专利名称：利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法。
背景技术：
丁二酸(succinic acid)又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4_ 丁二醇、四氢呋喃、Y-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来 12种最有价值的生物炼制产品之一。 丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源(葡萄糖、木糖等)，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillumsucciniciproducens'ActinobaciIlus succinogenes^Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组疋COli0利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。E. coli由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。E. coli野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，因此可以敲除或失活其中的乳酸脱氢酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性以减少副产物的生成。但是，由于敲除了 PFL基因，导致菌株不能生产乙酸，从而使伴随乙酸生成的ATP减少，最终导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长，并且生产丁二酸。玉米芯是农业生产中比较常见的废弃物，由于其成分含有大量纤维素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此大肠杆菌NZNlll不能利用玉米芯水解液发酵生产丁二酸。姜岷等将玉米芯按料液比I : 5 (质量体积比)配制玉米芯料液，物料粒径250 380 u m, H2SO4用量3% (体积分数)，水解温度126°C，反应时间215 h，利用活性炭吸附及Ca (OH) 2中和等方式，对玉米芯多组分糖液进行脱毒脱盐处理，总糖质量浓度为50 g/L，其中木糖占80%以上。稻草秸杆是重要的一类可再生生物质资源。目前，除了在造纸业工业方面的利用，绝大多数被废弃，严重浪费了资源并且污染了环境。其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此不能利用木糖的大肠杆菌菌株不能利用稻草秸杆水解液发酵生产丁二酸，陶文沂等通过稀硫酸121°C处理稻草秸杆I h，再用20 g/L的NaOH于121°C处理秸杆Ih，葡萄糖和木糖二者总质量浓度都达50 g/L左右。甘蔗渣是甘蔗制糖时榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此不能利用木糖的大肠杆菌菌株不能利用稻草秸杆水解液发酵生产丁二酸，约含有50%的纤维素通过粉碎以及碱/氧化法预处理可得到总糖质量为50 g/L，其中木糖占80%以上。在大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此过程中没有ATP的生成,但是在subtil is中,磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达万.coli /7/7C和/7^,研究发现过量表达/7/7C可以使琥拍酸作为混合酸发酵的主要产物，且产量较出发菌株提高3. 5倍，而过量表达/74对发酵结果没有影响，但在/7/7C缺陷菌株中，的过量表达能够提高琥珀 酸的产量。
发明内容
本发明的技术目的在于提供了一种基于ATP生物合成系统改造后的大肠杆菌菌株的构建方法，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低了生产成本，提高经济效益。为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案。利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤
(1)以缺乏乳酸脱氢酶基因(A/M)，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的A.cWiNZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA,pfIB和PPC的感受态菌株；
(2)单独纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(/7^)基因，或者纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，以及选择自苹果酸酶Cs/d)基因、苹果酸脱氢酶基因或丙酮酸羧化酶基因这三种基因中的一种，构建得到单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种的表达质粒；
(3)将步骤(2)所述的质粒导入步骤(I)得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
(4)利用步骤(3)的阳性转化子单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌。具体的，利用本发明所述的上述方法可以细分为下述几个具体方法。A、过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，得到能够高效利用木糖生长并产丁二酸的大肠杆菌coli BA204
以缺乏乳酸脱氢酶基因(7過乂)，丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的万.coli NZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA'pflB和PPC的感受态菌株；
合成一对5’端带有酶切位点的引物，以Bacillus subti I is基因组DNA为模板，纯化扩增出的Pd基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-/ cA ； 将质粒pTrc99a-/ cA导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC)基因的NZNlll菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA204 ；
利用AscAericAia coli BA204过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。重组质粒pTrc99a-/ d的构建图谱如图3所示。B、过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶，得到能够高效利用木糖生长并产丁二酸的大肠杆菌coli BA205
以缺乏乳酸脱氢酶基因(7過乂)，丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的万.coli NZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA'pflB和PPC的感受态菌株；
合成一对5’端带有相同酶切位点的引物，以subti I is基因组DNA为模板，纯化扩增出的基因后，已构建的重组质粒pTrcgga-sfbJ用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒；
将质粒pTrcgga-sfbJ-pcA导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受态，获得的阳性转化子即为coliBA205 ；
利用AscAericAia coli BA205共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶,恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。重组质粒pTrcgga-sfbJ-pd的构建图谱如图4所示。C、过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸脱氢酶，使其能够高效利用木糖生长并产丁二酸，获得大肠杆菌AscAericAia coli BA206
以缺乏乳酸脱氢酶基因(7過乂)，丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的万.coli NZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA'pflB和PPC的感受态菌株；
合成一对5’端带有相同酶切位点的引物，以subti I is基因组DNA为模板，纯化扩增出的基因后，已构建的重组质粒pTrc99a- t*用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a- ￡*-/7c々；
