源性抑制齐U，虽然不是所有这几种都与肿瘤的存在相关。这些抑制剂包括，血小板因子4 (Gupta等，1995 ;Maione等，1990),干扰素-α，白细胞介素和/或干扰素-Y诱导的(Voest等，1995)干扰素诱导蛋白质 10 (Angiolillo 等，1995 ；Strieter 等，1995)，gro- β (Cao 等，1995)，以及催乳素16kDa的N-末端片段(Clapp等，1993).2.新生血管形成相关疾病本发明的方法可用于治疗内皮细胞相关疾病和病症。尤其重要的内皮细胞过程是新生血管形成，即上述的血管形成。利用本发明所述的方法抑制内皮细胞增殖可能能够治疗新生血管形成相关疾病。新生血管形成相关疾病包括，但不限于，新生血管形成依赖性癌症，包括例如，实 体瘤,血源性肿瘤例如白血病，以及肿瘤转移；良性肿瘤,例如血管瘤，听神经瘤,神经纤维瘤,沙眼，以及脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管原性疾病,例如,糖尿病视网膜病变，早熟性视网膜病，黄斑变性，角膜移植排异，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生，虹膜发红Asler-Webber综合征；心肌新生血管形成；斑块新生新生血管形成；毛细管扩张症；血友病关节；血管纤维瘤；以及创伤性肉芽肿。本发明的内皮细胞增殖抑制方法可用于内皮细胞过分或异常刺激疾病的治疗。这些疾病包括，但不限于，肠粘连，动脉粥样硬化.硬皮病，以及肥厚性瘢痕，即瘢痕瘤.它们还可用于治疗以新生血管形成为病理结果的疾病，例如猫抓伤疾病(Rochele minalia quintosa)和溃瘍(Helobacter pylori)。3.癌症正常组织内环境的稳定是一种细胞增殖和死亡高度协调的过程。这种平衡一旦被破坏可能发展成为生癌状态(Solyanik等，1995 ;Stokke等，1997 ;Mumby和Walter, 1991 ；Natoli等，1998 ;Magi_Galluzzi等，1998)。例如，宫颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌和脑癌就是这种结果导致的许多癌症中的几种(Erlandsson, 1998 ；Kolmel, 1998 ;Mangray和King, 1998 ；Mougin等，1998)。事实上，肿瘤的发生率很高，仅美国每年死于肿瘤的人数就超过 500，000。原癌基因至少部分地调节细胞增殖和细胞死亡的维持。原癌基因可编码诱导细胞增殖的蛋白质(例如，sis, erbB, src, ras和myc),抑制细胞增殖的蛋白质(例如，Rb, pl6,pl9，p21，p53，NFl和WTl)或调节程序性细胞死亡的蛋白质(例如，bcl_2) (Ochi等，1998 ；Johnson和Hamdy, 1998 ；Liebermann等，1998)。然而,这些原癌基因的遗传重排或突变可能导致原癌基因转变为强烈致癌的癌基因。常常，单点突变就足以使原癌基因转化为癌基因。例如，P53肿瘤抑制蛋白中的点突变可导致野生型p53功能完全丧失(Vogelstein和Kinzler, 1992 ；Fulchi等，1998)并获得显性的肿瘤促进功能。当前，对于许多普通类型的肿瘤来说几乎没有有效的治疗方案可供选择。不同个体的治疗方案取决于病人的诊断、疾病的发展阶段以及年龄、性别和健康状况等因素。最常规的癌症治疗方案选择是手术治疗、放射治疗和化疗。手术在癌症的诊断和治疗中起着王要作用。一般，需要手术方法来进行活体检查和切除癌生长物。然而，如果癌症已经转移和广泛扩散，手术不可能治愈，必须采取另外的方法。放疗、化疗和免疫治疗是手术治疗的替代方案(Mayer，1998 ；Ohara, 1998 ;Ho等，1998)。放射治疗包括高能放射的精确瞄准以摧毁癌细胞，与手术很相似，它主要在治疗未转移的局部癌细胞时有效。放射治疗的副作用包括皮肤刺激、吞咽困难、口干、恶心、腹泻、脱发和丧失精力(Curran，1998 ；Brizel, 1998)。化疗，用抗癌药物治疗癌症，是癌症治疗的另外一种方式。抗癌药物治疗的有效性通常会因为药物难以输送到达实体瘤内而受到限制(el-Kareh和SeComb，1997)。化疗策略依据肿瘤组织生长，其中抗癌药物靶向于快速分裂的癌细胞。大多数化疗方法包括一种以上抗癌药物的联合应用，已证明这样可增加各种癌症的反应率(美国专利5，，824，348 ；美国专利5，633，016和美国专利5，798，339，本文引入作为参考)。化疗药物的主要副作用是它们也影响正常的组织细胞，最可能受影响的细胞是快速分裂的细胞(例如，骨髓、胃肠道、生殖系统和毛囊)。化疗药物的其它毒副作用为口腔溃疡、吞咽困难、口干、恶心、腹泻、呕吐、疲劳、出血、脱发和感染。免疫疗法，癌症研究中一个进展快速的领域，也是治疗某些类型癌症的可选方案。例如，免疫系统可以将肿瘤细胞识别为外源物质，因此肿瘤细胞成为免疫系统摧毁的目标。 不幸的是，免疫应答一般不足以阻止大多数肿瘤的生长。但是，免疫治疗领域最近的研究集中在开发能增强或补充免疫系统天然防御机制的方法。最近正在研究或应用的免疫治疗的例子是免疫佐剂(如牛型结核杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美国专利 5，801，005 ;5，739，169 ；Hui 和 Hashimoto, 1998 ；Christodoulides 等，1998)，细胞因子治疗(如干扰素，IL-LGM-CSF 和 TNF) (Bukowski 等，1998 ；Davidson 等，1998 ；Hellstrand等，1998)和基因治疗(如 TNF、IL-U IL-2、p53) (Qin 等，1998 ;美国专利 5, 830, 880 和5，846，945)以及单克隆抗体(如抗神经节苷脂GM2抗体、抗HER-2抗体、抗pl85抗体)(Pietras 等，1998 ；Hanibuchi 等，1998 ;美国专利 5，824，311)。4.基因治疗基因治疗是生物医药研究中一个新出现的领域，其焦点集中在通过将治疗性重组核酸导入患者的体细胞内而治疗疾病。现在有多项基因治疗的临床试验已开始进行，其中包括各种癌症、AIDS、囊性纤维化、腺苷脱氨酶缺乏症、心血管疾病、Gaucher病、类风湿性关节炎等的治疗。目前，腺病毒是运送基因治疗药物的优选运载体。利用腺病毒作为基因治疗药物的优点在于其转导效率高、能感染非分裂细胞、其基因组易于操作以及与宿主基因组发生非同源重组的概率低。5.细胞因子IL-IO是免疫系统细胞和一些肿瘤细胞产生的多效性同型二聚体细胞因子(Howard等，1992 ;Ekmekcioglu等，1999)。其免疫抑制功能包括对促炎性细胞因子包括IFNY、TNF α和IL-6合成的强烈抑制(De Waal Malefyt等，1991)。IL-10样细胞因子家族由lq32染色体上一个很小的195kb基因簇编码，由一些与IL-IO结构和序列同源的细胞蛋白质(IL-10, IL-19, IL-20,MDA-7)组成(Moore 等，1990 ;Kotenko 等，2000 ;Gallagher 等，2000 ；Blumberg 等，2001 ；Dumoutier 等，2000 ；Knapp 等，2000 ； Jiang 等，1995a ； Jiang 等，1996)。MDA-7已被鉴定为IL-10家族成员，也称为IL-24。染色体定位、转录调控、小鼠和大鼠同源物表达以及推定的蛋白质结构都暗示MDA-7 是细胞因子(Knapp 等，2000 ；Schaefer 等，2000 ；Soo 等，1999 ；Zhang 等，2000)。与GM-CSF, TNF α，和IFN Y的转录物类似，它们在其3’ UTR中都含有靶向mRNA使其快速降解的富含AU的元件，MDA-7在其3’ UTR有三个AREs (Wang等，2002)。已在人PBMC中鉴定到Mda-7mRNA (Ekmekcioglu等，2001)，虽然以前没有人MDA-7蛋白具有细胞因子功能的报道，但根据其基因和蛋白序列的特征，MDA-7已被命名为IL-24(NCBI数据库登录号XM001405)。鼠MDA-7蛋白同源物FISP (IL-4-诱导的分泌蛋白)已报道为是Th2特异性的细胞因子(Schaefer等，2001)。如敲除研究所证实的，TCR和IL-4受体的结合及随后的PKC和STAT6活化可诱导FISP的转录。已分析了 FISP的表达特征，但还没有发现这个推定的细胞因子的功能。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)与mda_7基因有78%的同源性，已证实与伤口愈合有关(Soo等，1999 ;Zhang等，2000)。Mob_5也是一种分泌蛋白，鉴定为在大鼠转化细胞上的一种可能的细胞表面受体(Zhang等，2000)。因此，可在各物种中表达和分泌mda-7基因和MDA-7分泌蛋白的同源物。但是，没有数据显示MDA-7具有细胞因子活性。这种活性可通过促进治疗性免疫应答反应或增强抗原的免疫原性用于治疗各种疾病和感染。发明概述 本发明涉及纯化MDA-7的方法和纯化的MDA-7，以及含MDA-7蛋白质或编码MDA-7的核酸在治疗和预防性治疗以及诊断试验中应用的方法和组合物。本文提供了纯化MDA-7的多种实施方式。在有些实施方式中，纯化的MDA-7是人MDA-7，可以是全长的、截短的或其片段。在其它实施方式中，MDA-7来自其它动物或来源，例如其它哺乳动物，包括小鼠、大鼠和猴子。在一些实施方式中，MDA-7是糖基化的，而在另外的实施方式中MDA-7是非糖基化的。有些情况下，MDA-7缺少其信号序列，有些情况下，它具有异源信号序列。所有这些MDA-7多肽都可通过本发明的方法纯化。本文所述的纯化方法产生纯度至少约20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，最高约 100%均一的 MDA-7 蛋白质。或者，将MDA-7蛋白质纯化到至少或至多约20% -95%,30% -90%,40% -80%,50% -75%,20% -50%, 50% -70%, 50% -90%, 70% -90%以及其中的范围。术语“均一性”具有蛋白质纯化领域技术人员所知的通常含义并可理解为指特定蛋白质的纯度水平。当与百分数连用时，指与蛋白质总量相比较时MDA-7蛋白质所占的百分比(以分子)。术语“均一的”是指均一水平的形容词。术语“约”指蛋白质量测定的不精确性，意思包括任何具体试验的至少一个标准差或对测定的蛋白质浓度的校准。例如，如果通过凝胶电泳以考马斯(coomassie)凝胶染色来测定蛋白质浓度和均一性，将MDA-7纯化到至少约25%均一性指置于凝胶上的样品与该分子的总蛋白质浓度比较，是至少25%的MDA-7加减考马斯染料染色的蛋白质凝胶的标准差。此外，预计纯化的MDA-7组合物可能含有20 %，25 %，30 %，35 %，40 %，45 %，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，最高约 100%活性的 MDA-7 蛋白质。在药理或药学上可接受的溶液或组合物的情况下，就均一性而言提到MDA-7纯度时指，与任何污染蛋白质相比较该溶液或组合物中有多少比例是MDA-7，此处污染蛋白质指不想要的或不需要的蛋白质。这种区别意味着排除有意加入该溶液或组合物中的蛋白质的浓度，例如用于诱导针对MDA-7免疫应答反应的免疫原性多肽的蛋白质浓度。在本发明的很多实施方式中，纯化的MDA-7蛋白质是活性蛋白。术语“活性”通常指纯化的MDA-7蛋白质具有MDA-7的一些活性。这可以用百分比来定量衡量，在一些实施方式中，通过测定MDA-7活性的任何具体试验，纯化的MDA-7蛋白质至少约10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，最高约100%具有对照MDA-7多肽一样的活性。这种活性可定义为包括但不限于下列任何一种结合活性，功能活性(包括但不限于诱导凋亡，抑制新生血管形成或诱导抗新生血管形成，结合IL-22，激活STAT3，调节PKR，诱导免疫应答反应的能力)，翻译后修饰的能力(糖基化)，形成正确的三级结构的能力，正确定位的能力。纯化MDA-7蛋白质的方法包括很多可单独使用或相互组合使用的步骤。可从表达重组MDA-7或非重组MDA-7 (例如，从内源表达MDA-7的基因组基因)的细胞中纯化得到MDA-7。对于表达重组MDA-7的细胞，宿主细胞型在MDA-7翻译后是否修饰中起作用。在具体的实施方式中，利用能使MDA-7糖基化的真核细胞作为宿主细胞或MDA-7蛋白质的细胞来源。因此，该细胞可以是真核或原核细胞，具体考虑是哺乳动物、昆虫、细菌、人或真菌细胞。在有些实施方式中，制备含有MDA-7蛋白质的细胞提取物或上清并将其用不同的纯化步骤包括层析来纯化。
