专利名称：用于研究microRNA与靶基因5’非编码区相互作用的载体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医学分子生物学领域，可用于不同类型HIiCT0RNA与靶基因5'非编码区相互作用的研究。
背景技术：
MicroRNA (mi RNA)是一类内生的、长度约20_24个核苷酸的小RNA，其前体结构是具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA，在细胞质中经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用^3]。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也 可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达随着miRNA调控基因表达研究的逐步深入，将帮助我彳丨3理解闻等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。传统观念认为，miRNAs主要通过其“种子序列”，特异性地结合到靶标mRNA的3'非翻译区(3' UTR)抑制基因的翻译或者导致mRNA的降解。但是，在2005年，斯坦福大学医学院的研究人员发现了肝脏特有的miR-122与肝炎病毒mRNA 5' UTR相互作用引起病毒增殖，这项研究首次发现在动物细胞中，miRNA可以和5' UTR相互作用[4]。同年，IBM科学家建立了一个数学模型，“预言miRNAs标靶超越了 3' UTR的局限，是大范围存在的”。目前，市场已有专门用来检测miRNA与靶基因的结合活性，但主要集中在对3' UTR研究的报告基因载体系统，如pmiR-RB-Report 报告基因检测系统。该报告系统包含SV40启动子驱动的报告荧光基因(hluc)，其下游构建了靶基因3' UTR，通过对该荧光的监测，即可验证miRNA对该靶标是否有调控作用；另有一校正荧光基因(hRluc)用于监测转染效率，靶标表达效率，可作为稳定内参&9]。本发明主要以抑癌基因p53为例，将p53mRNA的5' UTR序列克隆在荧光报告基因或绿色荧光蛋白(GFP)的上游，并在p53两侧添加I个酶切位点，便于将p535' UTR替换，研究其它的基因的非编码区与miRNA的作用。
发明内容
本发明提供研究miRNA与靶基因5' UTR相互作用的分析系统。即可使用双荧光报告基因分析系统，酶切替换后也可使用绿色荧光蛋白的分析系统作为内参对照。本发明采用含有双荧光素酶报告基因(荧光素酶hluc及海肾荧光素酶hRluc)的质粒pLuc，经过酶切、纯化、重叠PCR扩增、连接、转化，将p53-5' UTR序列克隆到pLuc质粒hluc区域ORF的上游，并在p53-5' UTR的PCR引物两侧设计两个酶切位点，将其质粒命名为pLuc-p53-5' UTR。同时，为了适应不同的需要，PCR扩增绿色荧光蛋白序列，双酶切pLuc-p53-5' UTR质粒的Rluc区，将绿色荧光蛋白序列替换Rluc区域，将其质粒命名pGFP-p53-5' UTR，该质粒载体进行细胞活体研究。同时，采取同样的方式，我们还可以得到pYFP-p53-5/ UTR或者pCFP-p53-5' UTR的报告基因分析系统，扩大了研究的范围。本发明主要涉及miRNA靶标的研究。设计围绕研究miRNA与靶基因的5' UTR相互作用。因为P53-5' UTR区两侧有酶切位点，可以进行酶切替换，增加miRNA靶标研究的广泛性及灵活性。附图表说明
图1PLUC-P53-5' UTR质粒图谱构建示意2p53-5' UTR的PCR扩增结果图Mr IOObp DNA ladderI.无模板的阴性对照2. p53-5' UTR 的 PCR 产物图3pLuc质粒上HindIII和SpeI之间的序列PCR扩增结果图Mr IOObp DNA ladderI. pLuc质粒上HindIII和SpeI之间的序列的PCR产物2.无模板的阴性对照图4重叠PCR扩增结果图Mr IOObp DNA ladderI.无模板的阴性对照2.重叠PCR的PCR产物
具体实施例方式本发明所述，包括酶切、回收、PCR扩增、连接、转化、测序等几个步骤。以下通过实施例来进一步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式
，而不是以任何方式限定本申请的范围。实施例1PLUC-P53-5' UTR 的构建步骤一、SpeI酶切pLuc质粒酶切反应体系，如下
NE Buffer 4 (IOx) 5^iL BSA(IOOx)0.5nL
pLuc 质粒2\ig
Spel 酶IHL
总体积(双蒸水补足)50pL37°C孵育3小时，65°C孵育20分钟灭活该酶活性。酶切完毕后，酶切纯化试剂盒回收酶切片段，具体步骤，如下I.取50 ii L酶切反应液的体积，向其中加入100 u L Buffer DPX。2.将上一步所得溶液加入一个GBC吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2分钟，12，OOOrpm( 13，400 Xg)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将GBC吸附柱放入收集管中。
3.向 GBC 吸附柱中加入 680 ii L DNAffash Buffer，12，OOOrpm( 13，400 X g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将GBC吸附柱放入收集管中。4.向 GBC 吸附柱中加入 680 u L DNA Wash Buffer, 12，OOOrpm( 13，400 Xg)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。5.将GBC吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm( 13，400Xg)离心I分钟，尽量除去
洗涤液。6.将GBC吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50 U L去离子水，室温放置2分钟。12，OOOrpm( 13, 400Xg)离心I分钟收集DNA溶液。步骤二、HindIII不完全酶切
因为在质粒载体中有两个HindIII的酶切位点，因此此步骤采取不完全酶切体
系，如下
NE Buffer 4 (IOx)5^L
BSA(IOOx)0.5nL
pLuc 质粒2\ig
Hindlll 酶0.5nL 总体积(双蒸水补足)50pL37°C孵育I小时，65°C孵育20分钟灭活该酶活性。酶切完毕后，酶切纯化试剂盒回收酶切片段，具体步骤，同上。步骤三、PCR扩增片段①，即p53_5' UTR具体步骤，如下
PCR Buffer(IOx)5^L
dNTP (25mM)2\iL
SiHa 细胞 cDNAl|ug
上游引物(20^M)0.5吣
下游引物(20^M)0.5pL
pfu 酶0.5(_iL 总体积(双蒸水补足)50pL反应循环条件设置
权利要求
1.microRNA与多种靶基因的5'非编码区(5'UTR)作用的载体设计。
2.可以使用荧光素酶检测系统。
3.可以采用绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等检测系统。
全文摘要
本发明设计microRNA与靶基因的5′非编码区(5′UTR)作用的载体及其用途，属于医学分子生物学领域，可用于不同类型microRNA与靶基因5′非编码区相互作用的研究。该载体构建，主要通过不完全酶切、重叠PCR等分子生物学手段，将p53mRNA的5′UTR序列克隆在荧光报告基因的上游，并在其两侧添加1个酶切位点，便于将p535′UTR替换，研究其它基因的5′非编码区与microRNA的相互作用。5′UTR研究载体设计既可以使用荧光素酶检测系统，也可以采用绿色荧光蛋白的检测系统，从而增加研究microRNA与靶基因相互作用的灵活性。
文档编号C12N15/66GK102676565SQ20121010233
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者孔璐, 张玉祥 申请人:首都医科大学