将质粒pTrc99a- ￡*-/7cA导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受态，获得的阳性转化子即为coli BA206 ；利用AscAericAia coli BA206共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸脱氢酶,恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。重组质粒pTrc99a- ￡*-/ d的构建图谱如图5所示。D、过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶，使其能够高效利用木糖生长并产丁二酸，获得大肠杆菌AscAericAia coli BA207
以缺乏乳酸脱氢酶基因(7過乂)，丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的万.coli NZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA'pflB和PPC的感受态菌株；
合成一对5’端带有相同酶切位点的引物，以subti I is基因组DNA为模板，纯化扩增出的基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-/ _Fc用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-/7_Fc-/7cA ；
将质粒pTrc99a-/7_Fc-/7cA导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受态，获得的阳性转化子即为coli BA207 ；利用coli BA207共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶,恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。重组质粒pTrc99a-/7_Fc-/ d的构建图谱如图6所示。本发明的有益效果在于
首先，厌氧发酵过程中产大量诸如乙酸等对菌株有毒害作用的副产物，因此考虑两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段进行产酸发酵。也可以选择性地采用膜分离技术，达到分离菌体的目 的，再进而用于厌氧发酵。具体步骤如下采用两阶段发酵模式，划线-80°C冻存管保藏的菌液到含有氨苄青霉素的平板，挑取平板上长出的单菌落到5 ml LB培养基的试管，1% (v/v)接种量接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD6tltl至0. 8-1. 0左右时用0. 3 mM的IPTG诱导至0D_=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵。发酵结果表明，新构建的和大肠杆菌ATP生物合成途径有关的基因工程菌coli BA 204、Escherichia coli BA ^Escherichia coli BA 取 Escherichia coli BA 207 f灰复了厌氧条件下代谢木糖的能力，并高效利用木糖产丁二酸。其次，本发明通过分子生物学手段改造大肠杆菌的ATP生物合成途径，提高ATP供给，补充木糖转运和代谢过程中的能量供给，使重组大肠杆菌能够持续利用木糖生长并使其高效合成丁二酸的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。
图I线性DNA片段的电泳鉴定图。图2同源重组阳性重组子的电泳鉴定图。图3重组质粒pTrc99a-/ c々的构建图谱。图4重组质粒的构建图谱。图5重组质粒pTrc99a- ￡*-/ c々的构建图谱。图6重组质粒pTrc99a-/7j^-/7cA的构建图谱。图7 PCR产物pck的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。图8重组质粒pTrc99a-/ cA的单双酶切鉴定图。图9重组质粒pTrcgga-sfbJ-pcA的单双酶切鉴定图。图10重组质粒pTrc99a- ￡*-/ d的单双酶切鉴定图。图11重组质粒pTrc99a-/7_FC-/ d的单双酶切鉴定图。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本发明所述的安普霉素抗性基因的来源是pIJ773，获得自南京师范大学邵蔚蓝教授处。本发明所述的能够诱导表达\重组酶的质粒的来源是pKD46,购自Introvegen公司。本发明所述的能够诱导产生FLP重组酶的质粒的来源是pCP20,购自Introvegen公司。本发明所述的subtilis基因组的来源是购自中国典型培养物保藏中心。
本发明所述的表达质粒用pTrc99a的来源是购自Introvegen公司。本发明所述的出发菌株'E. coli NZNlll的感受态菌株的来源有两处
(1)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
(2)该生物材料还在中国专利(申请号96198547.X，申请日1996. 10. 31，授权曰2003年I月I日，授权公告号CN1097632C)的专利文献中公开并获得授权。本发明所述的引物的设计及合成自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。 实施例I
本实施例说明构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到菌株AscAericAia coli BA204。I、以缺乏乳酸脱氢酶基因UdhA、,丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的疋coliNZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA,pfIB和PPC的感受态菌株。利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有PPC同源片段的扩增引物，成功扩增出线性DNA同源片段； 在出发菌株NZNlll中导入能够诱导表达入重组酶的质粒，使在电转入线性DNA片段后，可以抑制菌体内部的核酸外切酶，防止线性片段的分解，同时进行同源重组，通过抗性筛选获得阳性重组子；导入能够诱导产生FLP重组酶的质粒，在诱导后，利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的NZNlll菌株。具体的方法
(I)利用LB培养基，于37°C、有氧条件下培养大肠杆菌NZNlll至OD6tltl=O. 4 0. 6，制备成电转感受态。(2)将质粒pKD46电转入感受态的大肠杆菌NZN111。电击条件为200 Q，25 U F,电击电压2. 3 kV，电击时间4 5 ms。电击后迅速将菌体加入预冷I mL的SOC培养基，150r/min、30°C培养I h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子大肠杆菌 NZNlll (pKD46)。(3)在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30°C下诱导质粒pKD46表达出入重组酶，制成电转感受态。(4)以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒PIJ773为模板，并设计两端带有PPC同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下
上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段
5’ -ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3，。下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段
5， -AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，。反应体系带同源臂的上下游引物(100 pmol/ii L)各0. 5 ii L ;模板DNA(100ng/iiL) 0.5 u L ； 10 X buffer 5 u L ；dNTPs (10 mM)各 I y L ;DMS0 (100%) 2.5 u L ；Pyrobest DNA 聚合酶(2. 5 U/ u L) I u L ；ddH20 36/35. 5 uL ;总体积 50 u L。反应条件94°C，2min ； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;10 个循环)；(94°C 45 sec ；50°C 4 5 sec ；72°C 90 sec;15 个循环)；72°C，5 min。线性DNA片段的鉴定如图2。(5)电转线性DNA片段至已诱导表达入重组酶的大肠杆菌NZNlll (pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了 PCR鉴定，电泳图如图3所