被纯化的MDA-7可以是该蛋白质的分泌形式，对应于SEQ ID NO 2所确定的全长蛋白质的氨基酸49-206。或者，该纯化的MDA-7可以是全长的，或可以含有一个或多个异源氨基酸区域，例如异源N-末端区域或信号序列。而且，该蛋白质可以糖基化。MDA-7糖基化可能发生在不同位置不同程度。考虑纯化的MDA-7可以是不统一的糖基化。此外，考虑可将MDA-7纯化成为复合物例如二聚体的一部分。在具体实施方式
中，采用亲和层析。在本发明的方法中，亲和层析包含有抗-MDA-7抗体。具体考虑采用抗MDA-7单克隆和多克隆抗体，可采用一种以上的单克隆或多克隆抗体，和同时采用多克隆和单克隆抗体。在其它实施方式中，亲和层析涉及MDA-7和不基于蛋白质序列的其它分子之间的亲和力。本发明的有些方面采用了结合糖基化分子的凝集素。在有些情况下，将具有MDA-7亲和力的基础分子与树脂复合，所述树脂可以是非反应性物质例如琼脂糖。可根据本发明的一些实施方式制作亲和树脂柱。作为本发明方法的一部分，可使细胞提取物或上清通过该树脂。在有些实施方式中，经过含抗体的亲和层析之后，使富集或纯化的蛋白质暴露于结合任何污染性抗体的蛋白质A。可将蛋白质A络合于或结合于非反应性结构例如柱子或珠子，从而使蛋白质A与富集或纯化的MDA-7分离。可采用的其它类型的层析为离子交换，尤其是阴离子交换层析。此外，层析包括非反应性纯化过程，例如尺寸排斥层析。尺寸排斥包括但不限于，凝胶电泳，利用柱中的珠子进行尺寸排斥，或可分辨分子大小的任何其它类型的非反应性物理结构。在有些情况下，采用至少1，2，3，4，5或更多不同类型的纯化步骤。特别考虑亲和层析结合阴离子交换层析来纯化MDA-7。在另外的实施方式中，还采用尺寸排斥层析。在一实施方式中，将样品进行亲和层析，尺寸排斥层析，然后进行阴离子交换层析。每个层析步骤之后，可在样品中加入蛋白质运载体，和/或可将样品进行透析或尺寸排斥。在有些实施方式中，取决于所用的纯化工艺类型，选择的工艺包括或不包括结合MDA-7的多肽，例如IL-22或IL-20受体或PKR。因此，特别考虑本发明的纯化方法可用于纯化MDA-7单体，MDA-7复合物一糖基化或未糖基化，以及直接或间接结合MDA-7的蛋白质(单体或作为复合物)。在具体实施方式
中，在进行层析之前、过程中或之后加入蛋白质运载体。可在任何层析或其它富集步骤之前将该蛋白质运载体加入细胞提取物或上清中。在有些情况下，在MDA-7从柱子洗脱之后加入运载体使其稳定。在某些实施方式中，所述蛋白质运载体是白蛋白。白蛋白可以有很多种来源包括人。在有些实施方式中，白蛋白是BSA。此外，可在纯化工艺的后续步骤中除去该蛋白质运载体。在层析过程中，包括阴离子交换和亲和层析中，可使用盐梯度。在本发明的一些实施方式中，可使用盐溶液，浓度为 O. 05,0. 1,0. 15,0. 20,0. 25,0. 30. O. 35,0. 40,0. 45,0. 50，O. 55,0. 60,0. 65,0. 70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 95，I. 00，I. 05，I. 10，I. 15，I. 20. I. 25M 或更高，可递增多至约 O. 005,0. 010,0. 015,0. 020,0. 025,0. 030,0. 035,0. 040,0. 045,0. 050，O. 055,0. 060,0. 065,0. 070,0. 075,0. 080,0. 085,0. 090,0. 095,0. 100,0. 200,0. 300，O. 400，O. 500M或更多。在一些实施方式中，阴离子交换层析包括高至浓度I. OM的盐梯度步骤。在另外的实施方式中，用含盐浓度约O. 9M-1. OM的溶液将MDA-7蛋白质从柱子或其它物理结构上洗脱。在本发明的具体实施方式
中所用的盐为NaCl。在层析过程中，可以有一个或更多洗涤步骤。在有些情况下，使树脂与含有MDA-7蛋白质的细胞提取物或上清接触后洗涤树脂。洗涤液可含有缓冲剂和浓度至多约O. 05，O. I, O. 15,0. 20, O. 25, O. 30. O. 35, O. 40, O. 45, O. 50, O. 55, O. 60, O. 65, O. 70, O. 75 , O. 80,O. 85,0. 90,0. 95，I. OOM或更低的盐。洗涤步骤之后，可进行洗脱步骤。在有些实施方式中，使用含有IM盐pH低于5. O的溶液。洗脱液pH至多约5.0，4. 5，4.0，3. 5，3. O或更低。根据本发明的一些实施方式，洗脱之后进行中和步骤。在具体实施方式
中，中和步骤包括采用缓冲液。本发明包括含有用本发明任何方法纯化的MDA-7蛋白质的组合物。纯化的MDA-7蛋白质如上所述认为是本发明的一部分。纯化的MDA-7蛋白质的使用也是本发明的一部分。在有些实施方式中，抑制患者新生血管形成的方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含纯化的MDA-7蛋白质的组合物，其中该蛋白质有活性且至少约80%均一。在其它实施方式中，治疗癌症患者的方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含纯化MDA-7蛋白质的组合物，其中该蛋白质有活性且至少约80%均一。在另外的实施方式中，所述方法还包括给患者进行放疗或化疗。特别考虑患内皮细胞癌或黑素瘤的癌症患者可得益于本发明的方法。内皮细胞表达能与MDA-7结合的受体。联合放疗和给予MDA-7导致肿瘤相关内皮的凋亡。因此用MDA-7治疗人肿瘤不限于细胞表达MDA-7受体的肿瘤。此外，患有白血病或淋巴瘤的患者因癌细胞表达MDA-7受体也可得益于给予MDA-7。此外，本发明涉及的方法包括给予患者一种免疫原性分子和含纯化MDA-7蛋白的药学上可接受的组合物，以诱导患者产生抗该免疫原性分子的免疫应答反应，其中该蛋白质有活性且至少约80%均一。术语“均一”指在多大程度上MDA-7蛋白质已纯化到均一。如上所述，该组合物可含有所需要的不认为是污染物的其它蛋白质，因此它们不影响MDA-7纯度含量的任何参数。在本发明另外的实施方式中，患者可对其产生免疫应答反应的免疫原性分子是病毒、细菌、真菌或肿瘤抗原。在另外的实施方式中，给予患者干扰素。该干扰素可以是IFN-α、IFN-β、IFN-Y或λ IFN。在另外的实施方式中，给予患者细胞因子或其它免疫刺激分子。本发明另一方法涉及采用MDA-7蛋白质来诱导拮抗肿瘤的新生血管形成。肿瘤变成血管化，并诱导了肿瘤周围的新生血管形成。本发明使用MDA-7多肽通过诱导抗新生血管形成而抑制或逆转该过程。词组“诱导抗新生血管形成”指血管化的逆转或抑制或对已经开始的新生血管形成的抑制。在有些实施方式中，给予肿瘤患者有效剂量的MDA-7多肽以结合IL-22-受体阳性细胞上的IL-22受体并诱导抗肿瘤新生血管形成。IL-22-受体-阳性细胞是在其表面表达结合MDA-7的IL-22受体的细胞。因此，在有些实施方式中，给予患者的IL-22-受体-阳性细胞有效剂量的MDA-7。在另外的实施方式中，IL-22-受体-阳性细胞是内皮细胞。所以，考虑可给予患者的内皮细胞MDA-7多肽。此外,这些细胞不需要与肿瘤或肿瘤细胞相毗邻(“邻接”或“相邻”)。考虑这些细胞可距肿瘤较远(不邻近)。而且，在有些实施方式中，MDA-7多肽是分泌形式的MDA-7并且是糖基化的。本发明还包括在时间和/空间上将MDA-7多次给予癌症患者包括肿瘤患者的相关方法和组合物。因此，在本发明的有些实施方式中，治疗肿瘤患者的方法包括将医学上可接受的组合物注射入肿瘤中第一部位和注射入肿瘤中第二部位，该组合物包含i)MDA-7多肽或ii)含受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体。考虑给予患者包含MDA-7蛋白质或编码MDA-7的核酸的组合物，给药次数至少，至多，或以下数值1，2，3，4，5，6，7，
8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或更多次。因此，在肿瘤内，可在至少或至多1，2，3,4, 5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 个位点注射 MDA-7 组合物(指包含MDA-7蛋白质或编码MDA-7蛋白质的核酸的组合物)。“注射点”指针或其它穿刺装置与患者接触的点。注射点沿肿瘤表面或沿肿瘤平面互相相隔可以是，至少或至多，在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190,200 毫米内或更多。特别考虑当给予一点以上注射时，两个或多个或所有注射点可彼此均匀相隔。也考虑可将MDA-7组合物注射在肿瘤外，例如外围。在有些实施方式中，将该组合物注射在距肿瘤24，20，16，12，8，4，或2毫米内。在本发明的有些实施方式中，给予一次注射，并在第一次注射完成后马上进行一次后续注射。或者，在注射之间可相隔一些时间。因此，给予后续注射可在前次注射后下列时间内，至少下列时间内或至多下列时间内:1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60 分钟或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，2，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 小时或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31 天或 1,2,3,4,5周，或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 个月或更久。此外，本发明包括使用一种或多种化疗、放疗、基因治疗和/或免疫治疗的联合治疗策略。应理解，除非另有说明，纯化的MDA-7可从真核细胞或原核细胞纯化得到。在有些情况下，MDA-7以MDA-7编码核酸转染的原核细胞中纯化得到。在有些情况下，不使MDA-7糖基化但仍可用于本发明的一些方法中。在其它实施方式中，MDA-7从原核细胞纯化，有些情况下，从哺乳动物细胞纯化得到。在具体实施方式
中，MDA-7从小鼠、大鼠、猴子、仓鼠或人细胞中纯化得到。在这些细胞中MDA-7可以是内源或外源产生的。本发明其它方法包括用纯化的MDA-7治疗过度增生性疾病，尤其是癌症。因此，在本发明的有些实施方式中，治疗患者癌症的方法包括给予该患者有效剂量的含有纯化到一定均一性并有活性的纯化MDA-7的药学上可接受的组合物。可用作该方法一部分的均一性百分比包括本文所所述的任何百分比。在本发明的另外实施方式中，还对患者进行放疗。本发明专门包括使细胞放射致敏的方法。术语“放射致敏”指使细胞对放射更敏感。因此，放射治疗前细胞的放射致敏提高了其相对放射治疗前未放射致敏的细胞对放射的敏感性。因此，在本发明的有些实施方式中，方法是采用MDA-7使细胞放射致敏。
放疗，一种众所周知的癌症治疗方法，可在给予患者纯化的MDA-7蛋白质之前或之后给予患者。考虑给予患者一次剂量的纯化MDA-7蛋白质后下列时间内，至少或至多5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55 分钟或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，30，36，42，48，54，60，66，72，78，86，84，90，96，102，108，114，120，126，130，136，142 小时，或 1，2，3，4，5，6，7 天，或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 周或更久后对患者进行至少一个疗程的放疗，或它们的组合治疗。在具体实施方式
中，在患者接受一次剂量的纯化MDA-7蛋白质治疗96小时内进行放疗。对于放疗、MDA-7蛋白质或两者，考虑可给予患者多次或多个治疗疗程。考虑可用纯化的MDA-7蛋白质和/或放疗来治疗本文所述的任何癌症或癌细胞。在具体实施方式
中，待治疗的癌症是胰腺起源的或是黑素瘤。特别考虑可将纯化的MDA-7蛋白质给予癌症或肿瘤细胞相毗邻或位置相近的非癌细胞。在具体实施方式
中，所述方法包括放射致敏癌细胞，该方法包括给予细胞有效剂量的在该细胞中受可操作启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体。也可使用其它载体。此外，采用本发明的任何其它方法，可给予纯化的MDA-7来代替编码MDA-7多肽的表达构建物，或反之亦然。特别考虑所述癌细胞可以是内皮细胞，或本文所述的任何其它癌细胞。本发明还涉及使MDA-7-编码多聚核苷酸、表达构建物或载体与精蛋白形成复合体的方法。精蛋白是带电分子，可以和MDA-7核酸分子一起包含在组合物内或与MDA-7核酸分子形成复合物。本发明的其它方法包括通过给予它莫西芬和纯化的MDA-7蛋白质或含受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体，来治疗对象或癌症患者中的癌细胞的方法。可在给予MDA-7蛋白质或腺病毒载体的同时给予它莫西芬，或在这之前或之后给予。考虑可在给予患者一次剂量的纯化的MDA-7蛋白质或腺病毒载体后的下列时间内，至少或至多5，10,15,20,25,30,35,40,45,50,55 分钟或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，30，36，42，48，54，60，66，72，78，86，84，90，96，102，108，114，120，126，130，136，142 小时或 1，2，3，4，5，6，7 天，或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 周或更久后给予该患者或对象它莫西芬，或它们的组合治疗。本发明的另外实施方式包括诱导细胞中STAT3活化的方法，该方法包括给予该细胞有效剂量的纯化到一定百分比均一性并有活性的纯化MDA-7。可用作该方法一部分的均一性百分比包括本文所述的任何百分比。词组“STAT3活化”指激发STAT3多肽的活性。可用本文实施例部分所述的方法检测STAT3的活化。
本发明的其它方法涉及利用MDA-7来抑制平滑肌细胞。所以，在有些实施方式中，抑制平滑肌细胞的方法包括给予该细胞有效剂量的含有纯化的MDA-7蛋白质或含有受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体的组合物。抑制平滑肌细胞包括诱导该细胞进入凋亡或抑制其迁移。本发明还涉及治疗患者的癌症或癌细胞的方法，该方法包括给予NF-kB抑制剂和含有纯化的MDA-7蛋白质或含有受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体的组合物。NF-kB抑制剂指抑制NF-kB表达或活性的物质。在有些实施方式中，该NF-kB抑制剂是苏灵大。在其它实施方式中，该NF-kB抑制剂是I-kB蛋白质或含有编码I-kB的核酸的载体。具体考虑可给予患者编码MDA-7和NF-kB抑制剂的单一载体或者可通过不同的载体提供。类似地，可给予患者含有一种或多种载体和/或一种或多种蛋白质的单一组合物。本发明方法还包括用带电分子精蛋白治疗癌症。在有些实施方式中，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括给予癌症患者有效剂量的一种病毒组合物，该组合物包含 (a)精蛋白分子；和(b)含有受启动子控制的编码人MDA-7多肽的核酸的表达构建物。在本发明的有些实施方式中考虑使精蛋白分子与该表达构建物形成复合物。病毒组合物可含有约 IO8, IO9, IO10, IO11, IO12, IO13, IO14, IO15 或更多的病毒颗粒与约 10，20，30，40，50，60，70,80,90,100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500，520，540，560，580，600，620，640，660，680，700，720，740，760，780，800，820，840，860，880，900，920，940，960，980，1000或更多μ g精蛋白的比率。在具体实施方式
中，该病毒组合物含有约101°或IO11病毒颗粒与约100 μ g精蛋白，约200 μ g精蛋白，或约300 μ g精蛋白的比率。用于本发明方法和组合物中的MDA-7肽或多肽考虑至少含有SEQID NO :2的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、156、157、160、170、180、190、200 或
206个连续氨基酸，或者含有SEQ IDNO 2的全部氨基酸。重组MDA-7多肽可以是经修饰的，或者是其末端之一被截短的。在本发明的某些实施方式中，MDA-7多肽含有SEQID NO :2的
49-206,75-206或100-206位的氨基酸。分泌型MDA-7多肽含有SEQ ID NO 2的49-206位的氨基酸，但前面48个氨基酸缺失，这种分泌形式的多肽被称为“MDA-7多肽”，可用于本发明的任何组合物和方法中。另外，MDA-7氨基酸序列还可包含异源氨基酸序列，如分泌信号序列。在某些实施方式中，分泌信号序列是带正电荷的N-末端区域，含有一个疏水核心。在另外的实施方案中，该分泌信号可引导MDA-7或其截短形式进入内质网或线粒体。表达构建物可以是病毒或非病毒载体。认为是本发明一部分的病毒载体包括，但不限于，腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒(包括慢病毒)、多瘤病毒或牛痘病毒。可用本发明的方法和组合物治疗的癌细胞包括来自膀胱、血、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、肠胃、牙銀、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的细胞。此外，具体地癌症可以是下列的组织类型，虽然不限于这些瘤，恶性 ’癌;癌，未分化的；巨大和纺锤形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；转化细胞癌；乳头状转化细胞癌；腺癌；促胃液素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁型腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌肿瘤，恶性；腮-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色性癌；嗜酸性癌；嗜氧性腺癌；嗜碱性癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包封硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属癌；顶泌腺癌；皮质性腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状衆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印指环状细胞癌；渗透导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏(paget' s)病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌《/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢基质瘤，恶性；泡膜细胞瘤,恶性；粒层细胞瘤,恶性；睾丸足细胞瘤,恶性；足细胞癌；睾丸间质细胞瘤,恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤,恶性；外乳腺副神经节瘤,恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤 ’恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；表面传播性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣,恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤,恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合肿瘤，恶性；缪勒氏(mullerian)混合肿瘤；肾胚细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳氏(brenner)瘤，恶性；叶状柄肿瘤，恶性；滑液肉瘤；间皮瘤,恶性；无性细胞瘤；胚胎型癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿瘤，恶性；绒毛膜癌；间质肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波济氏(kaposi’ s)肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮 质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性；间叶细胞软骨肉瘤；骨巨大细胞瘤；尤文氏(ewing’ s)肉瘤；牙原性肿瘤，恶性；成釉细胞性牙瘤；成釉细胞瘤,恶性；成釉细胞性纤维肉瘤；松果体瘤,恶性；脊索瘤；神经胶质瘤,恶性；室骨膜瘤；星细胞瘤；原浆性星细胞瘤；纤维型星细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；眼癌；嗅觉神经性肿瘤；脑膜瘤,恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤,恶性；粒细胞肿瘤,恶性；恶性淋巴瘤；何杰金氏(hodgkin’ s)病；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞的；恶性淋巴瘤，大细胞，扩散；恶性淋巴瘤，滤泡，蕈样真菌病；其它特定非何杰金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；血浆细胞白血病；红白细胞白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜曙红细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。可通过以下途径将组合物给予细胞或对象静脉内，皮内，动脉内，腹膜内，病灶内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，表面，瘤内，肌肉内，腹膜内，皮下，结膜下，囊泡内，粘膜，心包内，脐内，眼内，口服，表面，局部，通过吸入(例如，气雾剂吸入)，通过注射，通过灌输，通过连续灌输，通过局部灌注洗浴直接靶向细胞，通过导管，通过灌洗，在软膏中，或在液体组合物中。本发明的其它方面内容具有诊断性或预后性目的。本发明包括评价诊断为癌症或怀疑有癌症的对象癌症进程的方法，该方法包括(a)获得对象的样品；(b)检测过度增生组织样品中的MDA-7表达；(c)检测过度增生组织样品中的iNOS表达；和(d)比较iNOS表达水平与MDA-7表达水平。如实施例所示，与MDA-7表达水平升高或处于正常细胞例如非黑素瘤皮肤细胞一般所见水平时的iNOS表达水平相比较，当MDA-7表达较低或缺乏时iNOS的表达较高。可计算具体样品中MDA-7表达水平和iNOS表达水平的相对比率，作为评价或诊断癌症的一部分。根据本领域技术人员所熟知的技术，可根据蛋白质或转录水平来测定MDA-7或iNOS的表达。将该比率与获自非癌症细胞的标准品或对照作比较。此外，可用MDA-7相对iNOS的比率或水平来评价对癌症治疗的反应。iNOS表达降低可作为治疗的阳性指示。在有些实施方式中，可用于监测MDA-7的治疗效果。因此，测定对对象癌症治疗的反应的方法包括(a)在以MDA-7治疗之前和之后从对象取得样品；和