/Jn o(6)阳性重组子制成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42°C热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的菌株。2、构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，其过程包括
(I) 合成带有Sac I和Xba I酶切位点的引物，
上游引物5’ - CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’ ；
下游引物5’ - GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG -3’。(2)以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的Pd基因和表达质粒pTrc99a分别用feci和油<31双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-/ d PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如图7所示；质粒pTrc99a_/ c左的双酶切电泳鉴定如图8所示。3、将质粒pTrc99a_/7d导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受态，获得的阳性转化子即为如ricAia coliBA204。实施例2
本实施例说明构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到菌株coli BA205。I、以缺乏乳酸脱氢酶基因(7￡*乂),丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的疋coliNZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA ,pflB和PPC的感受态菌株(同实施例I)。2、构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶的表达质粒，其过程包括 (I)合成上下游都带有历'fldIII酶切位点的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’ ；
下游引物5’ - CCCAAGCTTGCAITCCGTCAATTAAAACAAG-3’。(2)以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的基因和表达质粒pTrcgga-sfbJ分别用/ZifldIII单酶切、连接获得重组质粒pTrcgga-sfbJ-pd重组质粒的单双酶切鉴定图如图9所示。
3、将质粒pTrcgga-sfbJ-pd导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受态，获得的阳性转化子即为coliBA205。实施例3
本实施例说明构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸脱氢酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到菌株coli BA206。I、以缺乏乳酸脱氢酶基因UdhA、,丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的疋coliNZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA ,pflB和PPC的感受态菌株(同实施例I)。2、构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸脱氢酶的表达质粒，其过程包括
(I)合成上下游都带有历'fldIII酶切位点的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’ ；
下游引物5’ - CCCAAGCTTGCAITCCGTCAATTAAAACAAG-3’。(2)以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的基因和表达质粒pTrc99a- t*分别用//iflt/III单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a- ￡ft-/7d重组质粒pTrc99a- ￡ft-/7c々的单双酶切鉴定图如图10所示。3、将质粒pTrc99a- ￡*-/7cA导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNl 11菌株的感受态，获得的阳性转化子即为coliBA206。实施例4
本实施例说明构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到菌株coli BA207。I、以缺乏乳酸脱氢酶基因(JdhA、,丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的疋coliNZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏IdhA ,pflB和PPC的感受态菌株(同实施例I)。2、构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶的表达质粒，其过程包括
(I)合成上下游都带有历'fldIII酶切位点的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’ ；
下游引物5’ - CCCAAGCTTGCAITCCGTCAATTAAAACAAG-3’。(2)以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的基因和表达质粒pTrc99a-/ _Fc分别用//iflt/III单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-/7j^-/ d重组质粒pTrc99a-/7j^-/ <^的单双酶切鉴定图如图11所示。3、将质粒pTrc99a-/7_7c-/7cA导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNl 11菌株的感受态，获得的阳性转化子即为coliBA207。
实施例5
本实施例说明实施例I的新构建的重组大肠杆菌BA204与出发菌株大肠杆菌NZNlll发酵产酸能力的对比。大肠杆coli BA204能够高效利用木糖发酵,并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD6tltl至0. 4 0. 6左右用0. 3 mM的IPTG诱导至0D6(I(I=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。有氧阶段培养基为LB+ Amp (氨苄青霉素50 u g/mL)。厌氧阶段培养基为LB+木糖(20 g/L) +碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50U g/mL)+0. 3 mM IPTG。发酵结果见表I。表I Escherichia coli BA204与出发菌株发酵产酸的结果比较
权利要求
1. 一种利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤 (I)以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的大肠杆菌菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同时缺乏ldhA'pflB和PPC的感受态菌株； (2)单独纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，或者纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，以及选择自苹果酸酶基因、苹果酸脱氢酶基因或丙酮酸羧化酶基因这三种基因中的一种，构建得到单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种的表达质粒； (3)将步骤(2)所述的质粒导入步骤(I)得到的感受态菌株，获得阳性转化子； (4)利用步骤(3)的阳性转化子单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法及其发酵生产丁二酸的方法。本发明通过分子生物学手段改造大肠杆菌的ATP生物合成途径，过量表达与该途径有关的酶的活性，有效的提高了大肠杆菌胞内ATP的总量，使重组大肠杆菌能够利用木糖代谢生长，大幅度提高了丁二酸的合成效率。
文档编号C12N1/21GK102618477SQ20121010220
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月10日 优先权日2011年7月18日
发明者刘嵘明, 姜岷, 梁丽亚, 陈可泉, 韦萍, 马江锋 申请人:南京工业大学