(b)比较样品中的iNOS表达水平。如上所述，以MDA-7治疗可包括给予对象有效剂量的纯化的活性MDA-7蛋白质或包含受启动子控制的编码人MDA-7多肽的核酸序列的表达盒。考虑该方法可用于多种癌症，但在具体实施方式
中，应用于黑素瘤，包括转移性黑素瘤。可根据患者面谈或病历、初步检查结果或其它提示某患者可能患有癌症或有患癌症危险的指征/因素怀疑该患者患有癌症。本发明还涉及治疗卵巢癌患者的方法。本发明的某些实施方式涉及治疗卵巢癌患者的方法，该方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含有MDA-7蛋白质的组合物。例如，MDA-7蛋白质可以是有活性并且至少80%均一的基本上纯化的MDA-7蛋白质。其它实施方式涉及治疗患有卵巢肿瘤的患者的方法，该方法包括将有效剂量的药学上可接受的组合物注射入肿瘤中的第一个位点,和注射入肿瘤中的第二个位点,该组合物包含i) MDA-7多肽或ii)含有受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体。涉及腺病毒载体使用的 方法在整个说明书中都有讨论。只要被论及，这些方法都可用于MDA-7组合物在卵巢癌治疗中使用。本发明的其它实施方式包括治疗肿瘤患者的方法，该方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含有诱导肿瘤中APC表达的物质的组合物。本发明考虑能诱导肿瘤中APC表达的任何物质。例如，该物质可以是小分子、核酸或蛋白质性质的组合物。在某些实施方式中，该物质是MDA-7、MDA-7多肽或含有编码MDA-7多肽的核酸的表达构建物。涉及表达构建物使用的方法在整个说明书中都有讨论。本领域技术人员熟悉这方面可用的表达构建物和方法学的范围。本发明考虑使用给予诱导APC表达的物质的任何方法。本领域普通技术人员熟悉将该物质递送给患者的可用方法的范围。例如，可静脉内、瘤内或口服给予该物质。在本发明有些实施方式中，还将该组合物定义为可降低肿瘤中β_连环蛋白表达的组合物。测定肿瘤中连环蛋白表达的方法包括本领域技术人员所知的任何方法。这些方法的实施例在本说明书其它地方讨论。在本发明的有些实施方式中，该组合物降低对象中连环蛋白的表达。例如，β-连环蛋白表达的降低可发生在对象的肿瘤中。本发明其它实施方式包括筛选抗癌化合物的方法，该方法包括(I)使候选药物与第一种癌细胞接触；(2)测定第一种癌细胞中APC的表达；和(3)比较第一种癌细胞和没有接触该候选药物的第二种癌细胞中APC的表达，其中若第一种癌细胞中APC表达增加，确认该候选药物为候选抗癌化合物。这些方法可以包括或不包括测定第一和第二种癌细胞中连环蛋白的表达并确定与第二个癌细胞相比较，第一种癌细胞中连环蛋白的表达是否降低。涉及测定连环蛋白表达的步骤可以独立或不独立于涉及APC测定的步骤。本发明考虑任何候选药物，本领域普通技术人员熟悉可用候选药物类型的广泛范围。例如，候选药物可以是小分子、核酸或蛋白质性质的组合物，可包括连环蛋白核糖核酸酶，siRNA,或反义分子。本发明还包括含有SEQ ID NO 2 175-206位氨基酸的多肽以及内质网靶向序列。本说明书其它地方提供了 SEQ ID NO :2的氨基酸序列。具体考虑包括SEQ ID NO 2 175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，和 206 位氨基酸残基的多肽。考虑 SEQID NO 2 175-206位的氨基酸是连续的氨基酸残基。在本发明的其它实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO :2150_206位的氨基酸以及内质网靶向序列。在另外的实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO :2100-206位的氨基酸以及内质网(ER)靶向序列。在另外的实施方式中，该多肽包含SEQID NO :249-206位的氨基酸以及内质网靶向序列。在每一种这些实施方式中，考虑SEQ ID NO :2的氨基酸是连续的氨基酸残基。在本发明的有些实施方式中，内质网靶向序列可操作性连接于截短的MDA-7多肽的N末端部分。本文所述的和本领域技术人员所知的内质网靶向序列认为是本发明MDA-7多肽组成的一方面。本发明的实施方式可以或可以不包括内质网保留信号。本领域普通技术人员熟悉 内质网靶向序列和内质网保留信号。本发明还考虑包含上述的编码MDA-7序列的核酸以及内质网靶向序列的表达盒。整个说明书都有表达盒的讨论，讨论表达盒的说明书部分也适用于包含编码SEQ ID N02氨基酸的核酸的表达盒。此外,本发明涉及治疗癌症患者的方法,该方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含有MDA-7蛋白质和一种或多种选自IL-2，IL-7，和IL-15的白细胞介素的组合物。而且，认为在本发明的任何方法中可将MDA-7与其它白细胞介素组合使用。已证明某些白细胞介素具有细胞因子活性。这些白细胞介素的例子包括IL-19，IL-20，IL-22，和IL-26。认为在本发明涉及抑制新生血管形成和刺激免疫应答反应的方法中，这些具有细胞因子活性的白细胞介素可替代MDA-7。本发明还涉及抑制或预防患者中的癌症局部侵袭和/或转移的方法，包括给予该患者有效剂量的药学上可接受的含有MDA-7蛋白质的组合物，其中MDA-7抑制或预防癌症的局部侵袭和/或转移。本发明考虑本领域普通技术人员所知的任何给药方法。本领域普通技术人员有能力测定癌症的局部侵袭和/或转移是否被预防或抑制了。本发明考虑抑制或预防任何类型原发癌的局部侵袭和/或转移的方法。例如，该原发癌可以是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、成视网膜细胞瘤、星状细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈、舌、白血病、成神经细胞瘤、头、颈、乳房、胰腺、前列腺、肾、骨、睾丸、卵巢、间皮瘤、颈部、肠胃道、淋巴瘤、脑、结肠，或膀胱癌。在本发明的某些实施方式中，该原发癌是肺癌。例如，该肺癌可以是非小细胞肺癌。此外，本发明可用于预防癌症或治疗初期癌或恶变前的细胞，包括化生、发育异常或增生。本发明也可用于抑制不希望的但是良性的细胞，例如鳞状化生、发育异常、良性前列腺增生细胞、增生性病损等。如本文所述的，通过给予本发明的包含MDA-7多肽以及含MDA-7编码核酸的构建物的方法可阻止、破坏或延迟它们发展成为癌症或更严重的癌症形式。任何制备或配制MDA-7的方法都包括在本发明的方法中。在某些实施方式中，按照本发明上述小结的任何方法纯化MDA-7。例如，可通过上述的方法将MDA-7从细胞中纯化到至少20%均一，其中将含有MDA-7蛋白质的细胞提取物或上清进行亲和层析，将MDA-7纯化到至少20%均一并有活性。
本发明的其它方面包括抑制或预防患者中癌症局部侵袭和/或转移的方法，包括给予该患者有效剂量的药学上可接受的含有编码MDA-7多肽的寡核苷酸的组合物，其中MDA-7多肽抑制或预防癌症的局部侵袭和/或转移。在某些实施方式中，该编码MDA-7多肽的寡核苷酸包括在表达构建物中。例如，该表达构建物可包含含有受启动子控制的编码MDA-7多肽的核酸的腺病毒载体。本发明还包括其它方法例如治疗显微残留癌细胞的方法，该方法包括下面步骤，鉴定患有可切除肿瘤的患者，切除该肿瘤，使瘤床接触MDA-7蛋白质或含有在真核细胞中有功能的启动子和编码MDA-7多肽的多聚核苷酸的表达载体，其中所述多聚核苷酸受启动子的转录控制。本发明的其它方法是治疗患有癌症对象的方法，该方法包括下面步骤手术暴露肿瘤并使肿瘤接触MDA-7多肽或含有在真核细胞中有功能的启动子和编码MDA-7多肽的多聚核苷酸的表达载体，其中所述多聚核苷酸受启动子的转录控制。或者，给予MDA-7多肽或MDA-7编码核酸后，切除所有或部分肿瘤。这种辅助治疗形式也认为是本发明的一部分。 本发明还包括治疗患有癌症对象的其它方法，该方法包括下面步骤以MDA-7多肽或含有在真核细胞中有功能的启动子和编码MDA-7多肽的多聚核苷酸的表达载体(其中该寡聚核苷酸受启动子的转录控制)灌注肿瘤一段延长的时间。采用MDA-7作为辅助治疗也认为是本发明的一部分。该辅助治疗可以和一种或多种其它癌症治疗联合使用，其它癌症治疗包括，但不限于，手术、化疗、放疗、免疫治疗，或基因治疗。实施例包括手术和化疗；手术和放射；手术和免疫治疗；放射和化疗；放射和免疫治疗；化疗和免疫治疗；手术、放射和化疗；手术、化疗和免疫治疗的联合等。此外，化疗治疗可包括一种以上的化疗疗法。在本发明的有些实施例中，可将MDA-7(多肽或编码核酸)与脱乙酰基紫杉醇(taxotere)、Herceptin和Aa_mda7 —起使用。例如这样使用对治疗例如乳腺癌非常有效。如上所述，Aa_mda7也认为可与它莫西芬一起使用。还提供治疗复发性癌症对象的方法，包括(a)选择患者，根据(i)曾经手术或放疗或化疗或免疫疗法治疗过癌症；和(ii)治疗后癌症复发，和(b)给予该患者MDA-7多肽或含编码MDA-7多肽的核酸区段的表达构建物，该区段受在该患者癌细胞中有活性的启动子的控制，该表达构建物在癌细胞中表达MDA-7。随步骤(b)的后续步骤(c)给予该患者第二次放疗或化疗或免疫治疗期，从而MDA-7使癌细胞对所述第二次放疗或化疗或免疫治疗敏感，因此也提供了癌症治疗。第一次癌症治疗和第二次癌症治疗可以相同或不同。患者可以是非人动物，或人患者。第一次和/或第二次放疗或化疗可以是化疗，例如白消安、苯丁酸氮芥、顺钼(CDDP)、环磷酰胺、氮烯唑胺、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、5-FU、Ara-C、氟达拉滨(fIudarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氨甲蝶呤、阿霉素、博来霉素、放线菌素D、红比霉素、去甲基毛霉素(idarubicin)、丝裂霉素C、多西紫杉(docetaxel)、紫杉醇、依托泊苷、紫杉醇(paclitaxel)、长春碱、长春新碱、长春烯碱(vinorelbine)、喜树碱、亚硝脲氮芥或环己亚硝脲。第一次和/或第二次放疗或化疗可以是放疗，例如X-射线，Y射线，或微波。第一次和/或第二次放疗或化疗可以特征性所述为DNA损伤治疗。免疫治疗可包括用革巴向特定蛋白质的单克隆抗体例如herceptin(trastuzumab), rituxan(rituximab),Erbitux(cetuximab), ABX-EGF, bexxar, zevalin, oncolym, Mylotarg, LymphoCide, 或Alemtuzumab 来治疗。治疗的癌症可以是脑癌、头颈癌、食道癌、气管癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、直肠癌、淋巴癌或白血病。所述该表达构建物可以是病毒表达构建物，例如逆转录病毒构建物、疱疹病毒构建物、腺病毒构建物、腺病毒相关病毒构建物或牛痘病毒构建物。病毒表达构建物可以是可复制型病毒或腺病毒，或复制缺陷型病毒或腺病毒。或者，表达构建物可以是非病毒表达构建物，例如包含在脂质运载体中的表达构建物。所述启动子可以是CMV IE,RSV LTR, β-肌动蛋白，Ad-El，Ad-E2或Ad-MLP。也可使用本领域技术人员所知的其它基因治疗载体和启动子。步骤(b)和(C)之间的时间段可以是约24小时，约2天，约3天，约7天，约14天，约I月，约2月，约3月，或约6月。复发可以是在原发癌位点或转移位点的复发。该对象可在步骤(b)之前已接受过手术切除，和/或该方法还可包括在步骤(C)之后进行手术切 除。步骤(b)中给药可以是瘤内或肿瘤脉管系统，肿瘤局部，肿瘤区域，或全身给药。步骤
(c)中给药可以是瘤内或肿瘤脉管系统，肿瘤局部，肿瘤区域，或全身给药。本发明还包括诱导抗MDA-7免疫应答反应的方法和组合物。因此，在本发明的有些实施方式中，将MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸的全部或部分作为疫苗提供给对象。可用该疫苗预防或治疗涉及MDA-7的任何病症或疾病，包括癌症。本发明的方法和组合物还包括采用抗MDA-7抗体，尤其是中和MDA-7活性的抗体，抗MDA-7抗体包括抑制MDA-7与其受体(例如IL-20R和IL-22R)结合的抗体。可用单克隆和多克隆抗体及其人源化形式来治疗炎性疾病，自身免疫疾病和病症，包括牛皮癣、炎性大肠病(IBD)、类风湿性关节炎和狼疮。本发明方法包括给予患者有效剂量的MDA-7抗体(也称为抗-MDA-7抗体)从而达到治疗效益的治疗方法。治疗效益包括，但不限于，症状数目降低或症状严重性降低，诱导了缓解，炎症或炎症特征降低，痛苦减少。对本发明一个实施方式所述的任何限制可适用于本发明的其它实施方式。此外，可用本发明的任何方法来生产或利用本发明的任何组合物。虽然本说明书支持“或”的定义只指或者和“和/或”，但除非另有明确的说明，“或”只指或者或可选物是相互排斥的，权利要求书中的术语“或”用于表示“和/或”。在整个本申请中，术语“约”用于表示某数值包含测定该数值的装置和/或方法所产生的标准误差。除非有明确的说明，本说明书中所用的“一个”或“一种”可以指一个或多个。如本文权利要求书中所用，当“一个”或“一种”与单词“含有”连用时，可以指一个，也可以指一个以上。本文所用的“另一个”至少是指第二个或更多个。


下面的附图构成本说明书的一部分，用于显示本发明的特定方面。通过参考这些附图中的一个或多个结合本文特定实施方式的详细所述可以更好地理解本发明。图1A-D. sMDA-7体外抑制内皮细胞分化但不抑制增殖。将HUVEC和HMVEC血清饥饿24小时，置于含lng/ml bFGF和所示浓度sMDA_7的2孔室载玻片中(A)。以PBS和血管抑素处理的细胞分别作为阴性和阳性对照。如实施例I所示72小时后检测增殖(B)，在所示浓度sDMA-7处理的2孔室载玻片中接种肺肿瘤细胞(Hl299和A549)。以PBS和Ad_mda7处理的细胞分别作为阴性和阳性对照。如实施例I所示72小时后检测增殖。在以PBS，sMDA-7 (50ng/ml)或sMDA_7的免疫耗竭制品处理的包被基质胶的96孔板中接种HUVEC并观察管的形成(C)。所有处理都设双复孔。sMDA-7完全消除了内皮微管的形成，而与用PBS处理的对照细胞中看到的相似，sMDA-7蛋白质的免疫耗竭导致微管形成恢复。放大，XlO倍。半定量分析SMDA-7/IL-24处理的HUVEC和HMVEC中的内皮微管数目，显示在两种细胞型中sMDA-7都显著(P = O. 001)抑制微管形成(C)。竖条，标准差。图2. sMDA-7比内皮抑素更有效抑制体外内皮细胞分化。将HUVEC接种于包被基质胶的含有lng/ml bFGF和所示等摩尔浓度sMDA_7和内皮抑素的96孔板中。处理后24小时在显微镜下观察板中的微管形成并计数微管数目。PBS处理的细胞作为阴性对照。所有处理都设双复孔。实验重复5-6次。sMDA-7而非内皮抑素以剂量依赖方式显著(P =O. 001)抑制内皮微管形成，在高于10ng/ml浓度时完全消除了内皮微管形成。只在最高浓度(300ng/ml)时观察到内皮抑素对微管形成的抑制。数值为3次实验的 平均值。竖条，标准差。图3. sMDA-7抑制内皮细胞迁移。将HUVEC在O. 5% FBS中饥饿过夜，接种到24孔穿孔插片(transwell insert)的上室中置于含有 100ng/ml VEGF和 10ng/ml sMDA-7 的 24孔板中。在高倍显微镜下计数迁移到孔下室的细胞。24小时内，与只用VEGF处理的细胞相t匕，SMDA-7显著(P = O. 001)抑制了 VEGF诱导的HUVEC迁移。PBS处理的细胞作为阴性对照。图4A-D. MDA-7的抑制活性并非由于HUVEC产生的IFN_y和IP-IO所致。以sMDA_7/IL-24(10ng/ml)处理接种于6孔板中的HUVEC。在所示时间点收集细胞培养上清并通过ELISA分析IFN- Y⑷和IP-IO⑶。以IFN- y orAd_mda7处理的HUVEC的上清分别作为IP-IO和IFN- Y ELISA的阳性对照。PBS处理的细胞的上清作为阴性对照。所有处理都设双复孔。(C)，以等摩尔浓度的sMDA-7，IFN- Y或IP-IO处理接种于基质胶包被的96孔板中的HUVEC并分析微管的形成。通过计数微管数目测定抑制活性。与IFN-Y或IP-IO相比，sMDA7在低浓度显著(P = O. 01)抑制微管形成。IFN-γ或IP-IO抑制活性只在高浓度才观察到。(C).通过计数微管数目测定抑制活性。与IFN-Y或IP-IO相比，sMDA7在低浓度显著(P = O. 01)抑制管的形成。IFN-γ或IP-IO抑制活性只在高浓度才观察得到。(D)，将以抗-IP-IO或抗-IFN- Y中和抗体预处理的HUVEC接种于基质胶包被的96孔板中，以sMDA-7处理，分析微管形成。sMDA-7显著抑制了微管形成(P = O. 001)竖条，标准差。图5. sMDA-7通过IL-22R1抑制内皮细胞分化。在接种于含有PBS或所示浓度的sMDA-7、内皮抑素或IP-IO的基质胶包被的96孔板中之前，以两种不同浓度的IL-22R1阻抑抗体处理或不处理HUVEC 24小时。第二天，在明视野显微镜下检查细胞中管的形成并定量。以SMDA-7/IL-24处理的HUVEC微管形成受到了抑制但PBS处理的对照细胞未受抑制(A)。然而，存在IL-22R1阻抑抗体时，sMDA-7对HUVEC微管形成的抑制作用以剂量依赖的方式被消除。内皮抑素或IP-IO抑制了用IL-22R1抗体预处理HUVEC的微管形成(B)。竖条，标准差。图6A-E.新生血管形成和肿瘤生长的体外研究。将包裹在含有60ng bFGF的基质胶中的sMDA-7 (12. 5ng)皮下植入无胸腺裸鼠。只含有bFGF的基质胶作为阳性对照，含有PBS的基质胶作为阴性对照。10天后，收获基质胶，如实施例I所述分析血红素水平。与对照相比，在含有SMDA-7/IL-24的基质胶中观察到血红素水平显著(P = O. 0001)下降(A)。测量了裸鼠中植入A549肿瘤细胞和亲代293细胞或293-mda_7细胞的等量(I I)混合物所长出的皮下肿瘤(B)。与含有亲代293细胞的肿瘤相比，观察到含有293-mda-7细胞的肿瘤生长显著抑制(P = 0.001) (B)。各时间点代表各组的平均肿瘤体积。竖条代表标准差。用western印迹分析检测含有293-mda_7细胞的肿瘤组织中MDA-7蛋白质表达,与含有亲代293细胞的肿瘤比较。在实验结束时，收获肿瘤并分析。与含有亲代293细胞的动物肿瘤样品比较，含有293-mda-7细胞的动物肿瘤样品中的血红素水平较低(C)。通过在右下腹注射A549肿瘤细胞建立皮下肿瘤(D)。当肿瘤可触知时，以基质胶包裹的亲代293细胞或基质胶包裹的293-mda-7细胞植入每只小鼠右上腹。用卡尺测量肿瘤生长。与以293细胞处理的肿瘤相比，以293-mda-7细胞处理的肿瘤生长抑制更明显(P = O. 001)。各时间点代表各组的平均肿瘤体积。竖条代表标准差。对肿瘤组织CD31染色的半定量分析显 示了，与以亲代293细胞处理的肿瘤相比，以293-mda-7处理的肿瘤中微管密度的显著降低(E) ο竖条，标准差。图7.剂量递升的I期临床试验研究设计，其中mda-7通过瘤内注射给予晚期癌症患者，采用非复制型的腺病毒构建物(Ad-mda7)。试验设计表明每组患者的数目、病毒的剂量和活组织检查的时间。图8.直方图表明DNA拷贝数/μ g DNA和瘤内注射后小时数。在注射24小时内，MDA-7蛋白质表达呈剂量依赖性升高，在96小时时下降。图9.患者结果图表表明通过TUNEL染色显示凋亡在病灶中心最强烈。病灶外围切片显示与未注射病灶相比TUNEL反应强烈。图10.图示对Ad_mda7诱导的血清细胞因子反应动力学，结果用血清细胞因子升高百分率对注射后的天数表示。结果表明瘤内注射Ad-mda7后血清细胞因子出现瞬时升闻。图11.每组瘤内注射Ad_mda7所产生的血清细胞因子反应。大多数患者出现全身细胞因子(IL-6，IL-10, IFN y , TNF α，GM-CSF)的瞬时升高。图12.接受瘤内注射Ad_mda7的患者⑶8+T细胞百分率增加的水平。在mda7处理后15天CD3+CD8+T细胞增加了 30 ±13%。图13.瘤内注射Ad_mda7后患者外周血⑶8+细胞增加。图14. MDA-7的一步阴离子交换纯化。在western印迹中用多克隆抗_MDA_7抗体检测阴离子交换柱的每个MDA-7峰(1，2，3，4)。图15.保留时间与分子质量的比较。MDA-7复合物在85_95kDa洗脱。图16. MDA-7过表达抑制细胞增殖。以PBS、Ad_luc或Ad_mda7处理肿瘤细胞(DU145，LNCaPjPPC-3)和正常细胞s (PrEC)并分析不同时间点的MDA-7表达或细胞活力。测定用PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理后肿瘤或正常细胞的增殖。数值代表三次重复的平均值。统计学显著性设为P = < O. 05。差错条代表标准差(SE)。图17.MDA-7的表达在肿瘤细胞中但不在正常细胞中诱导凋亡。处理后72h收获以PBS、Ad-Iuc或Ad-mda7处理的肿瘤细胞(DU 145，LNCaP，和PC-3)以及正常内皮细胞(PrEC)并以流式细胞计量术分析处于sub-GO/Gl期的细胞。每种处理停滞2万个细胞。数据显示为柱状图。数值为三次重复的平均值。差错条代表标准差(SE)。图18. MDA-7导致细胞周期停滞于G2期。以PBS、Ad-Iuc或Ad_mda7处理肿瘤细胞(DU 145，LNCaP，和PC-3)以及正常细胞(PrEC)。处理后72h收获细胞并以流式细胞计量术进行细胞周期分析。每种处理停滞2万个细胞，数据显示为柱状图。数值为三次试验的平均值。差错条代表标准差(SE)。图19A-D.根据克隆存活试验测定Ad_mda7引起的放射致敏。用于Ad_mda7和Ad-Iuc的载体浓度对于A549细胞系为ΙΟΟΟνρ/细胞(A);对于H1299细胞系为250 (B)，对于CXD-16(C)和MRC-9细胞系(D)为1500。转染后48小时进行照射。每个数据代表三次独立试验的平均值。符号代表模拟感染(实心菱形)；Ad_mda7,(实心正方形)；Ad_luc,(实心二角形)。竖条标准差。图20A-D.通过对 A549 ⑷，H1299 ⑶，CCD-16 (C)和 MRC-9 (D)细胞的 TUNEL 试验 评估凋亡。转染后48小时照射细胞，照射后两天或转染后4天收获细胞。所用载体浓度与图19所用相同。每个数据代表两次独立试验的平均值。竖条标准差。图21.以 Ad_mda7 或喔氛酷咕唑(Nocodazole) (200ng/ml)处理的 A549 和 H1299的细胞周期分析。噻氨酯哒唑的剂量和暴露时间积累的G2/M期细胞的比例与预试验中测定的Ad-mda7转染后48小时相同。所示数据代表两次独立的试验。图22.克隆存活试验测定噻氨酯哒唑(200ng/ml)诱导的G2/M停滞引起的放射致敏。A549细胞系暴露噻氨酯哒唑后4小时进行照射，H1299细胞系暴露噻氨酯哒唑后3. 5小时进行照射。符号代表只辐射(实心菱形)；噻氨酯哒唑，(空心正方形)竖条标准差。图23.克隆存活试验测定姜黄素或姜黄素加Ad-mda7处理的A549和H1299细胞对放射线的敏感性。转染2天后进行照射。转染I天后添加姜黄素。所用载体浓度与图19所用相同。每个数据代表三次独立试验的平均值。竖条标准差。图24. rhMDA-7蛋白质杀伤黑素瘤细胞。以0_20ng/ml rhMDA-7处理MeWo细胞，4天后用台盼蓝测定活力。也在抗-MDA-7抗体(兔多克隆Pab或鼠单克隆Mab)或对照人IgG存在时以20ng/ml rhMDA-7处理细胞。图25A-25B.黑素瘤MDA-7的表达与肿瘤iNOS表达负相关。iNOS计数和MDA-7计数平均值之间呈负相关(A)。Kendall τ -b相关性系数是-O. 209，以P < O. 05显著区别于O。iNOS密度和MDA-7密度平均值之间呈负相关(B)。Kendall τ -b相关性系数是-O. 201，P < O. 05显著区别于O ;竖条，土标准差。图26.以rhMDA-7处理人黑素瘤细胞系MeWo 4h后IRF-I和IRF-2的免疫印迹分析。处理包括只有培养基(泳道1，阴性对照);未转染HEK 293细胞上清(泳道2，阴性对照)；5ng/ml rhMDA-7 (泳道 3);和 20ng/ml rhMDA-7 (泳道 4)。膜用抗-IRFl 和 IRF-2 抗体(I 2000稀释液)免疫印染。所示为一个代表性试验。图表显示以肌动蛋白标准化后细胞溶解物中的IRF-I和IRF-2表达，代表两次试验的平均值；竖条，土标准差。图27. Ad-mda7增强了它莫西芬的抗肿瘤效应。图28. Ad-mda7和MDA-7蛋白质调控了黑素瘤细胞的细胞因子分泌。图29. Ad-mda7对A549肺转移的作用图30.以腺病毒载体强效转导PACl细胞。用50或IOOpfu/细胞的Ad-SM22- β -gal (Ad_SM22)或 Ad-RSV-β -gal (Ad-RSV)以所示 MOIs 转导人 H1299 肺癌或PACl细胞。24小时后，将细胞染色检测β-gal活性并计数X-gal阳性细胞。所示数据为三次计数的平均植。图31.MDA-7 抑制 PACl 细胞生长。用 Ad_mda7 或 Ad-Iuc 以所示 MOI 转导 PAC1SMC。转导3天后手工计数一式三份的存活细胞。数据表示为平均值土标准差。与对照病毒(Ad-Iuc)比较 P < O. 05 (*) ο图32A-C. Ad-mda7 凋亡 PACl 诱导。A. Ad_mda7 提高胱冬酶 _3 (caspase3)的活性。用Ad-mda7或Ad-Iuc以100M0I转导PACl细胞。转导后48小时，一组细胞裂解物用于胱冬酶-3活性测定，另一组用于总蛋白质定量。胱冬酶-3活性以总蛋白质标准化，表示为单位/10 μ g总蛋白质。与对照病毒(Ad-Iuc)和未处理对照比较P < O. 05 O) (A)。膜联蛋V结合试验。用Ad_mda7或Ad-luc以100
MOI转导PACl细胞，转导后24小时以FITC标记的膜联蛋白V染色。用流式细胞计量术分析处理的细胞(B)。用Modfit软件分析早期凋亡细胞百分比。与对照病毒(Ad-Iuc)比较P < O. 05⑷。DAPI染色试验(C)。用Ad-mda7或Ad-Iuc以100M0I转导PACl细胞，转导后24、48、72小时以DAPI染色，如果细胞核显示出染色质解凝聚则该凋亡的细胞核计数为阳性。与对照病毒(Ad-Iuc)比较P < O. 05(*)。图33. Ad-mda7抑制PACl细胞迁移。以100M0I的Ad_mda7或Ad-Iuc转导汇合的PACl并如实施例22所述处理。直方图显示显微镜观察到的向伤害部位迁移的细胞定量计数。对于+FBS 和-FBS，p<0. 01 ⑷；对于 Ad_mda7 和未处理的或 Ad_luc+FBS，p < O. 01(*)；对于 Ad-mda7 和未处理的或 Ad-luc-FBS, p < O. 05 ( Λ )。图34. INGN 241生物作用的时间过程和剂量反应。在INGN 241的临床试验中显示了 6个不同组的时间过程和剂量。图35. MDA-7蛋白质表达与凋亡诱导相关。测定了 MDA-7蛋白质水平，对10个不同患者的切片进行了 tunel试验。图36.评价了患有黑色素细胞瘤患者4的不同肿瘤部位的MDA-7RNA，DNA和蛋白质表达水平。图37.评价了 10个患者MDA-7DNA和RNA从注射位点的扩散。图38.评价了一些患者不同部位的MDA-7蛋白质水平和凋亡程度。图39.用TUNEL试验评价了 MDA-7表达的扩散及与凋亡水平的相关性。图40.评价了注射点MDA-7DNA (变化)的时间过程。图41.评价了注射点MDA-7蛋白质和凋亡水平(变化)的时间过程。图42. II期临床试验初步结果。图43.以 2000vp/ 细胞 Ad_mda7 和 Ad-luc 处理 AsPcI，Capan2 和 MiaPaCa2 胰腺癌细胞72小时，用台盼蓝分析其活力，用膜联蛋白V染色分析凋亡。数据显示为平均值+标准差(SD)。图44.以Ad_mda7或对照处理MiaPaCa2细胞，照射40小时后接种进行克隆试验。图45.以2000vp/细胞Ad-Iuc或Ad-mda7处理AsPcl和MiaPaCa胰腺癌系细胞，24小时后再用XRT (5Gy)处理。第三天用碘化丙锭处理和以FACS分析评价细胞周期变化。图46. Ad-mda7激活NF- κ B依赖的报告基因表达。图47. Ad_mda7在显性失活Ι_κ Ba稳定细胞中的细胞毒作用。
图48. Ad-mda7显著抑制显性失活I- κ B α细胞的生长。图49A-C. Ad-mda7与苏灵大(苏灵大)协同诱导凋亡。A.只以Ad_mda7以及与苏灵大联合处理细胞的凋亡率。B.以PBS，Ad-luc，或Ad-mda7处理肿瘤(A549 and H1299)和正常(CXD-16)细胞3h。处理后，细胞与所示浓度的苏灵大一起孵育。72h后，用台盼蓝排斥试验测定细胞活力。细胞生长百分数计数为每组细胞数的平均值，表示为以PBS，Ad-luc,或只以Ad-mda7处理(设为100% )的各组的相对值。与PBS和Ad-Iuc处理比较，以Ad-mda7/苏灵大处理的肿瘤而非正常细胞受到了显著抑制(P = O. 001)。苏灵大介导的抑制作用是剂量依赖的。竖条，标准差。C.通过FACS分析凋亡细胞。在各种剂量苏灵大存在时，以PBS，Ad-luc，或Ad-mda7处理肿瘤细胞(A549 and H1299)和正常(CCD-16)细胞。处理后72h，以碘化丙锭将细胞染色，并进行FACS分析。通过定量处于sub-Gl期的细胞来测定凋亡细胞的百分数。表示为一式两份样品的平均值；在至少两次独立的试验中观察到相似结果。竖条，标准差。D.将带有皮下H1299肿瘤的裸鼠分组(η = 8/组)。与以PBS，苏灵大，Ad-mda7,或Ad-Iuc/苏灵大处理的动物比较，以Ad_mda7/苏灵大处理的动物显示 出显著的肿瘤生长抑制。过瘤内注射一周三次给予Ad-mda7(3xl09vp),通过i. p.注射每天给予苏灵大(40mg/kg)。给出的肿瘤体积代表每个时间点每组的平均值。竖条，标准差。图50.通过以Ad-GFP感染细胞测定5个卵巢癌细胞系(MDAH2774，OVCAR 420, DOV13，HEY，和SK0V3-ip)的腺病毒转导。图51.以Ad-mda-7感染后抑制了卵巢癌细胞系MDAH 2774和OVCA 420的细胞增殖。图52.流式细胞计量术分析表明，5个卵巢癌细胞系中有两个，MDAH2774和OVCA420，显示了显著的生长抑制，其G2/M群体百分数有显著增加。图53. MDA-MB-486乳腺癌细胞的存活。图54.放射处理前给予Ad_mda7对A549肿瘤生长㈧和小鼠存活的效果⑶。A549细胞(5xl06)作为异种移植肿瘤在裸鼠中生长。以放射(5Gy)，Ad-mda7(三组分中为3xl010vp)或这两种的组合处理荷瘤小鼠。如实施例27所述测定肿瘤体积，当肿瘤达到直径15mm或发生溃烂时处死动物。数据表示为平均值土标准差(A)。图55.不同联合治疗方案对A549肿瘤生长的效果。对荷瘤小鼠按如下处理对照，Ad-mda7(第I天)加照射(第6天)，Ad_mda7 (第5天)加照射(第6天)或照射(第6天)加Ad-mda7 (第7天)。图56. TUNEL的免疫组化分析。用TUNEL染色测定处理后(第8天)肿瘤中的凋亡，在光学显微镜下计数凋亡细胞(X 400倍)，凋亡指数计为至少1000个癌细胞中的凋亡百分数。图57.通过免疫组化阳性染色分析VEGF，bFGF和IL-8蛋白质表达。第14天收获皮下肿瘤。在光学显微镜下计数阳性染色细胞(X 400倍)，阳性百分数计为至少1000个癌细胞中的阳性细胞百分数(A，B, C)。图58.通过计数⑶31阳性血管结构测定微管密度。图59. HUVECS的克隆存活。生长因子饥饿12小时后，使HUVECS暴露于MDA7蛋白质(10ng/ml) (A),血管抑素(100ng/ml ;B),或内皮抑素(100ng/ml ;C)12小时。然后将细胞照射(0-6 Gy)、收获并置于常规培养基中。14天后将克隆染色并测定存活组分。数据显示为三次独立试验的平均值土标准差。图60. A549细胞(A)和(XD16细胞⑶的克隆存活。细胞血清饥饿12小时，以含有mda7蛋白质(10ng/ml)的条件培养基处理。12小时后，将细胞照射(0_6Gy)、收获并置
于常规培养基中。孵育14天后，计数克隆并存活。图61.靶向性质粒构建物，包括全长，细胞质，核和内质网(ER)部分。图62. MDA-7的ER靶向部分可阻抑克隆形成。图63. MDA-7的ER靶向部分是促凋亡部分。图64. Ad-mda7引起卵巢癌细胞系生长抑制。 图65. Ad-mda7处理的卵巢癌细胞的细胞周期分析。A =MDAH 2774 ；B =OVCA 420.图66. Ad-mda7诱导卵巢癌细胞凋亡。图67. MDA-7/IL-24抑制肿瘤细胞迁移。以Ad-Iuc或Ad_mda7处理肺肿瘤细胞(A549和H1299)。转染后6h收获细胞并接种于穿刺孔单元的上室中。A :48小时后，固定膜并以结晶紫染色，在明视野显微镜下(上图；X200倍)计数已迁移到孔下层的细胞数。以Ad-mda7处理的细胞的迁移能力显著(P = O. 002)低于PBS或Ad-Iuc处理的细胞(下层)。B :处理后24小时和48小时细胞活力分析未显示肿瘤细胞增殖受到显著抑制。竖条代表标准差。图68. MDA-7/IL-24 抑制肿瘤细胞侵袭。以 PBS, Ad-luc (2500vp/ 细胞)，或Ad-mda7 (2500vp/细胞)或10 μ M LY 294002或I μ g/ml MMP-II抑制剂处理肺肿瘤细胞(H1299和A549)。6h后，收获细胞，计数，并加入到基质胶包被的孔的上层。37°C孵育细胞使其侵袭。48h后，固定细胞并以结晶紫染色。在光学显微镜下放大200倍观察和计数迁移到孔下层的细胞。以盲法计数每种处理的侵袭细胞数，记录为三次独立试验的平均值。以Ad-mda7处理的细胞显示出比PBS或Ad-Iuc处理的细胞侵袭要差(P = O. 001)。MDA-7介导的抑制作用与以LY 294002和MMP-II抑制剂观察到的抑制作用相似。竖条代表标准差。图69. MDA-7/IL-24 抑制肺转移。活体外以 PBS，Ad_luc，和 Ad_mda7 处理 A549 肺肿瘤细胞。6h后，收获细胞，洗涤，重悬于PBS，通过尾静脉注射入雌裸鼠。每组5只动物。肿瘤细胞注射后3周，吸入CO2窒息处死动物，在解剖显微镜下计数肺肿瘤节结。观察到注射用Ad-mda7处理的肿瘤细胞的动物肺肿瘤显著(P = O. 01)少于注射用PBS或Ad-Iuc处理的肿瘤细胞的动物。结果是两次独立试验的平均值。竖条代表标准差。图70. MDA-7/IL-24抑制肺转移。将荷有实验性A549肺转移瘤变的小鼠不处理(对照)或以DOTAP Chol. CAT，或DOTAP :Chol_mda7复合物处理。通过尾静脉注射每天处理动物共6次剂量。最后一次处理3周后，处死动物，计数肺肿瘤数目。以DOTAP Chol-mda7复合物处理的动物与未处理或以DOTAP =Chol-CAT复合物处理的动物相比，显示肺转移受到显著抑制(P = O. 001)。竖条代表标准差。图71A-C. DOTAP Cho I-mda-7复合物抑制皮下肿瘤生长。将荷有皮下肿瘤(A549orUV223m)的裸鼠和C3H小鼠分组，每天(50 μ g/剂)如下处理共6次不处理，PBS, DOTAP Chol-LacZ 复合物或 DOTAP =Chol-CAT 复合物，和 DOTAP Chol-mda-7 复合物。A，A549。B,UV2237m。各时间点代表每组的平均肿瘤体积。竖条代表标准差。C.处理后48小时收获皮下肿瘤，分析MDA-7蛋白质表达。在以DOTAP Cho I-mda-7复合物处理的肿瘤中，18%的A549肿瘤细胞和13%的UV2237m肿瘤细胞产生了 MDA-7蛋白质，而对照肿瘤不产生MDA-7蛋白质。图72.以D0TAP:Chol-mda-7复合物处理后MDA-7诱导细胞凋亡。收获未经处理或经PBS，D0TAP :ChoI-LacZ 或DOTAP :ChoI-CAT 复合物或DOTAP Chol-mda-7 复合物处理的动物的皮下肿瘤(A549和UV2237m)，通过TUNEL染色分析凋亡细胞。以DOTAP Cho I-mda-7复合物处理的肿瘤中发生凋亡而死亡的细胞百分数(A549为13%，UV2237m为9% )显著(P = O. 001)高于其它处理组。竖条代表标准差。图73. DOTAP Cho I-mda-7复合物抑制肿瘤血管化。未经处理或经PBS，DOTAP Chol-LacZ或DOTAP =Chol-CAT复合物或DOTAP Chol-mda-7复合物处理的皮下肿瘤(A549和UV2237m)做⑶31染色并进行半定量分析。在DOTAP Chol-mda7处理的肿瘤中，⑶31染色阳性的内皮细胞显著低于(P = 0.01)其它处理组的肿瘤。竖条代表标准差。图74. DOTAP Cho I-mda-7复合物抑制实验性肺转移。以每天剂量(50 μ g/剂)的PBS，DOTAP =Chol-CAT复合物或DOTAP Chol-mda-7复合物处理荷有肺肿瘤(A549， UV2237m)的nu/nu或C3H小鼠共6次。与两个对照组比较，以DOTAP Cho I-mda-7复合物处理的裸鼠和C3H小鼠中的转移性肿瘤生长受到了显著(P=<0.05)抑制。竖条代表标准差。说明性实施方式描述A. MDA-7本发明的组合物和方法利用MDA-7多肽和编码这些多肽的核酸。MDA-7多肽是另一类推断的肿瘤抑制因子，已经证明可抑制P53野生型、p53缺失型及p53突变型癌细胞的生长。另外，P53缺失型细胞内凋亡相关B基因的表达上调说明MDA-7能够以不依赖p53的机制诱导肿瘤细胞的损伤。申请人观察到腺病毒介导的MDA-7的过量表达可导致双链RNA活化的丝氨酸/苏氨酸激酶(PKR)快速诱导和活化，从而使eIF-2 α以及其他PKR靶底物磷酸化，诱导凋亡。肺癌细胞中2-氨基嘌呤(2-ΑΡ)对PKR的特异性抑制消除了 Ad-mda7导致的PKR活化，PKR靶底物的磷酸化和凋亡。如PKR缺失型成纤维细胞所显示，Ad-mda7诱导的凋亡依赖功能性PKR通路。这些特征说明MDA-7作为PKR的诱导剂，具有广泛的治疗、预后及诊断潜能，因此可作为诱导的免疫应答反应的增强剂。PKR具有抗病毒和抗细胞功能，可参与某些生理过程的调节，如细胞的生长和分化(美国专利 No. 6, 326,466 ；Feng 等，1992 ；Petryshyn 等，1988 ；Petryshyn 等，1984 ；Judware等，1991)、肿瘤抑制(Koromilas等，1992 ；Meurs等，1993)以及信号转导通路的调节(Kumar 等，1994)。PKR的上调可诱导各种肿瘤细胞系的凋亡。而且，在脊髓发育不良中，染色体5q上IRF-I基因的关键性致癌性缺失看来与PKR水平的降低有关(Beretta等，1996)，肺癌和结直肠癌的免疫组化分析表明与PKR的表达和生存期的延长有关(Haines等，1992)。PKR看来通过激活多种信号转导通路而介导抗肿瘤形成活性，从而达到抑制生长和诱导凋亡的作用。这些通路的活化发生在潜伏的无活性同质二聚体形式受活化信号诱导发生结构改变导致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等，2001)。PKR—旦活化后就能使各种靶底物磷酸化，这对生长调控和凋亡诱导很重要(Saelens等，2001 ;Sudhakar等，2000)。免疫系统的刺激与凋亡有关(Albert 等，1998 ；Chen 等，2001 ；Saif-Muthama 等，2000 ；Restifo 等，2001)。另外，人工诱导的凋亡已证明可增强疫苗的免疫原性，这是因为凋亡细胞的转染活化了树突状细胞的刺激效应(Sasaki等，2001 ；Chattergoon等，2000)。已在人PMBC中鉴定到Mda-7mRNA (Ekmekcioglu等，2001)，据报道人MDA-7无细胞因子功能。根据其基因和蛋白序列的特征，MDA-7已被命名为IL-24(NCBI数据库登录号XM 001405)。鼠MDA-7蛋白同源物FISP(IL-4-诱导的分泌蛋白)已报道为Th2特异性的细胞因子(Schaefer等，2001)。如敲除试验所证实，TCR和IL-4受体结合及随后的PKC和STAT6的活化可诱导FISP的转录。FISP的表达特点已证实，但没有发现这个推断出的细胞因子有何功能。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)与mda_7基因有78%的同源性，已证实与伤口愈合有关(Soo等，1999 ;Zhang等，2000)。Mob_5也是一种分泌蛋白，在大鼠转化细胞鉴定到其推定的细胞表面受体(Zhang等，2000)。因此，mda_7基因和MDA-7分泌蛋白的同源物可在各种动物中表达和分泌。但是，没有数据显示MDA-7具有细胞因子活性。这种活性可通过增强抗原的免疫原性用于治疗各种疾病和感染。Mda-7 cDNA(SEQID NO :1)编码一种新型的、进化保守的、含206个氨基酸的蛋白 质(SEQ ID NO :2)，预测分子量为23.8kDa。据推测氨基酸序列含有一个疏水性骨架，位置约为氨基酸26到45，具有信号序列的特征。除了含42个氨基酸残基的片段与白细胞介素IO(IL-IO)有54%的相同性外，该蛋白质的序列与已知的蛋白无显著同源性。结构分析表明MDA-7 (IL-BKW或IL-20)具有细胞因子家族的结构特征(W0 98/28425，本文已引入作为参考)。其结构特征和一小段氨基酸片段的有限相同性表明MDA-7可能具有细胞外功能。MDA-7的表达与黑素瘤的恶性程度呈负相关关系，试验证明与原发和转移性黑素瘤相比，正常黑色素细胞内mRNA表达水平升高，而裸鼠内增强肿瘤形成的处于垂直生长早期的黑素瘤细胞内mda-7mRNA的表达水平下降。其他有关MDA-7的信息和数据见专利申请09/615，154，10/017，472，60/404，932，60/370，335，60/361，755 和美国非临时专利申请于 2003 年 3月 3 日提交的，以 Sunil Chada,Abujiang Pataer,Abner Mhashilkar,Rajagopal Ramesh,Jack RothjPSteve Swisher为发明人的“包括MDA-7的增强免疫诱导的方法”，所有这些申请本文已引入作为参考。其他研究证明MDA-7表达的升高可在体外抑制肿瘤细胞的生长，并选择性地诱导人乳腺癌细胞的凋亡和抑制裸鼠体内肿瘤的生长(Jiang等，1996和Su等，1998)。Jiang等(1996)报道发现mda-7在各种起源的肿瘤细胞内都是一种强力生长抑制基因，包括乳腺、中枢神经系统、宫颈、结肠、前列腺和结缔组织的肿瘤。用克隆抑制试验证明MDA-7表达升高可增强对人宫颈癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、结肠癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(H0NE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑素瘤(HO-1和C8161)、成胶质细胞瘤多形体(glioblastome multiforme) (GBM-18 和 T98G)以及骨肉瘤(Saos-2)生长的抑制。Mda-7在正常细胞(HMECs、HBL-100和CREF_Trans6)内的过量表达显示出有限的生长抑制作用，这说明mda-7转基因的作用在正常细胞内不明显。综上所述，这些数据说明MDA-7表达升高所产生的生长抑制作用在体外对肿瘤细胞的作用高于对正常细胞的作用。Su等(1998)报道了对MDA-7抑制癌细胞生长机制的研究。研究报告通过细胞周期分析和TUNEL试验表明MDA-7在乳腺癌细胞系MCF-7和T47D内的异位表达诱导了凋亡，但对正常HBL-100细胞无影响。感染腺病毒mda-7 (“Adnda-7”)的细胞裂解物的Western印迹分析表明凋亡刺激蛋白BAX的表达上调。Ad-mda-7感染上调BAX蛋白的表达只发生在MCF-7和T47D细胞内，而不发生在正常的HBL-100或HMEC细胞内。这些数据使研究人员得以评价Ad-mda-7活体外转导对MCF-7肿瘤细胞异种移植肿瘤形成的作用。活体外转导可抑制肿瘤异种移植模型中肿瘤的形成和发展。利用基因治疗方法治疗癌症的主要模式是诱导凋亡。这可以通过使癌细胞对其他药物敏感或通过刺激细胞内通路直接诱导凋亡来实现。其他癌症治疗方法利用了肿瘤需要新生血管形成以供应其生长所必要的营养素。内皮抑制素和新生血管抑制素就是这种治疗方法的例子(W0 00/05356 和 WO 00/26368)。申请人:发现了一种抑制新生血管形成的方法。这种新的方法包括给予编码人mda-7的核酸。当体外添加于增殖的内皮细胞时,Ad_mda7具有抑制内皮分化的能力。mda-7表达提高的抗-新生血管形成作用使该分子成为新生血管形成相关疾病尤其是癌症的理想基因治疗方法。考虑可通过病毒或非病毒载体给予包括内皮细胞的抗-新生血管形成靶 标细胞编码mda-7的核酸，也可给予肿瘤细胞。这种联合治疗使临床医生不但可依靠肿瘤细胞的直接转导而且可依靠抑制新生血管形成的作用。因此，通过利用两种不同的向不同靶细胞群输送药物的疗法来饥饿和攻击肿瘤。新生血管形成相关疾病包括，但不限于，新生血管形成依赖性癌症，包括例如，实体瘤,血源性肿瘤例如白血病，以及肿瘤转移；良性肿瘤,例如血管瘤，听神经瘤,神经纤维瘤,沙眼，以及脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管原性疾病,例如,糖尿病视网膜病变，早熟性视网膜病，黄斑变性，角膜移植排异，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生，虹膜发红Asler-Webber综合征；心肌新生血管形成；斑块新生新生血管形成；毛细管扩张症；血友病关节；血管纤维瘤；以及创伤性肉芽肿。本发明的内皮细胞增殖抑制方法可用于内皮细胞过分或异常刺激疾病的治疗。这些疾病包括，但不限于，肠粘连，动脉粥样硬化.硬皮病，以及肥厚性瘢痕，即瘢痕瘤.它们还可用于治疗以新生血管形成为病理结果的疾病，例如猫抓伤疾病(Rochele minalia quintosa)和溃瘍(Helobacter pylori)。本发明的方法可用于治疗内皮细胞相关疾病和病症。尤其重要的内皮细胞过程是新生血管形成，即上述的血管形成。利用本发明所述的方法通过提高MDA-7的表达抑制内皮细胞增殖可治疗新生血管形成相关疾病。虽然不受这些构建物可操作性的专门理论束缚，但各种动物间mda-7和IL-IO的位于C末端涉及与受体结合的D-螺旋区有显著的氨基酸同源性。因此，尤其优选含有该30-35位的氨基酸区域的分子。因此，在本发明的一个实施方式中，新生血管形成相关疾病的治疗包括给予治疗性肽或多肽。在其他实施方式中，治疗包括给予靶细胞包括患病细胞或内皮细胞编码mda-7的核酸表达构建物。认为这些靶细胞摄吸该构建物，并表达核酸编码的治疗性多肽，因此抑制靶细胞的分化。表达MDA-7的细胞进而可分泌该蛋白与未被表达构建物转导或感染的相邻细胞相互反应。通过这种方式，抑制了肿瘤建立新脉管系统所需的复杂的相互作用并实现了肿瘤的治疗。在本发明的其他实施方式中，认为可用MDA-7或表达MDA-7的构建物治疗新生血管形成相关疾病。本发明预期可治疗的一些新生血管形成相关疾病是牛皮癣、类风湿性关节炎(RA)、炎性大肠病(IBD)、骨关节炎和肺肿瘤前病变。在其他实施方式中，很多种癌症的治疗都在本发明的范围内。例如，黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、成视网膜细胞瘤、星状细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈、舌、白血病、成神经细胞瘤、头、颈、乳房、胰腺、前列腺、肾、骨、睾丸、卵巢、间皮瘤、颈部、肠胃道、淋巴瘤、脑、结肠或膀胱癌。在更优选的实施方式中，所述新生血管形成相关疾病是类风湿性关节炎、炎性大肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、ademonas、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、肿瘤前病变、原位癌、口腔毛状白斑或牛皮癣可能是治疗的对象。在本发明的某些实施方式中，mda-7是作为表达MDA-7多肽的核酸来提供的。在某些具体实施方式
中，所述核酸是病毒载体，其中病毒载体的剂量至少为103，IO4, IO5, IO6,IO7, IO8, IO9, IO10, IO11, IO12, IO13, IO14, IO15或更高的Pfu或病毒颗粒。在某些实施方式中，病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。最优选的病毒载体是腺病毒载体。在其他特殊的实施方式中，所述核酸是非病毒载体。 在某些实施方式中，表达所述多肽的核酸可操作性连接于启动子。适于本发明的启动子的非限定性例子包括 CMVIE、dectin-1、dectin_2、人 CDllc、F4/80、SM22 和 MHC II类分子的启动子，但是据信任何可用于驱动mda-7基因或本发明的免疫基因表达的其它启动子，如本文所所述的那些启动子，都可用于实施本发明。本发明的核酸优选通过注射给药。其他的实施方式包括通过多次注射给予核酸。在某些实施方式中，注射可在患病或肿瘤的局部、区域或远离部位。在某些实施方式中，核酸的注射是通过连续灌注、瘤内注射、腹腔注射或静脉注射。在其他的实施方式中，核酸是在切除肿瘤前、或切除肿瘤后，或者切除肿瘤前后都注射到瘤床部位。另外，核酸可在化疗、生物治疗、免疫治疗、手术或放疗前、期间或之后给予患者。患者优选人。在其他的实施方式中，患者是癌症患者。B.核酸，载体和调节信号本发明涉及mda-7基因相关的多聚核苷酸或核酸分子及该基因的产物MDA-7。另夕卜，本发明还涉及与免疫原性分子相关的多聚核苷酸或核酸分子。这些多聚核苷酸或核酸分子可以从哺乳动物细胞分离并纯化。认为分离和纯化的MDA-7核酸分子，不论是分泌性或是全长的，都是与mda-7基因产物相关的核酸分子，可以是RNA或DNA的形式。同样，与免疫原性分子相关的核酸分子也可以是RNA或DNA形式。本文所用的术语“RNA转录物”指DNA核酸分子转录的产物-RNA分子。这种转录物可编码一种或多种多肽。如本申请书所用，术语“多聚核苷酸”指核酸分子、RNA或DNA，可从总基因组核酸中分离。因此，“编码MDA-7的多聚核苷酸”指含MDA-7编码序列的核酸片段，也可以从基因组总DNA和蛋白质分离或纯化。当本申请书提到MDA-7编码多聚核苷酸或核酸的功能或活性时，意味着该多聚核苷酸编码能增强免疫应答的分子。另外，“编码免疫原的多聚核苷酸”指含免疫原编码序列的核酸片段，也可以从基因组总DNA和蛋白质分离或纯化。当本申请书提到编码免疫原的免疫基因的功能或活性时，意味着该多聚核苷酸编码能诱导人体免疫应答的免疫原性分子。术语“cDNA”指以RNA为模板制备的DNA。与基因组DNA或RNA转录物相比，利用cDNA的优势在于其稳定性和能够用重组DNA技术操纵序列(见Sambrook, 1989 ；Ausubel,1996)。得到全部或部分基因组序列的一些时，需要时间。或者，cDNA具有优点是因为它提供了某多肽的编码区，并剔除了内含子和其他调节序列。
另外认为某给定细胞的给定MDA-7编码核酸或mda-7基因可由核酸序列略有差异但仍能编码MDA-7多肽的天然突变体或突变株提供；人的MDA-7多肽是特殊的实施方式。因此，本发明也包括具有细微氨基酸改变但活性相同的MDA-7衍生物。术语“基因”简单地说指功能性蛋白质、多肽或肽的编码核酸单元。正如本领域技术人员所理解的，此功能术语包括能表达或适于表达蛋白质、多肽、功能域、肽、融合蛋白以及突变体的基因组序列、cDNA序列和较小的基因工程基因片段。编码MDA-7或其他治疗性多肽如免疫原的核酸分子含有下列长度，或含有至少下列长度的连续核酸序列5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、11I、112、113、114、115、116、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、16 3、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000或更多个核苷酸、核苷或碱基对。这些序列可与SEQ ID NO I (MDA-7编码序列)相同或互补。“与其他编码序列有实质区别的”指感兴趣基因为核酸片段的部分编码序列，这个片段不含有天然编码核酸的大部分，如大的染色体片段或其他功能基因或cDNA编码区。当然，这是指天然分离的核酸片段，不包括后来人工添加到片段上的基因或编码区。在具体实施方式
中，本发明涉及插入编码MDA-7蛋白、多肽或肽的DNA序列的分离的DNA片段和重组载体，这些MDA-7蛋白、多肽或肽的氨基酸序列中含有与上述SEQ ID NO:2 一致的连续氨基酸序列，与MDA-7相应的序列命名为“人MDA-7”或“MDA-7多肽”。术语“与上述SEQ ID NO 2基本一致的序列”指与SEQ ID NO 2的一部分基本对应的序列，只有相当少的氨基酸是与SEQ ID NO :2的氨基酸不相同，但其生物功能是等价的。
术语“生物功能等价”是本领域所熟知的，在本文中还有更详细的定义。因此，如果一个序列的氨基酸有约70%、约71 %、约72%、约73%、约74%、约75%、约76%、约77%、约 78%、约 79%、约 80%、约 81%、约 82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87%、约88%、约 89%、约 90%、约 91 %、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%或者约99 %，以及它们之间的任何范围，如约70 %到约80 %、优选约81 %到约90 %;或者更优选约91%到约99%与SEQ ID NO 2的氨基酸相同或功能等价，则该序列是“与上述SEQID NO :2基本一致”，只要保留了该蛋白的生物活性。在具体实施方式
中，MDA-7蛋白、多肽或肽或生物功能等价物的生物活性包括增强免疫应答。此外，在具体实施方式
中，蛋白质、多肽或肽或者生物功能等价物的免疫原、免疫原性分子的生物活性包括免疫原性，这是指该分子能诱导人体的免疫应答。在其他某些实施方式中，本发明涉及分离的DNA片段和重组载体，这些片段和载体的序列内含有与上述SEQ ID NO :1基本一致的序列。术语“与上述SEQ ID NO :1基本一致”与如上所述的含义相同，指该核酸序列与SEQ ID NO :I的一部
分基本对应，只有相当少的密码子与SEQ ID NO :1的密码子不同，但功能是等价的。而且，编码具有MDA-7活性的蛋白、多肽或肽的DNA片段是最常用的。在具体实施方式
中，本发明涉及插入有编码MDA-7多肽或肽的DNA序列的分离的核酸片段和重组载体，这些多肽或肽的氨基酸序列中含有与MDA-7多肽基本上对应的连续氨基酸序列。在其他的实施方式中，本发明涉及插入有编码免疫原、蛋白、多肽或肽的DNA序列的分离的核酸片段和重组载体，这些免疫原、蛋白、多肽或肽的氨基酸序列中含有与该免疫原基本上相对应的连续氨基酸序列。设计本发明的载体主要用于转化细胞使其含有在调控性真核细胞启动子(即可诱导性、可阻抑性、组织特异性启动子)控制下的mda-7基因。另外，如果无其他原因，为了便于载体的体外操作，该载体内可含有选择性标记。而此选择性标记在产生重组细胞时可能发挥重要作用。表I和2，见下，列出了可用于本发明的各种调节信号。表I-可诱导元件
权利要求
1.分离的或纯化的具有SEQID NO 2所示序列的MDA-7蛋白或编码具有SEQID NO 2所示序列的MDA-7蛋白的核酸表达构建物在制备药物中的应用，所述药物用于放射致敏对象体内的癌细胞，其中所述核酸在细胞内可操作的启动子的控制下。
2.如权利要求I所述的应用，其中所述癌细胞是上皮癌细胞。
3.如权利要求I所述的应用，其中所述编码MDA-7蛋白的核酸表达构建物被包含在病毒载体中。
4.如权利要求3所述的应用，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
5.如权利要求I所述的应用，其中所述MDA-7蛋白被纯化成至少95%均一性。
6.如权利要求I所述的应用,其中所述MDA-7蛋白还包含内质网靶向序列。
7.如权利要求I所述的应用，其中，在给予所述MDA-7蛋白或表达构建物后72小时内对所述癌细胞进行辐射处理。
全文摘要
本发明涉及含MDA-7的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及治疗癌症和其它新生血管形成相关疾病(抗新生血管形成疗法)的诊断、预后和治疗性组合物和方法。本发明还涉及MDA-7的纯化方法。
文档编号C12N15/24GK102836420SQ201210102438
公开日2012年12月26日 申请日期2004年3月2日 优先权日2003年3月3日
发明者S·查达, J·B·穆姆, R·拉梅西, A·马西尔卡, R·E·梅恩, E·格林姆 申请人:得克萨斯州大学系统董事会, P53股份有限公司